第一篇：微生物學實驗報告

微 生 物 學 實 驗 報 告（格式標準）

(生命科學專業)

教 師：黎 勇

目錄索引

實驗一 油鏡的使用和細菌的簡單染色法 3

實驗二 細菌的革氏染色與芽孢染色 5

實驗三 常用培養基的配制 7

實驗四 酵母菌霉菌的形態結構觀察及酵母死活細胞的鑒別 8

實驗

五、微生物大小的測定與顯微計數 10

實驗六 環境中微生物的檢測和分離純化 11

實驗七 細菌鑒定中常用的生理生化反應 12

實驗八（綜合實驗）化能異養微生物的分離與純化 13

課程名稱： 微生物學

實驗班級：化生系生命科學本科

實驗日期：

指導教師：黎勇 實驗一 油鏡的使用和細菌的簡單染色法

〔目的要求〕學習并熟練掌握油鏡的使用技術；觀察細菌的基本形態；學習觀察細菌的運動性的基本方法。

〔基本原理〕

1.N2A=n2sinα

2.D=λ/2N.A

3.目鏡可提高放大倍數，但有效放大率取決于鏡口率。已經分辨的物體不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。

4.用懸滴法或凹玻片法觀察細菌的運動性時，可以通過真運動能定向地由一處快速運動來區別于顆粒的布朗運動。

〔器材用具〕顯微鏡、載玻片、凹玻片、蓋玻片、接種環、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水紙、擦鏡紙；細菌、放線菌等固定裝片；培養18小時左右的B.subtilis.S.arueus菌斜面培養物；無菌水、生理鹽水。

〔方法步驟〕：

（一）油鏡的使用

鏡檢裝片在中倍（或高倍鏡）下找到目的物，并使位于視野正中

聚光鏡上升到最高位置，虹彩光圈開到最大，鏡頭轉開成八字形

在玻片的鏡檢部位（光斑處）滴一滴香柏油

油鏡轉入正下方

側視小心上升載物臺（縮短鏡頭與裝片距離，鏡頭浸入油中，至油圈不擴大為止鏡頭幾與裝片接觸）粗調器徐徐下降載物臺（密切注視視野，當捕捉到物像時，立即用細調器校正）仔細觀察并繪圖

取出裝片，清洗油鏡：擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油

擦鏡紙沾少許二甲苯擦去殘留（用手指輔助，迅速拭擦一、二次）

用清潔擦鏡紙仔細擦干二甲苯（2-3次）。

（二）細菌的簡單染色法：涂片

干燥

火焰固定

染色

水洗

干燥

油鏡觀察

（三）細菌運動性的觀察 取潔凈蓋玻片，四周涂上凡士林

滴加一小滴菌懸液

凹玻片的凹窩向下蓋于蓋玻片上

翻轉觀察

〔結果分析〕

1、畫一圓圈表示視野，選取所觀察的微生物繪圖，注意特殊結構、形狀和排列。（描繪時按視野實際大小5－10倍繪制）

菌名：大腸桿菌

菌名：金黃色葡萄球菌

放大倍數：100310（35）

放大倍數：100310（35）

特殊結構：無 特殊結構：無

視野觀察下微生物的形態

2、油鏡使用時為什么必須干燥裝片？

防止水油分層，光受到折射而影響油鏡性能的發揮

〔實驗討論〕

首次實驗中有幾個要點：一是按無菌操作取用菌；二是涂片技術的掌握；三是油鏡使用技術。凡實驗中學生的所思所想，如無菌操作技術要點、自行處理實驗材料、失敗與思考等均可進行討論（如涂片時蒸餾水不宜過多、取用菌時防止菌被灼燙變形、取菌宜少不宜多等均是可以討論的內容）。

實驗二 細菌的革氏染色與芽孢染色

〔目的要求〕觀察細菌菌落的特征；掌握簡單染色法、革蘭氏染色法的原理及操作步驟；在油鏡下觀察細菌個體形態；學習環境中微生物的檢查方法，并加深對微生物分布廣泛性的認識

〔器材用具〕E.coliB.subtilisS.aureus.的斜面培養物（18－24小時）以及菌落平板各一個；染液：草酸銨結晶紫、劃蘭氏染液、盧戈氏碘、95%的乙醇、蕃紅；無菌水、顯微鏡、載片、濾紙、液體石蠟是、、擦鏡紙、接種環。

〔方法內容〕：

（一）實驗室環境中微生物的檢查

（二）革蘭氏染色法 涂片固定

冷卻

結晶紫染色1min 水洗

碘媒染1min 95%乙醇30-60s 水洗

番紅復染2－3min

水洗

干燥

油鏡鏡檢

（三）芽孢染色 涂片固定

孔雀綠加熱染色（勿干）5min 水洗

番紅復染1min

水洗

鏡檢

〔結果分析〕實驗結果被染成紫色者即為革蘭氏陽性，被染成紅色者為革蘭氏陰性；菌體染成紅色，芽孢被染成綠色。

菌名：大腸桿菌

菌名：金黃色葡萄球菌

放大倍數：100310（35）

放大倍數：100310（35）

染色反應：紅色（陰性）染色反應：紫色（陽性）

菌名：枯草芽孢桿菌

放大倍數：100310（35）

染色反應：紫色（陽性）

圖1 視野觀察下細菌的革蘭氏染色反應

圖2 枯草芽孢桿菌芽孢形態圖

〔實驗討論〕

嚴格掌握脫色程度，是成敗的關鍵。若脫色時間過度，則陽性菌初時之紫色脫出，復染成紅色，誤成陰性，反之脫色時間不足，陰性菌在初染時的紫色未能脫出，復染時不能染成紅色，誤以為陽性菌；涂片不能厚；盧弋氏碘即用即配。

作業

1、繪出所觀察到到細菌的視野圖，并說明染色反應。

2、哪些因素會影響到革蘭氏染色結果的正確？其中是關鍵的一步是什么？ 菌齡及培養條件和染色技術是最主要的，關鍵是脫色。

3、怎樣對未知菌進行革蘭氏染色，以證明你的結果的正確？

與已知菌混合涂片比較。

實驗三 常用培養基的配制

〔目的要求〕了解培養基的配制原理；了解培養基常規配制程序；了解培養基過程各環節的要求和注意事項。了解半合成培養基的配制原理，學習掌握肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯培養基的配制方法。

〔器材用具〕等配各種培養基的組成成分，瓊脂、1N NaoH溶液 1N HCl天平或臺秤高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養皿、玻璃漏斗等。藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙報紙等。

〔方法步驟〕

(一)玻璃器皿的洗滌和包裝 以小組為單位清洗、控水，按9個為一組，分別用報紙包好并放入烘箱中等待滅菌。

(二)液體及固體培養基的配制過程

原料稱量（按配方次序）

溶解

調節ｐH 過濾澄清

分裝

塞棉塞和包札

滅菌

分別按教材配方配制牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯液體及固體培養基。

(三)培養基的分裝 用玻璃漏斗，橡皮管，小玻璃管及彈簧夾制作分裝裝置

選用153150平口試管或150mL錐形瓶貼上標簽

分裝（至試管高度1/4-1/3，斜面制作用1/5，半固體用1/3）

要求：每人制作斜面3支。其余分裝至錐形瓶中。

(四)棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎 分別制作試管及錐形瓶棉塞并塞好好以牛皮紙包裝頭部。

(五)培養基的滅菌 培養基用濕熱法滅菌；皿用干熱法分別滅菌。

(六)斜面和平板的制作（下次試驗完成）

(七)培養基的無菌檢查（下次實驗完成）

(八)無菌水的制備 同時制作無菌生理鹽水，置錐形瓶中備用。

〔結果分析〕

以斜面接種培養驗證培養基配制效果；

以平板制作及接種24小時培養驗證滅菌效果；

簡述移液管包裝的注意事項。

〔實驗討論〕

滅菌器的滅菌效果必須間隔一段時間，加以驗證，主要方法除無菌檢查外，還通過壓力試紙同時滅菌來驗證其壓力與溫度；培養基通常成批制作備用。但制作后，其貯藏時間有一定限制，一般室溫條件下不超過三周；冰箱4℃條件下可貯藏半年，過期不能用。

作業：

1、記錄培養基的成分和名稱

2、分析所配制培養基的碳源、氮源、能源及無機鹽、維生素的來源。所配制均為天然培養基，各成分主要來自有機質，微量元素可以由自來水提供。

3、什么是天然培養基？什么是半合成、合成培養基？

實驗四 酵母菌霉菌的形態結構觀察及酵母死活細胞的鑒別

〔目的要求〕觀察并掌握酵母菌霉菌的菌落特征、個體形態、生長及繁殖方式。學習酵母死活細胞的鑒別方法。

〔材料用具〕釀酒酵母、紅酵母、假絲酵母；(釀酒酵母和紅酵母菌落平板各一個。釀酒酵母豆芽汁斜面及釀酒酵母醋酸鈉斜面各一支，假絲酵母加蓋片培養的平板)；7.6%孔雀綠染液，0.5%蕃紅染液，蘇丹黑染液，二甲苯，中性紅染液，碘液；目鏡測微尺、鏡臺測微尺；載片及蓋片。

〔方法步驟〕

(一)菌落特征的觀察

(二)個體形態與出芽

(三)子囊孢子的觀察

(四)酵母死活細胞的觀察。

〔結果分析〕描述釀酒酵母霉菌的菌落形態特征；繪圖釀酒酵母的菌體、出芽方式及細胞細節；

（一）酵母的菌落濕潤，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一致，不透明，邊緣整齊；

菌名：釀酒酵母

放大倍數：100310（35）

特殊結構：芽（出芽繁殖）

（二）霉菌

菌落特征：干燥，正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。

（如右圖）

菌名：青霉（Penicillium）

菌名：毛霉（Circinella）

放大倍數：100310（35）

放大倍數：100310（35）

特殊結構：分生孢子梗（帚狀分枝）

特殊結構：孢子囊

菌名：曲霉（Aspergillus）

菌名：根霉（Rhizopus）

放大倍數：模式圖

放大倍數：100310（35）

特殊結構：足細胞 特殊結構：假根

〔實驗討論〕

作業：

1、繪圖說明所觀察到的酵母菌、霉菌的形態特征。

實驗

五、微生物大小的測定與顯微計數

〔目的要求〕學習并掌握用測微尺測定微生物細胞大小的方法；了解血細胞計數板的構造及計數原理，掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。

〔材料用具〕啤酒酵母；顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺；血球計數板；蓋玻片，載玻片，滴管，試管，無菌水，〔方法步驟〕

(一)酵母細胞大小測定

(1)目鏡測微尺的校正(2)細胞大小的測定

(二)顯微計數法

(1)鏡檢計數室

(2)菌懸液制備及加樣

(3)計數

(4)清洗計數板

〔結果分析〕結果記錄入表中。

1、目鏡測微尺的標定結果（精確到零點幾小格）物鏡倍數

（目鏡均為10倍）目鏡測微尺的格數（小格）

鏡臺測微尺的格數（小格）

目鏡測微尺的每格的長度（μm）40倍

2、酵母菌大小測定結果 菌號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 目鏡測微尺的格數（小格）長軸

短軸

酵母大小平均值＝±（保留小數點后2位）

長軸＝

3、血細胞計數板對酵母菌懸液計數結果 實驗次數 各中格中菌數 總菌數 稀釋倍數平均值

菌數(個/mL)1

短軸＝

〔實驗討論〕

作業：

1.什么更換不同放大倍數的目鏡和物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺校正。2..根據實驗體會說明血細胞計數法的誤差主要來自哪些方面？如何減少誤差？ 3..在滴加菌液時，為什么要先置蓋玻片然后滴加菌液？能否先加菌液再置蓋玻片？ 4..用血球計數板測定微生物數量時，哪些步驟易造成誤差？如何預防？計算細胞數目時此法是否可以適用？ 實驗六 環境中微生物的檢測和分離純化 〔目的要求〕

1、學習并掌握各種無菌操作技術，并用此技術進行微生物的劃線分離接種

2、學習掌握平板菌落計數法 〔基本原理〕

土壤是微生物生活的大本營，是生物多樣性的重要場所，也是發揚微生物資源的重要基地，可以從中分離純化得到許多的菌株。劃線法是常用的分離與純化方法，通過無菌操作條件下，“漸劃漸稀”的效應而得到菌落純的菌株。

平板菌落計數法是將待測樣品經過適當稀釋，使其中的微生物充分分散形成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品含菌量。這種方法為活菌計數法，廣泛應用于生物制品及污染程度（含菌指數）的檢測。

〔材料與用品〕

土樣10g，無菌平皿（20套）及無菌水，牛肉膏蛋白胨平板（2只）；取液器（0.5mL及1mL各三支）；無菌有帽試管，三角瓶，無菌涂棒，接種環，記號筆，酒精燈，火柴，試管架 〔方法步驟〕

1、周圍環境中微生物的檢測

平板分4個區做好標記

用未洗的手指及肥皂洗過的手指（1次、2次、3次，或其它）分別在四個區上涂抹

倒置到37℃培養24小時觀察結果。

2、土壤中微生物分離純化及平板計數

采土樣（5－20cm）土10g，裝入到已滅菌的牛皮袋（信封）中，封好袋口

1.0g加入99mL無菌水（三角瓶）中

1mL無菌吸管0.5mL加入到4.5mL無菌水試管中，吹吸三次，振蕩均勻(10-3)。同法得10－4－10－6土壤溶液

用接種環沾取10-2土壤懸液在已經凝固的平板表面進行劃線分離

分別取各濃度土壤懸液0.1mL對號均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨平板，用無菌涂棒涂勻（多涂幾遍）。每個濃度做3個平板。〔結果分析〕

1、有較大片菌苔生長時，棄用。

2、選擇平均菌落數在30－300之間的平板。只有一個濃度符合此范圍時，以該平均菌落數為準；有兩個濃度的平板菌落數在30－300之間時，按兩者的總數平均決定，比值小于2，取平均，比值大于2則取較少的菌落總數。所有菌落數大于300，取稀釋度最高的平均菌落數乘稀釋倍數；所有菌落數均小于30，取稀釋度最低的平均菌落數乘稀釋倍數（即當所有菌落數均不在30－300之間時，此實驗的精確度要求下，可以最接近30或300的菌落數乘稀釋倍數）。

〔實驗討論〕

土壤中的菌數量在哪個數量級？你分離的微生物主要有哪些種類？為什么？

105數量級，主要是細菌，也有酵母。主要通過其菌落特征來判斷。細菌的菌落為濕潤，其正反面顏色一般一致，普遍比較小。酵母的菌落濕潤，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一致，不透明，邊緣整齊；而霉菌菌落特征：干燥，正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。

實驗七 細菌鑒定中常用的生理生化反應

〔目的要求〕了解細菌生理生化反應原理，掌握細菌鑒定中常用的生理生化反應方法；通過對不同細菌對不同含碳、氮化合物的分解利用情況，了解基代謝多樣性；學習不同培養基基中的不同生長現象及其代謝產物在鑒別細菌中的意義。

〔實驗原理〕各種細菌所具有的酶系統不盡相同，對營養基質的分解能力也不一樣，因而代謝產物存在差別。細菌的這種代謝方式可供鑒別細菌之用。用生理生化試驗的方法檢測細菌對各種基質的代謝作用及其代謝產物，從而鑒別細菌的種屬，稱為細菌的生理生化反應。有些細菌能發酵葡萄糖，而不能分解乳糖；有些細菌能分解某種糖產生有機酸和氣體；有的細菌則只產酸不產氣。在配制培養基時預先加入溴甲酚紫（ｐH4.4紅色～ｐH6.2黃色），當發酵產酸時，培養基由紫色變黃，氣體的產生則可由試管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來判斷。大腸桿菌不產生丁二醇，V.P.試驗為陰性。其進行混合酸發酵，故甲基紅試驗為陽性。產氣桿菌則進行丁二醇發酵，V.P試驗為陽性，甲基紅試驗為陰性。

〔材料用具〕E.coli，變形桿菌，枯草芽孢桿菌，產氣桿菌，糞水中分離的未知菌種斜面，糖發酵培養基；超凈工作臺，恒溫培養箱，試管，移液管，杜氏小管。甲基紅試劑、V.P.試劑。

〔實驗步驟〕各取4支相應的培養基，標記好發酵培養基的名稱、所接菌種名及組號，1支接大腸桿菌，1支接變形桿菌，1支接未知斜面菌種，1支不接。

1、糖發酵試驗

2、甲基紅試驗

3、V.P.試驗

接種后37℃分別培養24h、48h、48h，觀察實驗結果，將實驗結果填入表中。〔實驗結果〕

表7－1 實驗結果 編號 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 產氣桿菌 未知菌 CK 葡萄糖發酵

乳糖發酵

甲基紅實驗

V.P.試驗

〔實驗討論〕

如：討論通過哪些生理生化反應可以區分大腸桿菌，產氣桿菌？

大腸桿菌不產生丁二醇，V.P.試驗為陰性。其進行混合酸發酵，故甲基紅試驗為陽性。產氣桿菌則進行丁二醇發酵，V.P試驗為陽性，甲基紅試驗為陰性。

實驗八（綜合實驗）化能異養微生物的分離與純化 [目的要求]

1．掌握細菌、放線菌、酵母苗和霉菌稀釋分離、劃線分離等技術。

2．學習從樣品中分離、純化出所需菌株。

3．學習并掌握平板傾注法和斜面接種技術，了解培養細菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物的培養條件和培養時間。

4．學習習近平板菌落計數法。[基本原理]

土壤是微生物生活的大本營，是尋找和發現有重要應用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數量不同，一般土壤中細菌數量最多，其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥，偏堿性、有機質豐富的土壤中放線苗數量較多；酵母菌在一般土壤中的數量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數量多些。本次實驗從土壤中分離細菌、放線菌和霉菌；白面曲(發面用的引子)或酒曲或果園土中分離酵母菌。

為了分離和確保獲得某種微生物的單苗落，首先要考慮制備不同稀釋度的苗懸液。各類菌的稀釋度因菌源、采集樣品時的季節、氣溫等條件而異。其次，應考慮各類微生物的不同特性，避免樣品中各類微生物的相互干擾。細菌或放線苗在中性或微堿性環境較多．但細菌比放線萌生長快，分離放線菌時，一般在制備土壤稀釋液時添加10%酚或在分離培養基中加相應的抗生素以抑制細菌和霉菌(如加鏈霉素25-50μg mL以抑制細菌；添加制霉菌素50μg／mL或多菌靈30μ／mL以抑制霉菌)；酵母苗和霉菌都喜酸性環境，一般酵母菌只能以糖為碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5時生長極快。而細菌生長適宜的酸堿度為pH7，所以分離酵母菌時只要選擇好適宜的培養基和pH，可降低細菌增殖率，霉菌生長慢，也不干擾酵母菌分離。若分離霉菌，需降低細菌增殖率，一般培養基臨用前須添加滅過菌的乳酸或鏈霉素。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計數，分離霉菌時常在培養基中加入化學抑制劑。要想獲得某種微生物的純培養，還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養基及培養條件。四大類微生物的分離培養基、培養溫度、培養時間見表所示。[材料與用品] 1.菌源 選定采土地點舌。鏟去表土層2～3cm，取3～10cm深層土壤10g，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內．封好袋口，并記錄取樣地點、環境及日期。土樣采集后應及時分離，凡不能立即分離的樣品，應保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌種的變化。從面曲中分離酵母菌。也可用酒曲等替代。

2．培養基 肉膏蛋白胨培養基、馬丁氏培養基、高氏合成一號培養基、豆芽汁葡萄糖培養基(制平板和斜面，3．無菌水或無菌生理鹽水 配制生理鹽水．分裝于250mL錐形瓶中，每瓶裝99mL(或95mL分離霉菌用)，每瓶內裝10粒玻璃珠；分裝試管，每管裝約4.5-5mL(不超過試管高度的1／5)。

4．其他試劑與用品 無菌培養皿、無菌移液管、無菌玻璃涂棒(刮刀)、稱量紙、藥匙、洗耳球、10％酚溶液。[實驗步驟]

1．稀釋分離法平板分離菌有傾注法和涂布法兩種。本次實驗分離細菌、放線菌、霉菌時采用傾注法，酵母菌分離采用涂布法：

(1)細菌的分離 1)制備土壤稀釋液 稱取土樣1 g，在火焰旁加入盛有99mL并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．振蕩10一20min，使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，制成10-2稀釋度的土壤稀釋液。然后按10倍稀釋法進行稀釋分離，以制備10-2稀釋度為例，具體操作過程如下：取4.5 mL無菌水試管6支，按10-2......10-7順序編號，放置在試管架上。取無菌移液管一支，從移液管包裝紙套 中間撕口，將包裝紙套分成上、下兩段，去除下段包裝紙套，在移液管上端管口裝橡皮頭，取出下段移液管紙套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮頭，將吸液端口及移液管外部表面迅速通過火焰2～3次，殺滅撕紙套時可能污染的雜菌，切忌不要用手指去觸摸移液管吸液端口及外部。左手持錐形瓶底，以右手掌及小指、無名指夾住錐形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夾在于上，不能亂放在桌上)，將lmL移液管的吸液端伸進振蕩混勻的錐形瓶土壤懸液底部，用手指輕按橡皮頭，在錐形瓶內反復吹吸二次(吹吸時注意第二次液面要高于第一次吹吸 的液面)，然后準確吸取0.5mL10-2土壤稀釋液，右手將棉塞插回錐形瓶上，左手放下錐形瓶，換持一支盛有4.5mL無菌水的試管，依前法在火焰旁拔除試管帽(或棉塞)，將0.5m10-2土壤稀釋液注入4.5m1無菌水試管內，制成l0-3的土壤稀 釋液，將此移液管通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙套內，以備再用。另取一只未用過的無菌移液管在試管內反復吹吸三次，然后取出移液管，并將其通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙套內，以備再用。蓋上試管帽。右手持10-3稀釋液試管在左手十敲打20～30次。混勻土壤稀釋液。再從紙套取出原來的移液管，插入稀釋液已搖勻的試管內，再吹吸三次，然后準確吸出o.5mL 10-3的稀釋液。置第二支裝有4.5 m1無菌水試管，制成10-4：土壤稀釋液。用同法再制成 10-

5、10-

6、10一7的土壤稀釋液(為避免稀釋過程誤差，進行微生物計數時，最好每一個稀釋度更換一支移液管)：最后用的移液管重新放人紙套內。待滅菌后，再洗刷或將用過的移液管放在廢棄物筒中．用3%-5%來蘇爾浸泡l h后再滅菌洗滌。2)傾注法分離 取無菌培養皿6-9套，分別于培養皿底面按稀釋度編號。稀釋完畢后，用原來的移液管從菌液濃度最小的10-7土壤稀釋液開始吸取1mL稀釋液，按無菌操作技術加到和應編號的無菌培養皿內。再依同方法分別吸取1mLl0-

6、10-5的土壤稀釋液，各加到和應編號為10-

6、10-5的無菌培養皿內。將已滅菌的肉膏蛋白胨固體培養基融化，待冷卻至45-50度左右，分別傾入到已盛有I0-

5、10-

6、10-7土壤稀釋液的無菌培養皿內。注意：溫度過高易將菌燙死，且皿蓋上冷凝水太多，會影響分離效果；低于45％培養基易凝固，平板易出現凝塊、高低不平。傾倒培養基時注意無菌操作，要在火焰旁進行。左手拿培養皿，右手拿錐形瓶底部，左手同時用小指和手掌將棉塞拔開，灼燒瓶口．用左手大拇指將培養皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入培養基約12-15 mL，將培養皿在桌面上輕輕轉動，使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養基混合均勻．混勻后靜置桌上，待凝。3)培養 待平板完全冷凝后，將平扳倒置于35-37℃恒溫培養箱中，培養24～48h觀察結果。

(2)放線菌的分離

1)制備土壤稀釋液 稱取土樣l g，加入盛有99m1并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．并加人lo滴10％酚溶液(抑制細菌生長，可用l％的重鉻酸鉀溶液代替lo%酚溶液．效果更好)。振蕩后靜置5min，即成10-2土壤稀釋液。

2)傾注法分離 按前法將土壤稀釋液分別稀釋為10-

3、10-

4、10-5三個稀釋度，然后用無菌移液管依次分別吸取lmL 10-

5、l0-

4、10-3土壤稀釋液于對應編號的無菌培養皿內，用高氏合成1號培養基依前法傾倒平板，每個稀釋度做2～3個平行培養皿。理鹽水內，振蕩20min，即成10-2的面曲稀釋液。若選用果園上樣，也依前法稱取土樣，制成10-2壤稀釋液。3)涂布法分離 依前法向無菌培養皿中傾倒已融化并冷卻至45-50℃的豆芽汁葡萄糖培養基，待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取上述l0-

6、l0-

5、10-4三個稀釋度苗懸液0.1mL，依次滴加于對應編號已制備好的豆芽汁葡萄糖培養基平板上。右手持無菌玻璃涂棒，左手拿培養皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或將培養基劃破。4)培養 接種后，將平板倒置于30℃恒溫培養箱中，培養2～3 d觀察結果。

2劃線分離法 菌種被其他雜苗污染時或混合菌懸液常用劃線法進行純種分離。此法將蘸有混合菌懸液的接種環在平板表面多方向連續劃線，使混雜的微生物細胞在平板表面分散，經培養得到分散成由單個微生物細胞繁殖而成的菌落，從而達到純化目的。平板制作方法如前所述。但劃線分離的培養基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；為便于劃線，一般培養基不宜太薄，每皿約傾倒20mL培養基，培養基應厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有連續劃線法和分區劃線法兩種。(1)連續劃線法 連續劃線法是從平板邊緣一點開始，連續作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當中不需灼燒接種環上的菌。以無菌操作用接種環直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點種在平板邊緣一處，取出接種，燒去多余菌體。將接種環再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸人平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環冷卻．然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線。劃線時平板面與接種環面成30～40°的角度，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線。接種環不要嵌入培養基內劃破培養基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊。劃線完畢，關上皿蓋。灼燒接種環，待冷卻后放置接種架上。培養皿倒置于適溫的恒溫培養箱內培養(以免培養過程中皿蓋冷凝水滴下，沖散巳分離的菌落)。培養后在劃線甲板上觀察沿劃線處長出的菌落形態，涂片鏡檢為純種后再接種斜面。(2)分區劃線法平板分四區，故又稱四分區劃線法。劃線時每次將平板轉動60一70°劃線，每換一次角度，應將接種環上的菌燒死后，再在上次劃線末尾處繼續劃線。取菌、接種、培養方法與連 續劃線法相似。分區劃線法劃線分離的平板分4個區，其中第四區是單菌落的主要分布區，故其劃線面積應最大。為防止第四區內劃線與l、2、3區線條和接觸，應使4區線條與l區線條和平行，這樣區與區間線條夾角最好保持120度左右。先將接種環沾取少量菌在平板1區劃3～5條平行線，取出接種環，左手關上皿蓋．將平板轉動60～70°，右手把接種環上多余苗體燒死，將燒紅的接種環在子板邊緣冷卻，再按以上方法以1區劃線的苗體為菌源，由1區向2區作第二次早行劃線。第二次劃線完畢，同時再把平皿轉動約60一70°，同樣依次在5、1區劃線。劃線完畢，灼燒接種環，關上皿蓋，同上法培養，在劃線區觀察單菌落。本次實驗在分離細菌的平板上選取單菌落。于肉膏蛋白胨平板上再次劃線分離，使菌進一步純化。劃線接種后的平板，倒置于30℃恒溫培養箱中培養24h后觀察結果。

3．微生物菌落計數(平板菌落計數法)含菌樣品的微生物經稀釋分離培養后，每一個活苗細胞可以在平板上繁殖形成一個肉眼可見的菌落。故可根據平板上菌落的數目．推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數。每克菌樣品中微生物的活細胞數＝(同一稀釋度的3個平板上菌落平均數X稀釋倍數)/含菌樣品克數。一般由三個稀釋度計算出的每克含菌樣品中的總活菌數和同一稀釋度出現的 總活菌數均應很接近，不同稀釋度平板上出現的菌落數應呈規律性地減少。如相差較大，表示操作不精確。通常以第二個稀釋度的平板上出現50個左右菌落為好。也可用菌落計數器計數。

4．平板菌落形態及個體形態觀察 從不同平板上選擇不同類型菌落用肉眼觀察，區分細菌、放線菌、酵母茵和霉菌的菌落形態特征。并用接種環挑菌，看其與基質結合緊密程度。再用接種環挑取不同菌落制片，在顯微鏡下進行個體形態觀察。記錄所分離的含菌樣品中明顯不同的各類菌株的主要菌落特征和細胞形態。

5.分離純化菌株轉接斜面(斜面接種)在分離細菌、放線菌，酵母苗和霉菌的不同平板上選擇分離效果較好，認為已經純化的苗落各挑選一個用接種環接種斜面。將細菌接種于肉膏蛋白胨斜面，放線菌接種于高氏1號斜面，酵母菌和霉菌接種于豆芽汁葡萄糖斜面上。貼好標簽，在各自適宜的溫度下培養，培養后觀察是否為純種，記錄斜面培養條件及苗苔特征。置冰箱保藏。[實驗報告] 1.簡述分離微生物純種的原則及列出分離操作過程的關鍵無菌操作技術。2.四大類微生物的分離方法及培養條件

3.分離的微生物平板菌落計數結果

4.樣品中單菌落菌株的菌落培養特征與鏡檢形態 5.斜面培養條件及菌苔特征(包括純化結果)。

[思考題] 1.稀釋分離時．為什么要將已融化的瓊脂培養基冷卻到45～50℃左右才能傾入到裝有菌液的培養皿內? 2.劃線分離時為什么每次都要將接種環上多余的菌體燒掉?劃線時為何不能重疊? 1.3.在恒溫箱中培養微生物時為何培養皿均需倒置? 4.分離某類微生物時培養皿中出現其他類微生物，請說明原因。應該如何進一步分離和純化；經過-次分離的菌種是否皆為純種，若不純，應采用哪種分離方法最合適? 5.根據哪些菌落特征可區分細菌、放線苗、酵母菌與霉菌?它們的細胞結構表現在菌落形態上有什么聯系？

第二篇：微生物學實驗報告

微生物學實驗報告

實驗名稱：用高倍顯微鏡觀察葉綠體和細胞質流動

一、實驗目的1.初步掌握高倍顯微鏡的使用方法。

2.觀察高等植物的葉綠體在細胞質基質中的形態和分布

二、實驗原理

高等植物的葉綠體呈橢球狀,在不同的光照條件下,葉綠體可以運動,改變橢球體的方向,這樣既能接受較多的光照,又不至于被強光灼傷。在強光下,葉綠體以其橢球體的側面朝

向光源;在弱光下,葉綠體以其橢球體的正面朝向光源。因此,在不同光照條件下采集的葫蘆

蘚,其小葉內葉綠體橢球體的形狀不完全一樣。

活細胞中的細胞質處于不斷的流動狀態，觀察細胞質的流動，可以用細胞質基質中的葉綠體的運動做為標志。

三、材料用具

蘚類的葉，新鮮的黑藻，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，滴管，鑷子，刀片，培養皿，鉛筆

四、實驗過程（見書Ｐ30）

1．制作蘚類葉片的臨時裝片

2．用顯微鏡觀察葉綠體

3．制作黑藻葉片臨時裝片

4．用顯微鏡觀察細胞質流動

物理實驗報告 ·化學實驗報告 ·生物實驗報告 ·實驗報告格式 ·實驗報告模板

五、討論

1．細胞質基質中的葉綠體是否靜止不動，為什么？

2．葉綠體的形態和分布與葉綠體的功能有什么關系？

3．植物細胞的細胞質處于不斷的流動狀態，這對于活細胞完成生命活動有什么意義？

4．用鉛筆畫一個葉片細胞，標出葉綠體的大致流動方向。

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第三篇：食品微生物學實驗報告

常見微生物的分離培養與觀察

一，實驗目的1，掌握顯微鏡的使用方法，操作原理。

2，了解培養基的制備并掌握制備方法

3，掌握殺菌鍋殺菌方法

4，掌握常見微生物在超凈接種臺接種方法

5，掌握微生物裝片制備方法，染色，并能在顯微鏡下觀察細菌裝片

6，在顯微鏡下認識幾種常見微生物并比較

二．實驗原理

1，微生物培養基培養原理

培養基是人工配置的適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產物的混合營養物質。所以，任何培養基都應具備微生物所需要的6大營養素，而且比例是合適的，培養基配制好后，必須立即進行殺菌，否則很快引起雜菌生長。配制的培養基有協調的營養，最適合的物理化學條件，如滲透壓和PH，等一系列能滿足微生物生長的條件，所以可以制備不用的培養基來培養不同的微生物。如用麥芽汁培養菌培養酵母菌，用馬鈴薯蔗糖培養菌培養霉菌，用營養瓊脂培養基培養常用細菌等。

2，顯微鏡使用原理

常見微生物在光學顯微鏡下或者電子顯微鏡下可見。用顯微鏡能比較清晰的辨別幾種常見微生物并比較。在本次使用的顯微鏡中先插上電源，調節光源，把即將觀察的載玻片放到載物臺，先在低倍鏡下找到所要觀察的細菌，再切換至中倍鏡和高倍鏡下觀察。

三．實驗操作

1，儀器與試藥以及器材

SW-SJ-2FD潔凈工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）

BSP-100生化培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）

JP-500A架盤藥物天平（常熟市雙杰測試儀器廠）

01J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌器筒（上海東亞壓力容器制造有限公司）SHZ-82恒溫振蕩器（國華企業）

電子式可調萬用電爐（南通金石實業有限公司）

UB102I生物顯微鏡（重慶澳浦光電技術有限公司）

打粉機

瓊脂，土豆（市售），麥芽（藥店），蔗糖（庫存），氯化鈉，雞蛋，蛋白胨，酵母提取液，美藍，酒精，結晶紫，碘液，番紅。

火柴，酒精燈，酒精，棉球，接種棒，棉線，燒杯（5000ml,500ml），錐形瓶，試管，培養皿，玻璃棒，試管塞，廢報紙，吸水紙。

2培養基配制

細菌培養基,蛋白胨10g,酵母抽提物5g，氯化鈉9g加水至1000ml,瓊脂2,5g, 加入瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補足失水加NaoH至PH7.0，分裝在各個試管里3ml,其余的分裝在錐形瓶中。加棉花塞，用高溫殺菌鍋殺菌30分鐘。

麥芽汁培養基：見筆記本裝在錐形瓶中

馬鈴薯蔗糖培養基： 把馬鈴薯洗凈去皮，取200g切成小塊，加水1000ml，煮沸半小時后，補足水分。在濾液中加入10g瓊脂，煮沸溶解后加糖20g（用于培養霉菌的加入蔗糖，用于培養酵母菌的加入葡萄糖），補足水分，分裝在錐形瓶中，滅菌，備用。

操作步驟，1，殺菌鍋殺菌過程：加水至稍微沒過鍋內三腳架，再整齊的放入錐形瓶和試管。蓋上殺菌鍋蓋子，在蓋的時候要注意將管子放入鍋內小孔處，同時要對稱的旋轉旋鈕，蓋上蓋子，接通電源，將底下溫度開關調至最大處，打開放氣閥，從看到氣體出現起，計時20分鐘后，關掉放氣閥，觀察壓力閥至0。1千帕時，調整溫度旋鈕至綠燈熄滅，計時15分鐘。關掉電源，冷卻至壓力閥指針到0帕。結束殺菌，打開放氣閥放出剩余氣體。打開殺菌鍋鍋蓋，取出各個試劑瓶。

2，分裝各種微生物，將從殺菌鍋取出的試劑分開裝，將試管整齊排放到由廢舊報紙折成的斜面上，為金黃色葡萄球菌的培養備用。將裝有麥芽汁培養基的錐形瓶取出為酵母菌培養備用。將裝有細菌培養基的錐形瓶分別倒入培養皿中，為培養沙門氏菌備用。將裝有馬鈴薯蔗糖培養基的錐形瓶分別裝入培養皿中，為霉菌的培養做備用。

第四篇：《醫學免疫學與微生物學》實驗報告

《醫學免疫學與微生物學》實驗報告 實驗一

［實驗名稱］：沉淀反應

［實驗目的］：通過單向瓊脂擴散測定待測血清Ig含量

［實驗材料］：１％離子瓊脂、白喉類毒素、白喉抗毒素、載玻片、毛細吸管

打孔器

［試驗步驟］：（１）將溶解后的離子瓊脂冷卻到４５０Ｃ，加入適當濃度的抗原混合均勻，吸取３－４毫升加在載玻片上，使其均勻布滿載玻片而又

不流失。

（２）瓊脂凝固后制成凝膠板，然后隔適當距離打孔。

（３）在孔內滴加待測可溶性抗體。

（４）將凝膠平板放入帶蓋瓷盤中，下面墊一濕紗布以保持濕度，置于

３７０Ｃ恒溫箱中２４小時，觀察沉淀環。

［實驗結果］：（沉淀環直徑）

測量沉淀環直徑：。

［實驗分析］單向瓊脂擴散是一種定量試驗，主要用來測定標本中各種免疫球蛋

白或補體成分的含量。

在孔中加入待測抗體使其向四周擴散，經一定時間后抗體與瓊脂中

抗原相遇，在比例適宜處生成白色沉淀環。

沉淀環直徑與抗體濃度成正比。根據測試樣品沉淀環直徑的大小，可從已知的標準曲線中查出樣品中抗體的含量。

實驗二

［實驗名稱］：間接凝集抑制試驗（妊娠試驗）

［實驗目的］：測定待檢尿液中是否含ＨＣＧ（絨毛膜促性腺激素）以診斷妊娠

［實驗材料］：孕婦尿液、非孕婦尿液、ＨＣＧ致敏乳膠抗原、抗ＨＣＧ血清、載玻

片等

［試驗步驟］：

（１）取一片載玻片，標記出左右。

（２）在載玻片左側加一滴待檢尿液，右側加一滴非孕婦尿液。

（３）在兩側尿液中分別加一滴抗ＨＣＧ血清，搖動混勻２－３分鐘。

（４）在兩側液滴中分別再加一滴ＨＣＧ致敏乳膠抗原，搖動混勻２－３分鐘。（５）觀察判定結果。

［實驗結果］：（凝集和非凝集的描述）

左側（待檢尿液側）呈現均勻的乳狀液狀態，無凝集顆粒。間接凝集抑制陽性。右測（非孕婦尿液側）出現明顯的凝集顆粒。間接凝集抑制陰性。

［實驗分析］：（結合實驗原理）

孕婦尿液中的ＨＣＧ含量顯著增高。尿液中的ＨＣＧ與加入的抗ＨＣＧ結合，抗ＨＣＧ被消耗，使得加入的ＨＣＧ乳膠抗原不能再與抗ＨＣＧ結合，不出現乳膠抗原間接凝集反應（凝集被抑制），所以液滴呈現均勻乳狀液，為乳膠間接凝集抑制陽性反應。

非孕婦尿液中ＨＣＧ含量極少，不足以抑制抗ＨＣＧ與ＨＣＧ乳膠抗原發生間接凝集反應，所以出現乳膠顆粒的凝集，為乳膠間接凝集抑制陰性反應。

實驗三

［實驗名稱］： 細菌形態、特殊結構觀察及顯微鏡油鏡頭使用

［實驗目的］： 認識細菌的基本形態和特殊結構，學會使用顯微鏡油鏡頭

［實驗材料］： 顯微鏡、香柏油、二甲苯、鏡頭紙、球菌標本片、桿菌標本片、弧菌

標本片、莢膜標本片、芽孢標本片、鞭毛標本片

［試驗步驟］：

（一）顯微鏡油鏡頭的使用

１、用油鏡觀察時光線宜強，可將聚光器升高，開大光圈。

２、在標本片上滴加一滴香柏油。

３、眼睛從鏡筒側面觀察，同時緩慢將鏡筒調至鏡頭浸入香柏油中（勿接觸標本片）。４、眼睛移至目鏡。先用粗調焦螺旋緩慢將油鏡調離標本玻片直至觀察到模糊物象，再用細調焦螺旋調至物象清晰。觀察。

５、觀察完畢后把油鏡頭擦拭干凈，顯微鏡復位收好。

（二）細菌基本形態的觀察

（三）細菌特殊結構的觀察（示教）

［實驗結果］：（繪圖）根據觀察結果繪制細菌基本形態、特殊結構圖（不少于兩幅）［實驗分析］：（結合結構的功能）

１、細菌的基本形態有球形、球桿形、桿形、弧形、螺旋形五種形態。

２、某些細菌在生長繁殖時，可分泌一些粘液性物質包繞在細胞壁外圍，稱為莢膜，用特殊染色法可將莢膜染成與菌體不同的顏色。莢膜具有抗原性，可以鑒別細菌或細菌分型；細菌的莢膜與其致病性有關。

３、某些細菌由細胞質伸出的細長彎曲的蛋白質絲狀物，稱為鞭毛。鞭毛是細菌的運動器官，鞭毛具有較強的抗原性，有些細菌的鞭毛與其致病性有關。

４、某些Ｇ－的菌體上有比鞭毛細、短而直、數量多的絲狀物，稱為菌毛，主要成分

是蛋白質。菌毛分普通菌毛（與細菌致病力有關）和性菌毛（傳遞遺傳物質、使

受體菌獲得某些相應性狀）

５、某些Ｇ＋在體內外營養物質缺乏的環境下，細胞漿發生脫水濃縮，在菌體內形成一個折光性強、通透性低的圓形或橢圓形小體，稱為芽孢。用特殊染色法可將芽孢染成與菌體不同的顏色。芽孢的大小、形態和位置隨菌種不同而有差異，有助于細菌的鑒別；芽孢對熱、干燥、化學消毒劑和輻射都有較強的抵抗力。

實驗四

［實驗名稱］： 細菌人工培養性狀觀察及革蘭氏染色法

［實驗目的］： 觀察細菌菌落形態、溶血現象、色素；細菌標本的涂片和革蘭氏染色

法檢查

［實驗材料］： 細菌人工培養性狀觀察示教片、大腸桿菌菌落、葡萄球菌菌落、載玻

片、生理鹽水、接種環、酒精燈、結晶紫染液、盧戈氏碘液、95%酒

精、復紅染液、顯微鏡等

［試驗步驟］：

（一）細菌菌落形態、溶血現象、色素等觀察（示教）

（二）細菌標本的涂片

１、取兩張潔凈的載玻片，分別滴加一滴生理鹽水。

２、以無菌操作法，用接種環分別挑取少許大腸桿菌菌落和葡萄球菌菌落，分別涂

于兩張載玻片的生理鹽水中研成均勻混濁的菌膜（不可過厚）后自然干燥。３、將干燥后的標本片在酒精燈的火焰上方快速通過三次，予以固定。

（三）染色將制好的標本片按下列步驟進行染色

１、在兩片標本片上分別滴加結晶紫染液初染１分鐘，水洗。

２、滴加盧戈氏碘液媒染１分鐘，水洗。

３、滴加９５％酒精，搖動載片０．５－１分鐘脫色至恰無紫色退下，水洗。４、滴加稀釋復紅染液，復染０．５－１分鐘，水洗，干燥。

５、鏡檢。葡萄球菌（Ｇ＋球菌）染成紫色，大腸桿菌（Ｇ－菌）染成紅色。

［實驗結果］：（描述不同細菌菌落的區別，繪圖表示革蘭氏染色的鏡下結果）１、液體培養基中：葡萄球菌呈均勻混濁生長，鏈球菌呈沉淀生長，枯草桿菌形成菌

膜；在普通瓊脂平板上：金黃色葡萄球菌產生脂溶性金黃色色素使菌落呈現金黃色但培養基顏色不變，綠膿桿菌產生水溶性色素使培養基呈現綠色；在血瓊脂平

板上：金黃色葡萄球菌菌落周圍形成透明的溶血環，甲型溶血性鏈球菌菌落周圍形成狹窄的草綠色溶血環，乙型溶血性鏈球菌菌落周圍形成寬而透明的溶血環。２、繪圖表示大腸桿菌、葡萄球菌經革蘭氏染色后的鏡檢結果

［實驗分析］：（結合細菌細胞壁構造分析革蘭氏染色法結果及意義）

結果：

Ｇ＋菌的細胞壁由肽聚糖（三維空間結構）和磷壁酸組成，在酒精作用下通透性降低，而且Ｇ＋菌的等電點較低，帶負電荷多，結合堿性染料多，因此結晶紫與碘的復合物不易被酒精脫除被染成紫色。

Ｇ－菌的細胞壁由肽聚糖（疏松薄弱的二維結構）、脂蛋白、外膜、脂多糖等成分組成，在酒精作用下通透性增高，而且Ｇ－菌的等電點較高，結合堿性染料較少，因此初染的結晶紫被酒精脫色而被復紅復染成紅色。

意義：

１、鑒定細菌２、指導臨床選擇藥物３、研究和了解細菌的致病性

第五篇：微生物學實驗

細菌群體生長表現為細胞數目的增加或細胞物質的增加。測定細胞數目的方法有顯微鏡直接計數法(direct microscopic count)、平板菌落計數法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細胞物質的方法有細胞干重的測定，細胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產物的測定等。總之，測定微生物生長量的方法很多，各有優缺點，工作中應根據具體情況要求加以選擇。本實驗主要介紹生產、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法和光電比濁計數法。

一 顯微鏡直接計數法

（一）目的要求

1．明確血細胞計數板計數的原理。

2．掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。

（二）基本原理

顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總容積為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學檢查。顯微鏡直接計數法的優點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結合活菌染色微室培養（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數活菌體的目的。本實驗以血球計數板為例進行顯微鏡直接計數。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。

用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。該計數板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數室。血細胞計數板構造如圖l5-1。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規格的計數板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。

圖15—1 血細胞計數板構造

（一）圖15—2 血細胞計數板構造

（二）A.正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網，中間大方格為計數室

1.血細胞計數板；2.蓋玻片；3.計數室

計數時，通常數五個中方格的總菌數，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數，然后再換算成lml菌液中的總菌數。

設五個中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，如果是25個中方格的計數板，則

1mL菌液中的總菌數=A/5×25×104×B=50000A·B（個）

同理，如果是16個中方格的計數板，1mL菌液中的總菌數=A/5×16×104×B=32000A·B（個）

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母

2．儀器或其他用具 血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。

（四）操作步驟

l．菌懸液制備

以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當的菌懸液。

2．鏡檢計數室

在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數。

3．加樣品

將清潔干燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。

取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生。

4．顯微鏡計數

加樣后靜止5min，然后將血細胞計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數。

調節顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數室方格線，或只見豎線或只見橫線。

在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度后再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5~10個菌體為宜。每個計數室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算樣品的含菌量。

5．清洗血細胞計數板

使用完畢后，將血細胞計數板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。

（五）實驗報告

l．結果

將結果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數；B表示菌液稀釋倍數。

各中格中菌數AB二室平均值菌數/ml

12345

第一室

第二室

2．思考題

(1)根據你的體會，說明用血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方面?應如何盡量減少誤差．力求準確?

(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設計1～2種可行的檢測方法。

二平板菌落計數法

（一）目的要求

學習習近平板菌落計數的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數的結果，現在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對菌落數來表示樣品的活菌含量。

平板菌落計數法雖然操作較繁，結果需要培養一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由于該計數方法的最大優點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數或污染程度的檢測。

（三）器材

1．菌種 大腸桿菌菌懸液。

2．培養基 牛肉膏蛋白陳培養基。

3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養箱等。

（四）操作步驟

l．編號

取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-

4、10-

5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀釋

用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。……其余依次類推，整個過程如圖15-3所示。

放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。

3，取樣

用三支1mL無菌吸管分別吸取10-

4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。

圖15—3平板菌落計數操作步驟

4．倒平板．

盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養基與菌液混合均勻，而又不使培養基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養皿后，應盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數。

待培養基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養。

5．計數

培養48h后，取出培養平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，并按下列公式進行計算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數×稀釋倍數×5

一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于三個，這樣便于數據統計，減少誤差。由10-

4、10-

5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數也不應相差太大。

平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養后所出現的平均菌落數在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。

平板菌落計數法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20～30min，使菌液滲入培養基表層內，然后倒置37℃的恒溫箱中培養24～48h。

涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。

五、實驗報告

1．結果

2．將培養后菌落計數結果填入下表

稀釋度10-410-510-6

Cfu數/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考題

(1)為什么融化后的培養基要冷卻至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵?為什么?

(3)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優缺點及應用。

(4)當你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認為問題出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法計數，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養較長時間(48h)后觀察結果?

三 光電比濁計數法

一、目的要求

1．了解光電比濁計數法的原理。

2．學習、掌握光電比濁計數法的操作方法。

二、基本原理

當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數。制作標準曲線時，菌體計數可采用血細胞計數板計數，平板菌落計數或細胞干重測定等方法。本實驗采用血細胞計數板計數。

光電比濁計數法的優點是簡便、迅速，可以連續測定，適合于自動控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態、培養液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數應采用相同的菌株和培養條件制作標準曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經過最大吸收波長以及穩定性試驗來確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質的懸液不適合用此法進行測定。

圖15—4 比濁法測定細胞濃度的原理

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母培養液

2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。

（四）操作步驟

1．標準曲線制作

（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。

（2）調整菌液濃度 用血細胞計數板計數培養24小時的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。

（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，并將OD值填入下表

管號12345678

細胞數106/ml

光密度（OD）

每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定

(4)以光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數為橫坐標，繪制標準曲線。

2．樣品測定

將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。

各種操作條件必須與制作標準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數就不準確。

3．根據所測得的光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數。

（五）實驗報告

l．結果

每毫升樣品原液菌數=從標準曲線查得每毫升的菌數×稀釋倍數

2．思考題

(1)光電比濁計數的原理是什么?這種計數法有何優缺點?

(2)光電比濁計數在生產實踐中有何應用價值?

(3)本實驗為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實驗中需要測定大腸桿菌生長的OD值，你將如何選擇波長?

四 大腸桿菌生長曲線的測定

(一)目的要求

1．通過細菌數量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規律，繪制生長線。

2．復習光電比濁法測量細菌數量的方法。

(二)基本原理

大多數細菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時期的大腸桿菌細胞每20min分裂一次。將一定量的細菌轉入新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養細胞要經歷延遲期，對數期、穩定期和衰亡期四個階段。以培養時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養條件下其生長曲線不同，同樣的細菌在不同的培養條件下所繪制的生長曲線也不相同。測定細菌的生長曲線，了解其生長繁殖規律，這對人們根據不同的需要，有效地利用和控制細菌的生長具有重要意義。

用于測定細菌細胞數量的方法已在上述實驗作了介紹。本實驗用分光光度計(spectrophotometer)進行光電比濁測定不同培養時間細菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線。也可以直接用試管或帶有測定管的三角瓶(圖15-5)測定“klett units”值的光度計。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個帶測定管的三角瓶，在不同的培養時間(橫坐標)取樣測定，以測得的klett units為縱坐標，便可很方便地繪制出細菌的生長曲線。如果需要，可根據公式1 klett units=OD/0.002換算出所測菌懸液的OD值。

圖15—5 帶側臂試管的三角燒瓶

(三)器材

1．菌種 大腸桿菌

2．培養基 LB液體培養基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。

3．儀器或其他用具 722型分光光度計，水浴振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。

圖15—6 直接用試管測OD值

(四)操作步驟

1．標記

取11支無菌大試管，用記號筆分別標明培養時間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接種

分別用5ml無菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過夜培養液(培養10~12h)轉入盛有50ml LB液的三角瓶內，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標記的11支無菌大試管中。

3．培養

將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(振蕩頻率250r/min)，分別培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標有相應時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密度值。

4．比濁測定

用未接種的LB液體培養基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定。從早取出的培養液開始依次測定，對細胞密度大的培養液用LB液體培養基適當稀釋后測定，使其光密度值在0.1~0.65之內(測定OD值前，將待測定的培養液振蕩，使細胞均勻分布)。

本操作步驟也可用簡便的方法代替：

1．用1ml無菌吸管取0.25ml大腸桿菌過夜培養液轉入盛有3~5ml LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調零點，測定樣品中培養0h的OD值。測定完畢后，取出試管置37℃繼續振蕩培養。

2．分別在培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養物試管按上述方法測定OD值。該方法準確度高、操作簡便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測定的準確度愈高。

(五)實驗報告

1．結果

(1)將測定的OD600值填入下表：

培養時間對照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)繪制大腸桿菌的生長曲線。

2．思考題

(1)如果用活菌計數法制作生長曲線，你認為會有什么不同？兩者各有什么優缺點？

(2)細菌生長繁殖所經歷的四個時期中，哪個時期其代時最短？若細胞密度為103/ml，培養4.5h后，其密度高達2×108/ml，計計算出其代時。

(3)次生代謝產物的大量積累在哪個時期？根據細菌生長繁殖的規律，采用哪些措施可使次生代謝產物積累更多？

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