第一篇：植物細胞工程總結

緒論

1, 細胞工程：是應用細胞生物學和分子生物學方法，借助工程學的實驗方法或技術，在細胞水

平上研究改造生物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞、細胞產品或新生物體的有關理論和技術方法的學科。廣義的細胞工程包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養技術。狹義的細胞工程是指細胞融合和細胞培養技術。

根據研究對象的不同，高等生物的細胞工程分為動物細胞工程和植物細胞工程。動物細胞工程包括細胞培養技術（包括組織培養、器官培養），細胞融合技術，胚胎工程技術（核移植、胚胎分割等），克隆技術（單細胞系克隆、器官克隆和個體克隆）。植物細胞工程包括植物組織、器官培養技術，細胞培養技術，原生質體融合與培養技術，亞細胞水平的操作技術等。

2, 植物細胞工程：以植物組織細胞為基本單位，在離體條件下進行培養、繁殖或人為的精細操 作，使細胞得某些生物學特性按人們的意愿發生改變，從而改良品種或創造新物種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用物質的過程稱… 植物細胞工程的應用：

1，利用細胞融合技術，克服遠緣雜交不親和性。2，利用培養變異，篩選優良的突變體。3，倍性育種，縮短育種年限。

4, 離體種質保存。5，細胞培養生產有用的物質。第二章

一，實驗室設置及內部設備

實驗室建設應考慮的問題：

1、實驗的性質

2、實驗室的規模

細胞工程實驗室: 基本實驗室:準備室、無菌操作室、培養室 貯藏室 輔助實驗室：細胞學實驗室、生化分析實驗室 溫室

1、準備室

完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養基分裝及高壓滅菌；器皿、材料的洗滌等工作。

主要設備

純水器 工作臺 藥品廚 天平電磁爐 冰箱 玻璃器皿 酸度計 高壓滅菌鍋 干燥箱等

2、無菌操作室（接種室）

用于植物材料的消毒、接種、培養物的轉移、原生質體的制備以及一切需要進行無菌操作的技術程序。

接種室應用推拉門，設有緩沖間，面積2m2為宜。進入接種室前更衣換鞋，減少帶入接種室雜菌。

接種室主要設備

超凈工作臺 ：每次實驗前要用紫外燈滅菌20min，關掉紫外燈開始工作，工作過程中注意一直開著吹風機。

無菌操作用具： 離心機 細胞融合儀

3、培養室

用于接種材料的培養。培養室的大小可根據需要培養架的大小、數目、及其他附屬設備而定。其設計以充分利用空間和節省能源為原則。控制：溫度、光照、濕度。

培養室主要設備：培養架 空調 時控器 自動開燈、關燈溫度自動記錄儀 搖床 二，培養基

1，培養基的種類

培養基根據其態相不同分為固體培養基與液體培養基。根據培養物的培養過程，培養基分為初代培養基和繼代培養基。根據作用不同，培養基為誘導培養基、增殖培養基和生根培養基。根據營養水平不同，培養基分為許多種,常用如下：（1）MS培養基：富鹽平衡培養基（還有LS、BL、ER）

特點: ①無機鹽濃度較高，元素比例合適，是較穩定的平衡溶液；②微量元素種類齊全； ③營養豐富。

（2）B5培養基 ：高硝態氮培養基（還有N6和SH培養基）

特點: ①硝酸鉀含量高； ②氨態氮含量低； ③ VB1含量較高。（3）N6培養基：高硝態氮培養基

特點：硝態氮含量高，氨態氮含量較低。

（4）White培養基：低鹽培養基（還有WS、HE、改良Nitsch等 特點：無機鹽含量低，有機成分也很低，適于生根培養。（5）KM-8P培養基：

特點:有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質融合的培養。培養基成分：水 無機鹽 有機成分 植物激素 培養物支持材料 輔助性物質 2，植物激素的應用規律

①先Aux后CKs處理,有利于細胞分裂但不利于細胞分化。容易產生多倍體細胞（核分裂和胞壁形成不同步所至），cks有利于胞壁形成。

②先CKs 后Aux處理，細胞分裂也分化(可能是內源生長素起作用)③ Aux 和CKs 同時處理，分化率提高。Aux與CKs的比值改變形態建成的方向。

高 有利根分化，抑制芽形成； Aux / CKs 適中 促進愈傷組織生長；

低 有利芽分化，抑制根形成；

在組織培養中生長調節物質的使用濃度，因植物的種類、部位、時期、內源激素等的不同而異, 培養基配制：

1、確定配方

2、移母液

3、定容

4、稱蔗糖

5、調PH值（用0.1MNaOH或HCl調PH值為5.8）

6、培養基熬制（加瓊脂）

7、分裝（100ml的三角瓶約裝入30－40ml, 30瓶/L）

8、扎口

9、滅菌

10、接種 三，植物材料滅菌

滅菌方法 ①.培養基滅菌：高壓濕熱滅菌，某些激素采用過濾滅菌

②.玻璃器皿滅菌：干熱滅菌：150℃ 40min;120℃ 2h，濕熱滅菌：121℃, 30min 接種前用酒精棉球擦試，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。

③.接種工具滅菌：用前干熱滅菌，用前濕熱滅菌，接種前用酒精棉球擦試，浸入95%酒精液中，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。電熱石英砂滅菌器 ④.實驗服、口罩滅菌：濕熱滅菌

⑤.接種室滅菌 ：紫外燈照射(接種室、超凈臺)：波長260nm，距離小于1.2m，15-20min。臭氧滅菌機：1-2h,熏蒸滅菌：(5-8ml甲醛+5g高錳酸鉀)/ m3 ,接種臺噴霧消毒：75%酒精。⑥.培養室滅菌 : 新建培養室用前要徹底熏蒸1次。

隔1周用洗衣粉水或來蘇水拖地1次，用高錳酸鉀擦架1次。

⑦.物體表面滅菌: 滅菌方式：噴霧、涂抹殺菌 ,范圍：超凈臺的臺面和四壁、雙手 消毒劑：70%酒精；1-2%來蘇水；1%新潔爾滅等。

⑧.接種材料消毒: A, 取材 營養器官：根、莖尖、莖段、葉片等

生殖器官：胚胎（胚、胚珠、胚乳等）和花藥 等

外植體〔explant〕：從植物體上分離下來的用于離體培養的材料 外植體滅菌

用化學滅菌劑滅菌

消毒步驟：①流水沖洗或洗衣粉漂洗②用化學滅菌劑浸潤消毒通常：70%酒精30S，0.1%升汞4-10min。表面有較厚蠟質層的的可加吐溫-20或吐溫-80等浸潤劑(滅菌液的0.5%)。③無菌水沖洗3-5次。注：滅菌液要浸沒材料 第三章 植物細胞全能性與形態發生

一、植物細胞全能性(totipotency)：植物體每個正常細胞都含有該植物的全部遺傳信息，在適宜的條件下如同受精卵一樣, 具有發育成完整植株的潛在能力。

細胞分化〔cell differentiation〕指由于細胞分工而導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在發育方式改變的過程。細胞脫分化〔cell dedifferentiation〕培養條件下使一個已分化的細胞失去已分化細胞的典型特征，或消除了細胞分工，使之回復到分生細胞狀態或胚性細胞狀態的過程。或具有特異結構和功能的細胞轉化成沒有特異結構和功能的細胞的過程。

愈傷組織〔callus〕植物離體培養過程中脫分化后的細胞，經過細胞分裂，產生的無組織結構、無明顯極性、松散的細胞團稱為愈傷組織。多在外植體切面上產生。

愈傷組織的特征：細胞分裂快，結構疏散，缺少有組織的結構，顏色淺而透明。成功地脫分化將導致細胞分裂，形成愈傷組織或胚性細胞團。

植物胚胎干細胞：植物連續的器官分化是由頂端分生組織細胞發育而成，因此，植物頂端分生組織細胞具有較強的表達全能性的能力，被稱為植物胚胎干細胞。

生理脫離效應;當細胞或組織脫離母體以后，在適宜的條件下將進行一些特殊的發育方式，如再生、復壯等，child將其稱為生理脫離效應

（細胞）或（組織）與母體分離和激素的調控是細胞全能性表達的前提。在離體培養條件下，細胞全能性的表達是通過細胞脫分化和再分化實現的。脫分化是細胞全能性的表達前提，再分化是細胞全能性的表達最終體現。

靜止細胞(G0細胞)啟動分裂是分化細胞成功脫分化的重要標志。

細胞脫分化的三個階段 ：1，啟動階段 細胞質增生并開始向細胞中央伸出細胞質絲，液泡蛋白出現。2，演變階段 細胞核向中央移動，質體轉變為原質體 3，脫分化終結期，回復到分生組織。

細胞再分化〔redifferentiatio〕脫分化后無序生長的分生細胞在離體培養下，重新恢復細胞分化能力，經過細胞分化、組織分化和器官分化遞進地進行，最后再生完整植株。

極性(polarity)：植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態結構以及生理生化上的梯度差異。細胞的不均等分裂是細胞極性建立的標志（即細胞分化的標志）。激素在植物生長發育中具有重要的調控作用，也是離體培養條件下，調控細胞脫分化和再分化的主要因素。其中生長素和細胞分裂素是兩類主要的調控培養條件下細胞生長和分化的植物激素。

在離體培養條件下TEs則由愈傷組織薄壁細胞分化形成這是愈傷組織細胞分化器官的前提。植物的離體器官發生：培養條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。

離體培養中器官發生的方式

通過器官發生形成再生植株大體上有3種方式：

①先芽后根:是應該選擇的方式.②先根后芽 ③根芽同長 植物細胞經再分化形成植株有2條途徑：（在離體培養條件下）器官發生 體細胞胚胎發生 體細胞胚（胚狀體、體胚）：指離體培養下沒有經過受精過程，但經過了胚胎發育過程所形成的胚的類似物。

胚狀體有以下幾方面的界定：

①體細胞胚是離體培養的產物，只限于在離體培養范圍使用，以區別于無融合生殖胚；②體 3 細胞胚起源于非合子細胞，以區別于合子胚；③體細胞胚經過了胚胎發育過程，以區別與離體培中器官發生形成個體的途徑。

經過愈傷組織的胚胎發生需要3個培養階段： ①誘導外植體形成愈傷組織；②誘導愈傷組織胚性化，③體細胞胚形成。體細胞胚的結構與發育特點

1、與器官發生途徑相比，體細胞胚在組織學上有3個特征： ①體細胞胚最根本的特征是具有雙極性，即在發育的早期階段從方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都是單極性的；

②體細胞胚的維管組織與外植體現存組織無解剖結構上的聯系，而不定根或不定芽與外植體或愈傷組織的維管組織有聯系。

③體細胞胚胎的維管組織分布是獨立的Y字形結構，不定芽維管組織無此結構。人工種子：（狹義）植物離體培養中產生的體細胞胚，包裹在含有養分和具有保護功能的物質中，并在適宜條件下能夠發芽出苗的顆粒體。

（廣義）在體細胞胚、微型營養變態器官、不定芽等微繁體之外加上必要的營養成分后，用具有一定通透性而無毒的材料將其包裹起來，形成的與天然種子相似的顆粒體。第四章 離體培養下的遺傳與變異

離體培養中的遺傳與變異特點：

1、普遍性：變異可發生在各種培養類型中； 變異發生在各種植物的培養中；變異發生與培養類型有關。

2、局限性：一些單基因控制的性狀不僅發生隱形突變，也發生顯性突變。

3、嵌合性：是指同一有機體中同時存在有遺傳組成不同的細胞它是組織培養中常見的現象。體細胞變異誘導材料的選擇：其一，目標性狀的可行性。體細胞突變的頻率雖然較高，但對于某一個體來講，變異的性狀是個別的，因此選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過誘變改變個別不良性狀，是體細胞突變系選擇的目的。其二，必需充分考慮試驗植物的細胞培養技術水平，只有對起始材料有良好的培養技術，才有可能制定完滿的誘變及選擇方案。如果起始細胞的培養技術不成熟，不能再生整株，則不能進行后續的各項操作。其三，適當的細胞類型亦是提高體細胞突變系篩選效率的重要條件。第五章植物主要的組織培養技術 第一節快繁

無性繁殖途徑：

1、無融合生殖：即不經過減數分裂和受精而形成種子。

2、營養繁殖：即由母株的營養體部分再生出新的植株 植物離體快速無性繁殖：利用離體培養技術,用優良植株的外植體進行培養,在短期內獲得大量遺傳一致的個體的方法，這種離體無性繁殖方法由于繁殖速度快，又稱離體快速無性繁殖。所獲得的株群稱單株無性系或單芽無性系

初代培養 ：芽、莖段、葉片等外植體在離體培養條件下誘導愈傷組織、側芽或不定芽、胚狀體過程。即接種某種外植體后，最初的幾代培養。

生根培養：將芽苗轉接到生根培養基上培養成為完整植株的過程 植物快繁常見問題及對策：

（一）污染的原因及預防：原因：細菌、真菌為病源菌；污染途徑有外植體帶菌，培養基及器皿滅菌不徹底，操作人員未遵守操作規程，環境不清潔。預防措施：（1）防止材料帶菌：避免陰雨天在室外采集外植體；春秋組培；材料預培養。（2）嚴格外植體滅菌（3）接種用具滅菌徹底（4）嚴守無菌操作規程（5）保持培養室清潔

（二）褐變的原因及預防原因（1）植物品種（基因型）（2）生理狀態（3）培養條件（4）材料轉接季節 防止措施（1）選擇適宜的外植體（2）連續轉接3）先液體培養再固體培養（4）加抗氧化劑（5）選擇合適的培養條件加活性炭或 暗處培養。

（三）玻璃化的原因及預防原因：

（1）激素濃度（尤其CTK）高（2）瓊脂濃度低（3）光照弱（4）溫度高（5）通風條件不好（6）培養基離子種類及比例不適宜 預防措施：（1）適當控制培養基中無機鹽成分，適當提高蔗糖和瓊脂濃度，減少含氮化合物的用量，降低培養基的水勢。（2）適當降低CTK的濃度。考慮加入適當的脫落酸。（3）增加自然光照；增加容器通氣，控制溫度。（4）加入活性炭、多效唑或CCC等物質。第二節、植物脫毒快繁技術 1熱處理脫毒原理：

①病毒是DNA大分子，病毒進入植物細胞后，隨植物細胞DNA一起復制。熱處理并不能殺死細胞，只是鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內增殖減緩或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。

②熱處理是一種物理效應，可加速植物細胞分裂，在激烈分裂的細胞中正常核蛋白合成占優勢，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。因此加速分生組織細胞的分裂，能夠獲得無病毒植株。

2、熱處理脫毒方法：(1)溫湯浸漬處理 適用于休眠器官，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。(2)熱空氣處理 熱空氣處理對活躍生長的莖尖效果較好。將生長的盆栽植株移入溫熱治療箱內（35-40℃）處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達數月。

分生組織不帶病毒，可能有4方面的原因：

1、植物體病毒的移動主要靠2條途徑：一是通過維管系統，而分生組織中尚未形成維管系統；二是通過胞間連絲，但這條途徑病毒移動速度非常慢，趕不上莖尖和根尖細胞不斷分裂和活躍的生長速度。

2、當植物細胞分裂DNA復制時，病毒DNA隨著復制。因此，植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭。在旺盛分裂的分生組織中，代謝活動很高，正常核蛋白合成占優勢，使病毒無法進行復制。

3、莖尖中存在高水平內源激素，可抑制病毒的增殖。

4、在植物體內存在有一種“病毒鈍化系統”，在分生組織中的活性最高，因而使分生組織不受侵染。

第三節 花藥和花粉的培養

花藥培養:將花粉發育至一定階段的花藥培養在人工培養基上，誘導其花粉粒改變發育進程，形成花粉胚或愈傷組織，進而分化成苗的過程。（器官培養）花粉培養(小孢子培養)：將發育至一定階段花粉從花藥中分離出來成為分散或游離狀態，花粉脫分化后再生成苗。（細胞培養）

單倍體：具有配子體染色體數的孢子體。

單倍體植物3個明顯特點：

1、體細胞染色體數減半

2、生長發育弱，體形小

3、雌雄配子嚴重不育

花藥、花粉培養的意義

1、迅速獲得純合型材料，提高選擇效率，縮短育種年限

2、獲得育種中間材料

3、突變體選育

4、體細胞融合5、遺傳研究

6、獲得染色體異附加系和代換系

7、遺傳工程受體 花粉植株再生途徑：

1、經由成愈傷組織再生植株

2、經由胚狀體再生植株 花粉分離收集：

由于花粉包于花藥內，必須將它們從花藥中分離、收集才能進行培養。方法： 1）花粉漂浮自然釋放法:將花藥接種于液體培養中，使花粉自然釋放。2）人工擠壓法:用玻璃棒搗碎花藥使花粉釋放。

3）機械法:用磁力攪拌器打碎花藥釋放花粉。

釋放的花粉粒→ 尼龍網（孔徑20—60um）過濾，除去藥壁等組織 → 500-1000轉/分離心1-5分鐘，收集花粉。

花藥培養過程中花藥為什么要經過低溫處理 低溫處理的作用機理：

1）預處理引起花藥、花粉內源激素發生變化，改變了小孢子（花粉粒）第一次有絲分裂的軸向發育（正常發育時，兩次有絲分裂形成三核花粉粒），進而形成愈傷組織或胚狀體。2）提高小孢子的生活力，延緩退化速度，而提高了誘導率。

3）引起小孢子孤立化，即小孢子從花藥中分離。因為低溫處理過程中，花藥內薄壁細胞和絨氈層逐漸退化，從而切斷與小孢子之間的聯系。花藥培養時為什么要用較高濃度蔗糖和較低濃度激素？

蔗糖濃度 培養基中蔗糖濃度比其它組織培養高，尤其早期培養，一般5%—10%原因是花粉母細胞的滲透壓比花絲等體細胞高，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細胞的生長，而利于花粉的生長。

激素 花藥壁分化程度高，重新分裂需要較高的激素濃度才能啟動。因此，花藥培養基的激素水平要相對較低才能抑制二倍體細胞的分裂。確定適宜的激素濃度，以促使花粉細胞分裂的同時又抑制花藥二倍體細胞分裂是成功獲得單倍體的關鍵。第四節 胚胎培養

胚胎培養類型 胚培養 胚乳培養 子房培養 胚珠培養

胚培養概念：無菌條件下，把胚從種子、子房或胚珠中分離出來，在培養基上進一步生長發育形成幼苗的過程。

成熟胚培養：是指子葉已形成的種胚。僅提供一定的溫度、濕度就可以發芽生成植物體。如種子的發育

成熟胚培養意義：克服發芽障礙；打破種子休眠，縮短育種周期等。幼胚培養：胚齡處于原胚期、球形胚、心形期、早魚雷期的培養。

幼胚培養意義：

1、克服遠緣雜交不育

2、克服珠心胚干擾，提高育種效率

3、幼胚具有較高再生能力，可通過體細胞胚胎發生產生大量的再生植株。

4、為原生質體培養、細胞融合及基因轉化提供試驗材料。幼胚培養時胚的發育方式有哪幾種？各有何特點？

① 胚性發育：幼胚的離體培養，仍按在活體內的發育方式發育，最后形成成熟胚，然后再按種子萌發途徑出苗形成完整植株，這種途徑發育的幼胚一般一個幼胚將來就是一個植株

② 早熟萌發：離體胚不繼續胚性生長，而是在培養基上迅速萌發成幼苗，通常稱為早熟萌發。在大多數情況下，一個幼胚萌發成一個植株，但有時會由于細胞分裂產生大量的胚性細胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現象就是所謂的叢生胚現象。

③愈傷組織：在許多情況下，幼胚的離體培養首先發生細胞增殖，形成愈傷組織。一般來講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。胚乳按發育初期是否形成細胞壁分為①核型胚乳②細胞型胚乳③沼生目型胚乳 試管受精：培養未受精的胚珠或子房并在試管內撒播花粉，使其受精形成具有生活力的種子。未授粉胚珠子房培養與授粉后胚珠子房培養有何不同？

根據培養的胚珠是否受精將胚珠培養分為受精胚珠的培養和未受精的胚珠的培養。(1)未受精的胚珠的培養,目的是為試管受精提供雌配子體。(2)受精后胚珠的培養,胚珠內胚的發育處于早期階段,從兩個細胞的原胚開始至球形胚階段。

第六章 植物細胞培養及次生產物代謝生產

植物細胞培養：是指在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養使其 增殖的技術.培養方法：培養規模:小規模培養 大批量培養

培養方式:懸浮培養平板培養 看護培養 產物不同:誘變培養 次生產物培養

培養方式：懸浮培養、單細胞培養、植物細胞的規模化培養及有用物質生產

懸浮培養（cell suspension culture）懸浮培養是細胞培養的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養基進行培養增殖的技術。

成功的懸浮細胞培養體系必須滿足3個條件：

1、浮懸培養物分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下，在實際培養中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。

2、均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。

3、細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可增加1倍。

培養周期的概念 具有一定起始培養密度的單細胞，從開始培養到細胞數目和總重量增長停止這一過程，稱為一個培養周期。

懸浮細胞培養的同步化：指同一懸浮培養體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。（植物細胞在懸浮培養中的游離性較差，容易團聚進入不同程度的分化狀態，因此要達到完全同步化相當困難。）

細胞同步化的方法：①分選法：通過細胞體積大小分級，直接將處于相同周期的細胞進行分選，然后將同一狀態的細胞繼代培養于同一培養體系中。

②饑餓法：在一個培養體系中，如果細胞生長的基本成分喪失，則導致細胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時期。

③抑制劑法：通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期—G1期的同步化細胞。④低溫法：冷處理也可提高培養體系中細胞同步化程度。

單細胞培養

1、平板培養

2、看護培養

3、微室培養

4、雙層濾紙培養 植物次生代謝產物：植物中一大類并非植物生長發育所必需的小分子有機化合物，其產生和分布通常有種屬、器官組織和生長發育期的特異性。次生產物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。

植物細胞大規模培養的技術要求：從細胞生長與培養技術方面講必須滿足以下3個條件

1、培養的細胞在遺傳上應是穩定的，以得到產量恒定的產物。

2、細胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內能得到較高產量的終產物。

3、代謝產物要在細胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養基中。固定化培養系統--固定化培養技術的優點在于：

1、可以較容易地控制培養系統的理化環境，從而可以研究特定的代謝途徑，并便于調節；

2、細胞位置的固定使其所處的環境類似于在植物體中所處的狀態，相互間接觸密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生產物的合成；

3、由于細胞固定在支持物上，培養基可以不斷更換，可以從培養基中提取產物，免除了培養基中因含有過多的初生產物對細胞代謝的反饋抑制，也由于細胞留在反應器中，新的培養基可以再次利用這些細胞生產初生產物，從而節省了生產細胞所付出的時間和費用；

4、正是由于細胞固定在一定的介質中，并可以從培養基中不斷提取產物，因此，它可以進行連續生產。

利用細胞培養生產有用物質的一般程序

1、選材 應注意條件：①藥效肯定②對其有效成分有充分的了解④市場短缺或價格昂貴；③有測定有效成分和藥理的可靠方法⑤取有藥效成分的部位，且該部位較易形成愈傷組織。

2、細胞株系建立

3、大量培養

4、產品提取與純化 第七章 原生質體培養與融合 原生質體（Protoplast）：去掉細胞壁的由質膜包裹、具有生活力的裸露細胞。

亞原生質體(subprotoplast)：在原生質體分離過程中，有時會引起細胞內含物的斷裂而形成一些較小的原生質體就叫做亞原生質體。它可以具有細胞核或沒有細胞核。

核質體(nuclearplast)：由原生質膜和薄層細胞質包圍細胞核形成的小原生質體。也稱為微小原生質體(miniprotoplast)。

胞質體（cytoplast）：不含細胞核而僅含有部分細胞質的原生質體。

原生質體材料預處理(暗處理，預培養和低溫處理)原因：預質壁分離可使胞壁內表層充分暴露，增加胞壁降解酶與胞壁的接觸面而提高胞壁降解速度；降低原生質體內電解質滲漏，防止在分離期間外來酶被吸入細胞內，降低原生質體對酶液中可能存在的有害影響的敏感，提高原生質體的穩定性和存活率。原生質體純化方法有：

離心沉淀法 原理：應用原生質體的比重大于溶液，離心后原生質體沉于底部。漂浮法 原理：應用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質體漂浮在液體的表面。

接口法 原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質體的密度，另一種溶液的密度小于原生質體的密度，原生質體介于兩種溶液之間。原生質體培養方法

1、固體包埋培養（原生質體純化后，離心，用培養基稀釋至一定密度，再與0.6%瓊脂或低溶點瓊脂糖（37?C左右）混合，培養于培養皿中。）

2、固體平板培養

優點：可以跟蹤觀察單個原生質體的發育情況，易于統計原生質體分裂頻率。缺點: 操作要求嚴格，尤其是混合時的溫度掌握必需合適，溫度偏高則影響原生質體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質體不易混合均勻。

3、液體淺層培養(將含有原生質體的培養液在培養皿底部鋪一薄層，封口后進行培養。)優點：操作簡單，對原生質體的損傷小，且易于添加新鮮培養基轉移培養物。缺點：原生質體分布不均勻，常常發生原生質體之間的粘連現象而影響其進一步的生長和發育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發育情況。

4、固、液培養 優點：固體培養基中的營養物質可緩慢釋放到液體培養基中，如果在下層固體培養基中加一定量的活性炭，則還可以吸附培養物產生的一些有害物質，促進原生質體的分裂和細胞團的形成。

缺點：不易觀察細胞的發育過程。

5、共培養法（將生長迅速的原生質體培養物與難于培養的原生質體混合）

6、瓊脂糖珠培養

7、飼養層培養

原生質體再生：再生細胞壁、細胞分裂和生長、植株再生（愈傷組織形成）

原生質體融合又稱體細胞雜交是指將植物不同種、屬甚至科間的原生質體通過人工誘導融合，然后進行離體培養，使其再生雜種植株的技術。融合方法

1、NaNO3法 NaNO3的作用：中和質膜的負電荷，使原生質體不再相互排斥，而緊密結合 8 在一起 不足：誘導頻率不高。

2、高pH-高Ca離子法 優點：雜種產量高。不足：高pH值對細胞有毒害作用

3、PEG法 特點：融合頻率高、可重復性強、誘發融合無特異性、毒性較低

4、電融合法 特點 不存在對細胞毒害的問題、融合效率高、融合技術操作簡便 原生質體的融合過程包括3個主要階段：1)兩個或多個原生質體的質膜彼此靠近； 2)局部區域質膜緊密粘連，彼此融合；3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。供體-受體式細胞融合包括非對稱雜交和細胞質雜交兩種方式。

非對稱雜交是一親本的細胞核和細胞質與另一親本的少量核物質(1～2條染色體)和全部細胞質融合；

細胞質雜交是一親本的細胞核和細胞質及另一親本的全部細胞質融合，可能使兩種來源不同的核外遺傳成分(細胞器)與一個特定的核基因組結合在一起，這種雜種叫細胞質雜種。第九章后

1, 超低溫通常是指-80℃以下的低溫。常用的保存介質或容器有：超低溫冰箱（-80～-150℃）、液氮（-196℃）和液氮蒸汽箱(-140℃液氮)等。

2, 用于離體超低溫保存的植物材料一般有愈傷組織、懸浮細胞、胚、花粉和莖尖等。3, 細胞內外水的凍結狀態時細胞凍存技術的關鍵。

4, 種質超低溫保存的關鍵是降溫冰凍過程中避免細胞內結冰。在降溫過程中必須使細胞發生適當程度的保護性脫水，使細胞內外的水流到細胞外結冰，并且在化凍過程中防止細胞內次生結冰。因此針對不同種類的植物材料，篩選合適的冰凍保護劑，采用適當的降溫冰凍速度和化凍方式可能使細胞不受損傷或使損傷減小到最低程度。

5, 超低溫保存植物種質資源的程序包括培養材料的準備、預處理、冰凍及保存、化凍處理、細胞活力和變異的評價及植株再生等幾個步驟。

6, 降溫方法從降溫方式來看，有快速冰凍法、慢速冰凍法、兩步冰凍法和逐級冰凍法等。7, 玻璃化：是指液體轉變為非晶體的固化過程。使溶液玻璃化得兩條途徑：大幅度提高冷卻速率和增加溶液的濃度。

8, 玻璃化溶液（PVS1）,其中包含了20.5％的DMSO、15.5％的乙酰胺、10％的1,2-丙二醇以及6％的聚乙二醇，他們分別起到冰凍保護、毒性中和、強化玻璃化和非滲透聚合的作用。9, 超低溫保存方法主要有：玻璃化法、包埋玻璃化法、干燥法、預培養法、預培養-干燥法和包埋脫水法。

10, 包埋脫水法的三個步驟：先將材料用藻酸鈣包埋，然后將包埋后含有保存材料的藻酸鈣小珠在含有高濃度（或梯度濃度）蔗糖的培養基上預培養，最后侵入液氮。

11, 玻璃化法是將生物材料經極高濃度的玻璃化溶液快速脫水后直接投入液氮，使生物材料連同玻璃化溶液發生玻璃化轉變，進入玻璃態。

12, 材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性及器官、組織和細胞的年齡及生理狀態。13, 冰凍保護劑具有的特點：易溶于水、對細胞無毒，容易從組織細胞中清除。冰凍保護劑的作用主要表現在：增加膜透性，加速細胞內的水流到細胞外結冰，穩定細胞膜結構，阻止低溫傷害，降低冰點，提高容液的粘滯性，阻止冰晶生長。

第二篇：植物細胞工程教案

植物細胞工程

一、教學目標

1、細胞的全能性（理解）

2、簡述植物組織培養和植物體細胞雜交技術。（知道）

二、教學重點和難點 1.教學重點

（1）植物組織培養的原理和過程。（2）植物體細胞雜交的原理。2.教學難點 植物體細胞雜交

三、教學過程 導入：

我們已經所學及疑問

1、有性生殖中，受精卵經分裂、分化形成各種組織、器官，最后形成個體。三倍體如何繁殖后代？

2、細胞的全能性

體細胞具有全能性的原因是什么？

各種細胞表達全能性的能力是否一樣？

在生物體內，體細胞有沒有表達全能性，為什么？ 體細胞在什么條件下才會表達全能性?

（一）植物組織培養

1、概念

2、植物組織培養的過程。（如下）

脫分化 再分化

外植體 → 愈傷組織 → 根、芽 →植物體

3、條件

4、證明：

（二）植物體細胞雜交

1、過程 植物細胞A 植物細胞B ↓ 去壁

↓

原生質體 A 原生質體B

↓

↓

原生質體融合↓ 再生細胞壁

雜種細胞

2、優點： 克服遠源雜交不親和障礙，培育作物新品種。↓ 細胞分裂

愈傷組織

↓細胞分化

雜種植株

第三篇：植物細胞工程說課稿

植物細胞工程說課稿

各位領導、老師們，你們好！

今天我要進行說課的內容是植物細胞工程 首先，我對本節內容進行分析

一、說教材的地位和作用

《植物細胞工程》是人教版教材高中生物選修本專題二細胞工程第1節內容。在此之前，學生們已經復習了細胞的結構和功能，細胞分化，細胞全能性等知識為本節內容的學習起到了鋪墊的作用。因此，本節內容在細胞工程中具有不容忽視的重要的地位，為了更好的復習動物細胞工程的知識，所以復習好這一節內容起到了承上啟下的作用。本內容包含的一些植物細胞工程技術知識，通過與動物細胞工程技術對比，從而幫助學生學習具有連續性和系統性，為高考打下良好的基礎。

二、說教學目標

根據本教材的結構和內容分析，結合著高三年級學生他們的認知結構及其心理特征，我制定了以下的教學目標：

1、認知目標：識記： 細胞的全能性

2、能力目標

簡述植物組織培養和植物體細胞雜交技術。列舉植物細胞工程的實際應用。

3、情感、態度、價值觀目標

可使學生更深刻地理解知識理論在實際生活中的應用，并且逐漸地培養學生具有良好的個性。認同細胞學基礎理論研究與技術開發之間的關系；關注細胞工程研究的發展和應用前景。

三、說教學的重、難點

本著高三二輪標準，在吃透教材基礎上，我確定了以下的教學重點和難點 教學重點：

（1）植物組織培養的原理和過程。（2）植物體細胞雜交的原理。（3）植物細胞工程應用的實例。教學難點： 植物體細胞雜交

四、說教法

基于本節課內容的特點，我主要采用了以下的教學方法：

1、直觀演示法：

利用多媒體等手段進行直觀演示，激發學生的學習興趣，活躍課堂氣氛，促進學生對知識的掌握。

2、活動探究法

通過導學案，以學生為主體，使學生的探索性得到了充分的發揮，培養學生的自學能力、思維能力、活動組織能力。

3、集體討論法

針對導學案和學生提出的問題，組織學生進行集體和分組討論，促使學生在學習中解決問題，培養學生的團結協作的精神。

五、說學法

我們常說：“現代的文盲不是不懂字的人，而是沒有掌握學習方法的人”，因而，我在教學過程中特別重視學法的指導。讓學生從機械的“學答”向“學問”轉變，從“學會”向“會學”轉變，成為真正的學習的主人。這節課在指導學生的學習方法和培養學生的學習能力方面主要采取以下方法：思考評價法、分析歸納法、自主探究法、總結反思法。

六、說教學過程

在這節課的教學過程中，我注重突出重點，條理清晰，緊湊合理。各項活動的安排也注重互動、交流，最大限度的調動學生參與課堂的積極性、主動性。

1、學生朗讀：（3—5分鐘）

學生通過朗讀配發的選修3基礎知識匯總把上節課所學習的內容加以鞏固，并且把今天所學習的內容進行簡單預習，從而把相關的一些知識點進行記憶。而生物選修3中的一些基礎知識大多是要進行記憶的，對于提高二輪復習效率，這個環節的設置是必不可少的。

2、導學案的完成：（15分鐘）

①、要求學生在規定的時間內去完成創新設計的基礎梳理

②、要求學生完成基礎梳理之后，通過討論解決多媒體所展示的問題。

（一）細胞的全能性

1、什么是細胞的全能性？

2、體細胞具有全能性的原因是什么？

3、各種細胞表達全能性的能力是否一樣？

4、在生物體內，體細胞有沒有表達全能性，為什么？

5、體細胞在什么條件下才會表達全能性?

（二）植物組織培養

（1）離體的器官、組織或細胞如果不進行脫分化處理，能否培養成完整植物體？（2）決定植物細胞脫分化、再分化的關鍵因素是什么？

（三）植物體細胞雜交

（1）要想讓兩個來自不同植物的體細胞融合在一起，遇到的第一個障礙是什么？（2）有沒有一種溫和的去細胞壁的方法？（3）如果兩個來源不同的原生質體發生融合形成了雜種細胞，下一步該對此細胞做何種處理？（4）如何將雜種細胞培育成雜種植株？

（四）植物細胞工程應用的實例

一、植物繁殖的新途徑

1.微型繁殖技術為什么能保持親本的優良性狀？2.培育植物的莖尖可得到脫毒苗，其中的原因是什么？3.人工種子在生產上有哪些優點？

二、作物新品種的培育

1.單倍體育種的原理是什么？2.體細胞誘變育種對什么材料進行誘變處理？

3、教師和學生點評，進行課堂小結，強化認識。（15分鐘）

①、學生對基礎梳理進行交叉批改，提高學生對知識的掌握，以及糾錯的能力。

②、對于多媒體的展示的問題進行點評和小結，對于簡單的知識點可以叫學生來點評，難一點的由老師來完成。這樣可以提高學生的表達能力，以及組織學生學習的能力。

③、設置相關表格和過程圖，或者運用創新設計中的表格和過程圖對問題中所涉及到的重點和難點進行歸納和梳理，讓學生在通過小結的過程中把本堂課的重點和難點理解透徹并掌握，同時使知識具有系統性和連貫性。總之，課堂小結，可以把課堂傳授的知識盡快地轉化為學生的素質；可使學生更深刻地理解知識理論在實際生活中的應用，并且逐漸地培養學生具有良好的個性。

4、課堂作業（3-5分鐘）

多媒體中相關練習，創新設計的典例1和訓練3，高考真題集訓第3題。

5、布置作業。

完成創新設計的其他題目和活頁訓練，以及全品小練習。

七、板書設計

我比較注重直觀、系統的板書設計，還及時地體現教材中的知識點，以便于學生能夠理解掌握。

板書：略

我的說課完畢，謝謝大家。

說課教師：信豐中學 余斌

第四篇：植物細胞工程實驗題

1、高壓滅菌鍋的工作原理和注意事項？

答：工作原理：在密閉的高壓滅菌鍋內，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，持續15—30分鐘，可殺滅各種微生物及高度耐熱的芽孢。

注意事項：

a 待滅菌的物品放置不宜過緊；

b 堆放滅菌包時應注意安全閥放汽孔位置必須留出空氣，保障其暢通，否則易造成鍋體爆裂事故。

c 必須將冷空氣充分排除，否則鍋內溫度達不到規定溫度，影響滅菌效果； d 滅菌完畢后，不可放氣減壓，否則瓶內液體會劇烈沸騰，沖掉瓶塞而外溢甚至導致容器爆裂。須待滅菌器內壓力降至與大氣壓相等后才可開蓋。

2、超凈工作臺的工作原理是什么？

答：鼓風機送入的空氣先通過一個前置過濾器，濾掉大部分塵埃，再經過一個高效過濾器，除去了大于0.3um的塵埃、真菌和細菌孢子等。從而形成連續不斷的無塵無菌的超凈空氣層流，其流速為24~30m/min，這樣的流速不會妨礙酒精燈的燃燒，同時工作人員在這樣的無菌條件下操作可保持無菌材料在轉接過程中不受污染。

3、母液配制的注意事項。

答：1）配制母液所需藥品應采用分析純或化學純試劑。

2）配制母液用水為蒸餾水或去離子水，試劑可以通過加熱或磁力攪拌器加熱溶解。

3）母液保存時間不宜過長，如發現母液有混濁或沉淀現象發生，則棄之不用。

4）母液濃度不能過高，否則易產生結晶，影響試驗效果。

5）在配制大量元素母液時，混合、溶解各種無機鹽時要注意先后順序，盡量把Ca2+，SO42-,PO43-等離子錯開分別溶解，同時稀釋濃度要大些，并要慢慢地邊混合邊攪拌。

4、培養基配制過程中應注意哪些因素？培養基為什么要煮沸后再分裝？

答：培養基配制過程中應注意PH和滅菌；①PH影響外植體和培養材料對離子的吸收，過酸過堿的培養基影響培養材料的生長；此外，瓊脂培養基的PH值還影響到培養基的凝固狀況。②滅菌，植物組織培養必須在無菌環境中進行。培養基煮沸后再分裝的原因：因為含瓊脂的培養基會在40℃左右時凝固，因為要先在水浴中加熱，使其成為均勻液態時在尚未冷卻情況下盡快分裝。

5、培養基的滅菌過程。

答：①檢查滅菌鍋外層鍋內水位，水量過少時應加水。把分裝好的培養基及其他需滅菌的各種器具和蒸餾水放入滅菌鍋的消毒桶內。

②蓋上鍋蓋，注意按照說明操作并確定已蓋好，設置好溫度和時間參數，開啟電源加熱滅菌。

③滅菌時間到后，先切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，待滅菌鍋壓力表指針降到0時，打開排氣閥，旋松螺栓，開啟鍋蓋，取出已滅菌的培養基。④剛滅過菌的培養基成液體狀，取出時不要用力搖動，否則會導致部分培養基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷卻。在室溫下放置1-2天，觀察有無微生物生長，以確定培養基是否徹底滅菌。經檢查沒有雜菌生長的方可使用。

6、調節pH值應該調高0.2-0.3個單位，為什么？

答：因為在高壓滅菌過程中，培養基的某些成分會發生分解氧化，常使培養基的pH值發生一定幅度的變化，pH值的變化方向和幅度取決于多種因素，如培養基的成分，濃度，滅菌時間及溫度等，因此在設定培養基pH值時應根據實際情況做適當調整。

7、哪些因素影響培養基的凝固？

答：1）pH值調節不準確，偏酸 ；

2）滅菌時間過長，破壞了瓊脂的結構； 3）瓊脂質量及用量的問題。

8、1mol/L HCl和NaOH的配制方法？

答：如要1mol/L HCl 配制1L（36%鹽酸密度 1.18g/mL，37%鹽酸密度 1.19g/mL，）

方法一：須配制1mol/L × 1L= 1mol HCl，則 1 × 36.5÷ 36% ÷1.18 =85.9mL。

方法二：1.18 × 1000 × 36% ÷ 36.5 = 11.64 mol/L，根據m1*v1=m2*v2，v1=（1mol/L × 1L）÷ 11.64 mol/L = 85.9 mL。即取36%鹽酸溶液85.9 mL定容于1L的蒸餾水水中。1mol/L NaOH的配制方法：取40g NaOH固體溶解于蒸餾水中，最后定容至1L。

9、為什么常在消毒液中加入1～2滴表面活性劑如吐溫80？

答：吐溫80作為一種表面活性劑，具有乳化、擴散、增溶、穩定等作用。在消毒液中加入1～2滴吐溫80可以促使消毒液更充分地濕潤整個外植體組織，進而將消毒液滲透、擴散到菌團內部，達到更好的消毒效果。

10.在接種過程中，通過哪些措施來防止雜菌對接種工具、接種材料的污染？ ? 污染原因歸結為3個方面: 1）是組織培養室或接種室的清潔問題;2）是外植體自身帶菌;3）是組織培養過程各環節操作不適宜或不嚴格。

11、胡蘿卜切塊滅菌后為什么要反復清洗？在接種時為什么一定要切割胡蘿卜塊的外圍？切割多大接種才最合適？被接種的部位一定要含有哪種組織，為什么？

增殖率=（增殖的外植體數量/接種外植體數量）*100%；

增殖系數（倍數）= 繼代培養后產生的莖芽總數/繼代接種時的外植體個數； 污染率=（污染的外植體數量/接種外植體數量）*100%；

誘導率(%)=(分化出叢生芽的外植體數量/接種外植體數量)*100%； 注：增殖率，誘導率的計算均應除去污染的外植體。

第五篇：植物細胞工程教學反思

植物細胞工程教學反思

海林林業一中紀彩云

引入從白菜—甘藍開始，引出細胞工程，（白菜2n=20，甘藍n=18），引出概念，要注意的是操作水平是細胞水平（基因工程是分子水平），然后講述植物細胞工程，其技術手段包括有植物組織培養、植物體細胞雜交等，其理論基礎是植物細胞的全能性，首先講述的是細胞的全能性，包括定義、細胞具有全能性的原因、未表現出來的原因、全能性的高低、與細胞分化分裂的關系等。然后是植物組織培養，包括原理、過程、應用三個方面，其中過程是重點，要進行詳細的分析歸納，總結出其要點和常見的考點。有如下幾點：

1.離體培養，外植體

2.無菌操作

3.培養液成分：瓊脂、水、礦質元素、蔗糖（不是葡萄糖）、植物激素等

4.脫分化、去分化、愈傷組織的概念

5.植物激素的比例會影響到根和芽的分化

6.花藥離體培養屬于植物組織培養，取的是生殖細胞，得到的是單倍體；大多數情況下取的是體細胞，得到的是普通的植株

最后是應用部分，包括無病毒植物、快速繁殖、生產藥物、人工種子（注意如何獲得）、轉基因植物的培育等。

植物細胞工程的第二項技術手段是植物體細胞雜交，包括原理、過程、意義三個方面，過程是重點，要進行說的講解分析，其中要注意的幾點是：

1.酶解法去除植物細胞壁

2.原生質體誘導融合的方法

3.有一次篩選