第一篇：基因工程和細胞工程

專題八 現代生物科技專題

第一講 基因工程和細胞工程

1.(2009·浙江卷，1)用動、植物成體的體細胞進行離體培養，下列敘述正確的是（）A．都需要用CO2培養箱 B．都需要用液體培養基 C．都要在無菌條件下進行 D．都可體現細胞的全能性

2．下列關于運用植物組織培養技術產生新個體的敘述，錯誤的是

A．屬于無性生殖

B．主要理論依據是植物細胞具有全能性

C．培養過程中由于人工培養基含大量營養，不需光照就能發育成完整植株

D．人工培養基中含植物生長發育所需的全部營養物質，包括礦質元素、糖、維生素等 3．(2009·安徽卷，4)2008年諾貝爾化學獎授予了“發現和發展了水母綠色熒光蛋白”的三位科學家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉入真核生物細胞內，表達出的蛋白質就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是

（）A．追蹤目的基因在細胞內的復制過程 B．追蹤目的基因插入到染色體上的位置 C．追蹤目的基因編碼的蛋白質在細胞內的分布 D．追蹤目的基因編碼的蛋白質的空間結構

4．限制酶是一種核酸內切酶，可識別并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下圖為四種限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和BglⅡ的識別序列和切割位點：

()

切割出來的DNA黏性末端可以互補配對的是

A．BamHⅠ和EcoRⅠ B．BamHⅠ和HindⅢ C．BamHⅠ和BglⅡ D．EcoRⅠ和HindⅢ

5．對于不同的生物，將重組基因導入受體細胞的方法有差異，下列方法不合適的是

（）A．以質粒為運載體，利用大腸桿菌生產人的胰島素時，可用氯化鈣處理大腸桿菌 B．以噬菌體為運載體，利用大腸桿菌生產人的凝血因子時，可使其直接侵染大腸桿菌 C．以質粒為運載體，利用轉基因羊生產人的乳鐵蛋白時，可用顯微注射技術將重組基 因導入受精卵

（）D．以質粒為運載體，培育轉基因植物時，可借鑒質粒侵染細胞的途徑，用重組質粒侵染植物細胞

6．蛋白質工程與基因工程相比，其突出特點是（）A．基因工程原則上能生產任何蛋白質

B．蛋白質工程能對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質

C．蛋白質工程可以不通過轉錄和翻譯來實現

D．蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程 7．如圖所示為農作物新品種的育種方式，相關敘述錯誤的是()

A．②③過程分別稱為脫分化和再分化 B．①過程代表植物體細胞雜交 C．⑤過程中常用的基因表達載體是質粒

D．圖中育種方式突出優點是克服了遠緣雜交不親和的障礙 8．下列關于原代培養、傳代培養的敘述，錯誤的是（）A．都屬于動物細胞體外培養，需要一定的培養條件

B．第一次分瓶之前的培養屬于原代培養，以后的培養均屬于傳代培養 C．50代以后的培養，少部分細胞會獲得不死性 D．培養至50代以后的細胞稱為細胞株

9．(2010·江蘇卷，18)下列關于轉基因植物的敘述，正確的是（）A．轉入到油菜的抗除草劑基因，可能通過花粉傳入環境中 B．轉抗蟲基因的植物，不會導致昆蟲群體抗性基因頻率增加 C．動物的生長激素基因轉入植物后不能表達

D．如轉基因植物的外源基因來源于自然界，則不存在安全性問題

10．番木瓜，俗稱木瓜，有“百果之王”的美稱，在人們所食的38種常見水果中，營養價值居首位，從種植到結果只要9～15個月，所以人們一直希望找到與番木瓜果實質量、產量、抗病性、環境適應性等有關的基因，更難得的是它是第一種進行轉基因實驗的水果。2004年12月，我國南開大學與美國夏威夷大學共同主持番木瓜的基因組測序工作，30余家單位參與該工作，并于2008年4月在《自然》雜志上以封面文章的形式發表了《轉基因熱帶水果植物——木瓜的基因組草圖》的成果論文。請回答下列有關問題：

(1)研究組首先從番木瓜細胞中提取出DNA，使用“鳥槍法”將其打成碎片，需要用的工具酶是______________。經過定位和測序后，再重新連接成整體，用到的工具酶是__________________________。

(2)“抗環斑病毒的番木瓜”細胞中的抗病毒基因的表達過程(圖解表示)是： ______________________________________________________。

(3)將已導入抗病毒基因的木瓜細胞培養成植株，需要通過下列過程①――→②――→③―→④，①能被培養成為④的根本原因是________________。這個過程中需要用到

脫分化

再分化____________________(激素)；②表示__________，它的特點是______________________。

11．(2011·海南卷，31)回答有關基因工程的問題：

(1)構建基因工程表達載體時，用不同類型的限制酶切割DNA后，可能產生黏性末端，也可能產生________末端。若要在限制酶切割目的基因和質粒后使其直接進行連接，則應選擇能使二者產生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。

(2)利用大腸桿菌生產人胰島素時，構建的表達載體含有人胰島素基因及其啟動子等，其中啟動子的作用是________________________________________________________。在用表達載體轉化大腸桿菌時，常用________處理大腸桿菌，以利于表達載體進入；為了檢測胰島素基因是否轉錄出了mRNA，可用標記的胰島素基因片段作探針與mRNA雜交，該雜交技術稱為________________。為了檢測胰島素基因轉錄的mRNA是否翻譯成________，常用抗原—抗體雜交技術。

(3)如果要將某目的基因通過農桿菌轉化法導入植物細胞，先要將目的基因插入農桿菌Ti質粒的________中，然后用該農桿菌感染植物細胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細胞的________上。

12．下圖是單克隆抗體制備流程示意圖。

(1)______________技術是單克隆抗體技術的基礎。

(2)根據培養基的用途分類，圖中培養基屬于________培養基。

(3)單克隆抗體與常規的血清抗體相比，最大的優越性是__________________。(4)動物細胞融合除了采用植物細胞原生質體融合常用誘導劑外，還可以采用____________。

(5)選出的雜交瘤細胞既具備骨髓瘤細胞______________________的特點，又具備漿細胞的________________________的特點。

(6)淋巴細胞是由動物體________中的________細胞分化、發育而來的。(7)雜交瘤細胞從培養基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是__________。答案

1．C 2．C 3．C 4．C 5．D 6．B 7．B 8．D 9．A

10．(1)限制性核酸內切酶(限制酶)DNA連接酶(2)

(3)細胞具有全能性 生長素和細胞分裂素(缺一不可)愈傷組織 細胞排列疏松而無規則，高度液泡化，呈無定形狀態的薄壁細胞

11．(1)平相同(2)提供RNA聚合酶識別和結合的位點，驅動基因轉錄 Ca2 DNA

＋－RNA分子雜交 胰島素原(蛋白質)(3)T-DNA 染色體

12．(1)動物細胞培養(2)選擇(3)特異性強，靈敏度高

(4)滅活的病毒(5)在體外大量增殖 分泌特異性抗體(6)骨髓 造血干(7)主動運輸

第二篇：細胞工程

正交試驗設計過程

對于單因素或兩因素試驗，因其因素少，試驗的設計、實施與分析都比較簡單。但在實際工作中，常常需要同時考察3個或3個以上的試驗因素，若進行全面試驗，則試驗的規模將很大，往往因實驗條件的限制而難于實施。正交試驗設計就是安排多因素試驗、尋求最優水平組合的一種高效率試驗設計方法。

一、正交試驗設計的概念及原理

1、正交試驗設計的基本概念

正交試驗設計是利用正交表來安排與分析多因素試驗的一種設計方法。它是由試驗因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進行試驗的，通過對這部分試驗結果的分析了解全面試驗的情況，找出最優的水平組合。

2、正交試驗設計的基本原理

在試驗安排中，每個因素在研究的范圍內選幾個水平，就好比在選優區內打上網格，如果網上的每個點都做試驗，就是全面試驗。如上例中，3個因素的選優區可以用一個立方體表示（圖10-1），3個因素各取3個水平，把立方體劃分成27個格點。若27個網格點都試驗，就是全面試驗。3因素3水平的全面試驗水平組合數為33=27，4因素3水平的全面試驗水平組合數為34=81，5因素3水平的全面試驗水平組合數為35=243，這在科學試驗中是有可能做不到的。正交設計就是從選優區全面試驗點（水平組合）中挑選出有代表性的部分試驗點來進行試驗。

3、正交表及其基本性質

3.1 正交表

由于正交設計安排試驗和分析試驗結果都要用到正交表，因此，我們先對正交表作一介紹。常用的正交表已由數學工作者制定出來，供進行正交設計師選用（詳見有關參考書）。正交表記號為La（bc），其中L代表正交表，a表示試驗的次數即行數，b表示因素的水平數，c表示因素的個數即列數。

3.2 正交表的基本性質

3.2.1正交性

?任一列中，各水平都出現，且出項的次數相等；

? 任兩列之間各種不同水平的所有可能組合都出現，且出現的次數相等；

3.2.2代表性

? 一方面，任一列的各水平都出現，使得部分試驗中包括了所有因素的所有水平；任兩列的所有水平組合都出現，使任意兩因素間的試驗組合為全面試驗。另一方面，由于正交表的正交性，正交試驗的試驗點必然均衡地分布在全面試驗點中，具有很強的代表性。因此，部分試驗尋找的最優條件與全面試驗所找的最優條件，應有一致的趨勢。

3.2.3綜合可比性

任一列的各水平出現的次數相等；任兩列間所有水平組合出現次數相等，使得任一因素各水平的試驗條件相同。這就保證了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干擾。從而可以綜合比較該因素不同水平對試驗指標的影響情況。

根據以上特性，我們用正交表安排的試驗，具有均衡分散和整齊可比的特點。?所謂均衡分散，是指用正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布是均勻的。

所謂均衡分散，是指用正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布是均勻的5、試驗結果分析

? 分清各因素及其交互作用的主次順序，分清哪個是主要因素，哪個是次要因素； 判斷因素對試驗指標影響的顯著程度； 找出試驗因素的優水平和試驗范圍內的最優組合，即試驗因素各取什么水平時，試驗指標最好； 分析因素與試驗指標之間的關系，即當因素變化時，試驗指標是如何變化的。找出指標隨因素變化的規律和趨勢，為進一步試驗指明方向； 了解各因素之間的交互作用情況； 估計試驗誤差的大小。

5.1直觀分析法——極差分析法

計算簡便，直觀，簡單易懂，是正交試驗結果分析最常用方法。

Rj為第j列因素的極差，反映了第j列因素水平波動時，試驗指標的變動幅度。Rj越大，說明該因素對試驗指標的影響越大。根據Rj大小，可以判斷因素的主次順序。

Kjm為第j列因素m水平所對應的試驗指標和，kjm為Kjm平均值。由kjm大小可以判斷第j列因素優水平和優組合。

5.1.1確定試驗因素的優水平和最優水平組合分析A因素各水平對試驗指標的影響。根據正交設計的特性，對A1、A2、A3、A4來說，四組試驗的試驗條件是完全一樣的（綜合可比性），可進行直接比較。如果因素A對試驗指標無影響時，那么kA1、kA2、kA3、kA4應該相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。說明，A因素的水平變動對試驗結果有影響。因此，根據kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判斷A1、A2、A3、A4對試驗指標的影響大小。由于試驗指標為產率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可斷定A2為A因素的優水平。

同理，可以計算并確定B、C、D因素的優水平。

5.1.1確定試驗因素的優水平和最優水平組合分析A因素各水平對試驗指標的影響。根據正交設計的特性，對A1、A2、A3、A4來說，四組試驗的試驗條件是完全一樣的（綜合可比性），可進行直接比較。如果因素A對試驗指標無影響時，那么kA1、kA2、kA3、kA4應該相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。說明，A因素的水平變動對試驗結果有影響。因此，根據kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判斷A1、A2、A3、A4對試驗指標的影響大小。由于試驗指標為產率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可斷定A2為A因素的優水平。

同理，可以計算并確定B、C、D因素的優水平。

5.1.2確定因素的主次順序

根據極差Rj的大小，可以判斷各因素對試驗指標的影響主次。極差越大的，該因素對產率的影響越大，反之越小。

5.1.3繪制因素與指標趨勢圖

以各因素水平為橫坐標，試驗指標的平均值（kjm）為縱坐標，繪制因素與指標趨勢圖。由因素與指標趨勢圖可以更直觀地看出試驗指標隨著因素水平的變化而變化的趨勢，可為進一步試驗指明方向。

最后得出試驗的最優組合和次優組合。

5.2方差分析

極差分析法簡單明了，通俗易懂，計算工作量少便于推廣普及。但這種方法不能將試驗中由于試驗條件改變引起的數據波動同試驗誤差引起的數據波動區分開來，也就是說，不能區分因素各水平間對應的試驗結果的差異究竟是由于因素水平不同引起的，還是由于試驗誤差引起的，無法估計試驗誤差的大小。此外，各因素對試驗結果的影響大小無法給以精確的數量

估計，不能提出一個標準來判斷所考察因素作用是否顯著。為了彌補極差分析的缺陷，可采用方差分析。

方差分析基本思想是將數據的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構造F統計量，作F檢驗，即可判斷因素作用是否顯著。

方差分析基本思想是將數據的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構造F統計量，作F檢驗，即可判斷因素作用是否顯著

5.2.1 偏差平方和

1616

nS總?（y?

n?1

2?y）?2

j2?n?12jyn?CT?IV2j2CT?G21616,G??n?1yn,f總?16?1?15S因素?Ij?II?III4?CT

Ij、IIj、IIIj、IVj分別表示第j列中1,2,3,4水平對應的試驗結果之和。

總偏差平方和＝各列因素偏差平方和+誤差偏差平方和。

5.2.2自由度

f總=試驗的次數-1；f因=因素的水平數-1。

5.2.3方差

A因素的方差=A因素的偏差平方和/A因素的自由度

誤差的方差=誤差的偏差平方和/誤差的自由度

5.2.4構造F統計量

5.2.5列方差分析表，作F檢驗

? 當FA>F0.01(f1，f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有高度顯著地影響，記作**。當F0.01(f1,f2)>FA>F0.05(f1,f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有顯著地影響，記作*。當F0.05(f1,f2)>FA>F0.10(f1,f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有一定的影響，記作*-。

查表可得F0.01(f1，f2)、F0.05(f1,f2)、F0.10(f1,f2)的值。

6、驗證試驗結果

經結果分析得出最優生產條件，進行最優試驗條件的驗證。

7、結論

通過了驗證試驗，最后可以得出結論。

1] 唐宗祥等.小麥成熟胚離體培養研究[J].植物學報,2003,5-6.[2] 騰世云,王殿久.小麥幼胚組織培養及其再生植株移栽條件的研究[J].植物生物學學報,1990,1：49-55.[3] 王亞馥,崔凱榮,陳克明,等.小麥幼胚培養中體細胞胚發生和植株再生[J].植物學通報增刊,1992,：29.[4] Larkin PJ,Pyan SA,Brettell RIS,et al.Heritable Sornaclonal Variation

in Wheat.Theor.Appl.Genet.1984,67：443-445.[5] Maddock SE.VA Lancaster,R,Risiott,et al,Plant Regeneration From Cultered Immature Embryos and Inflorescences of 25 Cultivars of Wheat.Journal of Erperimental Botany,1983,34(144):915-926.[6] 楊淑慎,郭振,徐虹.小麥胚愈傷組織的誘導和植株再生[J].西北農業學

報,2002,11(4):46-48.[7] 陳漳，來秀英.水稻種胚離體培養的遺傳研究[J].植物學報,l992,11:850-855.[8] 潘向群，梁海曼.大麥成熟胚培養的培養基研究[J].作物學報.1991.4:267-272.[9] 周洪生.甜玉米胚愈傷組織誘導、繼代、植株再生的研究[J].作物學

報,1993,1:55-61.[10] 柳建軍,于洪欣,馮兆禮.小麥成熟胚愈傷組織誘導及分化的研究[J].山東農業

大學學報,1996,4:451-456.[11] 梁竹青，高明尉.不同小麥基因型對體細胞組織培養的反應[J].中國農業科

學,1986,2:42-48.[12] 王大元.經濟作物組織培養[M].北京:科學出版社,1988:73-78.[作者簡介] 孫百虎（1981-）男，陜西西安人，助教，天津大學在讀碩士，研究方向：生物技術。

S因素

F因素?f因素S誤差

f誤差

第三篇：基因工程

寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

基因工程

摘要：基因工程是20世紀70年代在分子遺傳學、細胞生物學基礎上發展起來的，是一種可以按照人們的意愿設計、改造和組建生物品種的新技術。包括它通過基因操作，將目的基因活DNA片段與合適的載體連接轉入目標生物細胞，通過復制、轉錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質的活性表達，使轉基因生物獲得新的遺傳性狀。

關鍵詞：生物技術；基因工程

一、基因工程的誕生：

從20世紀40年代開始，受分子生物學、分子遺傳學發展的影響，基因分子生物學取得巨大進步，為基因工程的誕生奠定了基礎?，F在人們公認的誕生日期是1973年，其中現代分子生物學領域上的三大發現及技術上的三大發明起了決定性作用。

理論上的三大發現包括：第一，20世紀40年代，Avery 在美國的一次學術會上報道了肺炎球菌的轉化，證明了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的雙螺旋結構以及半保留復制機理，解決了基因的自我復制和傳遞問題；第三，20世紀50年代末的“中心法則”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操縱分子學說，并成功的由一批科學家破譯了遺傳密碼從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。

以上問題的解決使得人們自主改造生物遺傳性狀從理論上成為現實。

技術上的三大發明：第一，1967年發現的DNA連接酶，以及1979年發現的具有更高活性的T4 DNA連接酶。在1970年Smith和 Wilcox從流感嗜血桿菌中分離并純化的限制性核酸內切酶HindⅡ和1972年發現的EcoRⅠ核酸內切酶。后來發現的大量的限制性核酸內切酶。第二，一些病毒、質粒和噬菌體等載體技術的發現使把目的基因的導入更加容易。第三，DNA分子序列分析及瓊脂糖凝膠電泳、Southern雜交技術的發展使得基因工程的誕生越來越近。1973年，斯坦福大學將抗四環素質粒和抗新霉素的質粒用限制性內切酶切割并連接成重組質粒導入到大腸桿菌中是基因工程誕生的標志。

二、基因工程有幾個重要特征：（1）、打破了物種的界限，實現跨物種的基因轉移；（2）、通過已知功能基因的遺傳轉化，進行物種的定向改良；（3）、創造出自然界中本來不存在的物種。

三、基因工程技術流程包括：（1）、目的基因克隆，即從特定生物基因組和cDNA中分離提純和擴大繁殖目的基因；（2）、選擇合適的載體，并對載體DNA進行克隆；（3）、將目的基因與載體寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

連接；（4）、將重組DNA導入到大腸桿菌或酵母菌體內培養；（5）、利用載體上的標記基因進行篩選，獲得轉目的基因的細胞或植株。

四、基因工程的應用：

（1）基因工程應用于農業生產方面：農業領域是目前轉基因技術應用最為廣泛的領域之一。農作物生物技術的目的是提高作物產量，改善品質，增強作物抗逆性、抗病蟲害的能力?；蚬こ淘谶@些領域已取得了令人矚目的成就。

（2）基因工程應用于醫藥方面：目前，以基因工程藥物為主導的基因工程應用產業已成為全球發展最快的產業之一，發展前景廣闊?；蚬こ趟幬镏饕毎蜃?、抗體、疫苗、激素和核苷酸藥物等。它們對預防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內的各種傳染病、類風濕疾病等有重要作用。在很多領域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統化學藥物難以達到的作用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類利用基因工程技術研制成的多功能細胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發性硬化癥和類風濕關節炎等多種疾病。

（3）基因工程應用于環保方面：基因工程技術可提高微生物凈化環境的能力。美國利用DNA重組技術把降解芳烴、萜烴、多環芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接，轉移到某一菌體中構建出可同時降解4種有機物的“超級細菌”，用之清除石油污染，在數小時內可將水上浮油中的2/3烴類降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達成功。它能釘死蚊蟲與害蟲，而對人畜無害，不污染環境?，F已開發出的基因工程菌有凈化農藥的DDT的細菌、降解水中的染料、環境中有機氯苯類和氯酚類、多氯聯苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸藥的工程菌及用于吸附無機有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90年代后期問世的DNA改組技術可以創新基因，并賦予表達產物以新的功能，創造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細菌的基因通過PCR技術全部克隆出來，再利用基因重組技術在體外加工重組，最后導入合適的載體，就有可能產生一種或幾種具有非凡降解能力的超級菌株，從而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性問題：

自基因工程誕生以來，基因工程的安全性問題就受到人們極大的關注，關于重組DNA潛在的危險性問題的爭論，在基因工程還處于醞釀階段的時候就已經開始。爭論的焦點是擔心基因工程寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：的雜種生物會從實驗室溢出，在自然界造成難以抑制的災難，有害的雜種菌或病毒與化學物質不同，它們會在自然界不斷繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美國國立衛生研究院（NIH）在加利福尼亞州的Asilomar 會議中心內，160名來自美國和16個國家的專家學者對重組DNA的危害辯論，雖然與會代表分歧挺大，但最后也達成了一些重要的共識，在1976年6月23日美國NIH制定并公布了《重組DNA研究準則》。為了避免可能造成的危害，除了規定禁止若干類型的重組DNA實驗外，還制定了許多具體的規定條文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技術是繼工業革命、信息革命之后 對人類社會產生深遠影響的一場革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療、基因芯片和基因克隆等技術方面取得的革命性成果，將極大地改變人類生命和生活面貌。

參考文獻：

1、基因工程/樓士林，楊盛昌，龍敏南等主編.—北京：科學出版社，2002

2、基因工程技術/鐘衛鴻主編.—北京：化學工業出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主編.—北京：科學出版社，2008

4、基因工程原理與技術/劉志國主編.—2版.—北京：化學工業出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法與應用/徐煜泉等編著.—北京：北京大學出版社，2008.12

第四篇：基因工程

《基因工程論文》

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構建

學

院：生命科學學院 班

級：生物技術12-2 學

號：7011208209 姓

名：陳 昆 任課教師：張銳

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構建

摘要﹕從以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長的解烴菌———地芽孢桿菌MD-2細胞中獲得了1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA。將基因sladA克隆到質粒pSTE33上,構建了重組質粒pSTalk。通過電轉化將pSTalk轉化入嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3內,構建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜熱和解烴的功能,在70℃條件下,14d后對原油的降解率達75.08%。研究結果表明,可以通過體外重組的方式向嗜熱菌中引入烴降解基因,從而構建嗜熱解烴基因工程菌。關鍵詞:微生物采油;烴類降解菌;嗜熱解烴基因;質粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要機理之一。研究結果表明,在解烴菌作用下原油的族組分發生變化,輕質組分增加,粘度下降,改善了原油的流動性;同時,解烴菌還可以將烴類分子轉化成有機溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅油物質。迄今為止,從自然界篩選的高效解烴菌絕大多數為嗜溫微生物,最適合生長溫度一般為20-45℃,很難適應油藏的高溫環境。筆者從1株解烴菌細胞中分離出1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段將此基因轉化到另外1株最適合生長溫度為70℃的嗜熱菌體內,構建了嗜熱解烴基因工程菌SL-21。該基因工程菌既具有高效的解烴功能,又能適應油藏高溫環境,在微生物采油中具有良好的應用前景。1.1 實驗材料

實驗材料包括限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR片斷回收試劑盒;大腸桿菌感受態細胞E.coliDH5α;pGEM-T easy載體;質粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培養基按文獻配制。無機鹽培養基組成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸餾水100mL;pH值為7.2。嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3,分離自勝利油區孤島油田中一區館3區塊采出液,最適合生長溫度為70℃;地芽孢桿菌MD-2,以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長,分離自勝利油區原油污染土壤。1.2 實驗方法

DNA的操作 基因組DNA小量提取,利用聚合酶鏈式反應(PCR)對DNA擴增、PCR產物的回收、酶切與連接,質粒DNA提取和基因序列測定等均按文獻[13-14]方法進行。菌株培養 所涉及到的菌株培養均在溫度為70℃,轉速為180r/min的條件下進行振蕩培養。基因工程菌的構建和篩選方法 ZJ-3感受態細胞的制備按文獻[13-14]方法進行。用構建的重組質粒pSTalk在最佳條件下電轉化ZJ-3感受態細 胞構建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB瓊脂平板上挑選10個陽性克隆接種到5mL LB培養基中,培養過夜,獲得種子液。將該種子液接種到200mL以液蠟為惟一碳源的無機鹽培養基中,培養5d后用CCl4抽提剩余的液蠟,用紅外測油儀測定烴的剩余量,根據菌株降解液蠟的速率篩選出目的基因工程菌。基因工程菌的誘導表達及SDS-PAGE檢測挑取陽性克隆接種于含100μg/mL Amp的10mL的LB液體培養基中,180r/min下振蕩培養至光密度值達到0.6(檢測光波波長為600nm),加誘導物IPTG至終濃度為1mmol/L,振蕩培養8h,收集表達菌體,加SDS上樣緩沖液,于100℃水浴10min后上樣,用12%的SDS-PAGE電泳檢測?；蚬こ叹涤湍芰y試 將基因工程菌接入20mL LB培養基中,培養12h,以5 000r/min的速度離心5min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌菌體1次,加20mL無菌生理鹽水懸浮,作為菌株利用烷

烴生長的種子液。取菌懸液按1%接種量接入200mL無機鹽培養基中,加入2%孤島油田中一區館3區塊原油或2%的液體石蠟作為惟一碳源培養,取樣稀釋涂布計數。原油降解實驗 在無機鹽培養基中添加2%的原油,按1%接種量接入基因工程菌,培養14d。用正己烷萃取降解后的原油,用氣相色譜儀測定原油飽和烴組分的降解情況。原油降解率為菌株降解前、后原油量的差值與菌株降解前原油量的比值。2 實驗結果與分析

2.1 MD-2基因組DNA的檢測

對MD-2基因組進行提取和純化。提取后的染色體DNA經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,相對分子質量不小于23kb,說明提取的DNA完好。在檢測光波波長為260280nm條件下分別測出DNA的光密度,其比值為1.95,換算出DNA的質量濃度為1 400g/mL,表明DNA純度較好,無蛋白、RNA、酚和多糖物質的干擾。2.2 烷烴單加氧酶基因的克隆與序列分析依據美國國立衛生研究院基因序列數據庫(Genbank)中的烷烴單加氧酶基因開放閱讀框兩端保守序列,設計了一對兼并引物以MD-2基因組DNA為模板進行PCR擴增,將約1.3kb的PCR產物回收后連接到pGEM-T easy載體上,轉入E.coliDH5α,挑取陽性克隆質粒進行測序。測序結果經Genbank檢索,表明該DNA序列是個新的烷烴單加氧酶基因,命名為sladA。2.3 基因工程菌的構建及篩選

通過PCR擴增sladA后,將PCR產物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分離純化出1 329bp的片斷,與經EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33質粒連接,構建成含sladA的重組質pSTalk。經電泳鑒定表明(圖1),重組質粒構建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的誘導表達

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE圖譜可見(圖2),在烷烴單加氧酶基因sladA對應蛋白大小的地方掃描到高信號強度,表明sladA基因在SL-21中得以表達。2.5 基因工程菌SL-21碳源生長

基因工程菌SL-21在以原油和液體石蠟為惟一碳源的無機鹽培養基中培養,在70℃和180r/min條件下,經過3d的延滯期后進入對數期,菌體數增加。17d后,菌體數為接菌初期的5倍,表明SL-21能夠利用原油或液體石蠟作為惟一碳源生長。2.6 對原油的降解作用

由原油飽和烴組分的降解情況可看出(圖3),基因工程菌對原油有很明顯的降解效果,幾乎將飽和烴降解完全。經對氣相色譜各峰面積對比,計算出各峰面積的含

量和飽和烴組分降解率(表2)?；蚬こ叹鶶L-21對原油的降解率為75.08%。

實驗結果表明,烴類降解菌地芽孢桿菌MD-2細胞提取的烷烴單加氧酶基因sladA可以在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中表達。但不同的基因工程菌株中烷烴單加氧酶基因sladA表達的效率不同,需要通過菌株對原油的降解評價進一步篩選。獲得的對原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高溫條件下生長,并且對原油降解效果明顯。因此以體外重組方式向嗜熱菌中引入烴類降解基因構建嗜熱解烴基因工程菌在技術上是可行的。3 結論

以地芽孢桿菌MD-2為目標菌株,克隆和表達了降解長鏈烷烴的單加氧酶基因sladA,并在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中正確表達了基因sladA,構建了基因工程菌SL-21。基因工程菌SL-21在70℃條件下,能以原油或液體石蠟為惟一碳源生長。14d對原油的降解率為75.08%,對原油飽和烴組分均有明顯的降解效果。該基因工程菌既可以用于微生物驅油技術,又可以用于高溫油田污水的生物處理。利用基因工程的方法可以獲得既能耐受極端環境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌種選育的重要方向。參考文獻: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烴降解菌的篩選及性能研究[J].大慶石油地質與開發,2007,26(6):119-123.[2] 汪衛東,汪竹,耿雪麗,等.美國微生物采油技術現場應用效果分析[J].油氣地質與采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁長忠,宋永亭,段傳慧.微生物采油用營養物質在石英砂上的靜態和動態吸附規律[J].油氣地質與采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龍,董漢平,俞理,等.微生物提高采收率數值模擬研究現狀[J].油氣地質與采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花麗.本源微生物降解原油的飽和烴色譜分析[J].油氣地

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第五篇：基因工程

基因工程技術的程序與應用

【摘要】基因工程技術是一項正在蓬勃發展的技術，它將給人類社會帶來一場深刻的變革，我們有必要了解基因工程的概念、原理、技術程序，以及基因工程在農業、工業、醫藥等方面的應用和進展情況。

【關鍵詞】基因工程技術程序應用進展

基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，在分子水平上對基因進行復雜的操作，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當的工具酶進行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新技術。它克服了遠緣雜交的不親和障礙。基因工程技術為基因的結構和功能的研究提供了有力的手段。

一 基因工程的技術程序

基因工程的基本原理是在體外將不同來源的DNA進行剪切和重組，形成鑲嵌DNA分子，然后將之導入宿主細胞，使其擴增表達，從而使宿主細胞獲得新的遺傳特性，形成新的基因產物。它有3個基本的步驟：①從合適材料分離或制備目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段與載體連接作成重組DNA分子。③重組DNA分子引入宿主細胞，在其中擴增和表達。不同種類生物的生物學特性不同，其基因工程在操作上和具體技術上必然有所差異，但技術核心都是DNA的重組，即利用一系列的DNA限制性內切酶、連接酶等分子手術工具，在某種生物DNA鏈上切下某個目標基因或特殊的DNA片段，然后根據設計要求，將其接合到受體生物DNA鏈上。

一個完整的用于生產生產目的的基因工程技術程序包括的基本內容有：①外源目標基因的分離、克隆以及目標基因的結構與功能研究。②適合轉移、表達載體的構建或目標基因的表達調控結構重組。③外源基因的導入。④外源基因在宿主基因組上的整合、表達及檢測與轉基因生物的篩選。⑤外源基因表達產物的生理功能的檢定。⑥轉基因新品系的選育和建立以及轉基因新品系的效益分析。⑦生態與進化安全保障機制的建立。⑧消費安全評價。

（一）外源目標基因的分離、克隆及功能結構分析

獲合乎人類某種需要的取目的基因是實施基因工程的第一步，也是開展一項基因工程的前提和全部工作的核心。目前人們已經能夠通過多種途徑和方法來獲取目標基因，其中主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。

直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（在遺傳學中叫做擴增），1

從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。用鳥槍法獲得目的基因的優點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉錄成的信使RNA為模版，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據已知的蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對的原則，推測出它的基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。

（二）構建能在受體生物細胞中表達的重組目標基因

要使一個外源目標基因能整合到受體細胞的基因組中并能在整合后在受體基因組的調控下有效地轉錄和翻譯，就必須事先對目標基因的功能結構用DNA重組技術進行適當的修飾，也就是將目標基因與一種特別的DNA分子重組，這種特別的DNA分子稱為基因載體，目前所用的載體主要有以下幾類：質粒、λ噬菌體、柯斯質粒、病毒載體、YAC載體等，各類載體具有獨特的生物學特性，可用于不同的目標基因。

（三）外源重組目標基因的導入

將重組的外源目標基因轉入到宿主細胞中的過程稱為基因導入或基因轉移。接受外源基因的細胞稱為受體細胞。由于受體生物學特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因導入的方法也不同，有的是用載體導入，有的是直接用物理的方法導入。目前使用的有轉化、轉染、電穿孔導入法、基因槍射入法、顯微注射法、脂質體介導法等，向細菌等微生物中導入外源目標基因常用質粒轉化和噬菌體轉染方法；向植物細胞中導入外源基因常用基因槍注入法和Ti質粒導入法；能由原生質體再生出植株的植物細胞還可以用電穿孔導入法及脂質體融合法；動物的受精卵一般通過人工顯微鏡注射法導入外源基因；動物的體細胞可用電穿孔法和病毒轉染法導入外源基因，但對用于生產目的的基因工程常常避免用病毒轉染法。

（四）轉基因細胞或個體的鑒別和篩選

在對宿主的細胞進行了外源目標基因導入處理以后，有些細胞可能并沒有外源基因的進入，另有一些細胞可能在外源基因進入后因各種原因而不能使外源基因表達，因此必須對被進行了基因轉移處理的細胞或個體進行鑒別，以篩選出導入外源目標基因的轉基因細胞或個體。鑒別和篩選轉基因生物一般在兩個層面上進行：一是檢測目標基因是否表達，二是檢測目標基因是否整合到了宿主的染色體上和能否穩定傳代。表達檢測的方法主要有轉錄產物的印跡雜交法、免疫印跡檢測法、免疫組織化學檢測法等。整合檢測可通過DNA分子雜交來確定。

（五）轉基因品系的效益分析。

一個生產性能優越的轉基因品系，首要的條件是目標基因的表達產物必須有正常的生理功能，另一個必要標志是其目標基因必須有適度的高效表達特性和可持續生產能力。

（六）生態與進化安全保障

由于轉基因生物與其他生物一樣具有可遺傳、易擴散及自主的特性，而且人類對生命、生態系統、生物的演化實際上還知之甚少，對不同物種間基因的人工組合，外源基因對受體生物進化的可能影響，轉基因生物對生態系統的長期影響

等都無法進行評估，因此如果人們不事先采取控制措施，轉基因生物一旦進入到自然環境中就可能打破生態平衡，破壞生態環境和自然種質資源。對轉基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通過各種嚴格的管理措施和物理屏障盡量使轉基因生物不能從實驗室逃逸進入到自然環境里去；生物的方法一般就是造成轉基因生物與非轉基因生物之間的生殖隔離，如利用三倍體不育的特性將用于生產的轉基因動物或植物變成三倍體等。

（七）消費安全評價

消費安全評價一般要考慮以下一些主要的方面：①導入外源目標基因本身編碼的產物是否安全。②外源目標基因是否穩定。③使用的載體是否安全。④使用的報道基因（就是能產生很容易觀察的性狀的基因）是否會產生有害物質。⑤外源基因導入后是否會誘導受體生物產生新的有害遺傳性狀或不利于健康的成分。為了保護人類的健康，許多國家都已通過立法或其他形式對轉基因產品進行消費安全評價和嚴格的管理，對進口轉基因食品嚴格限制。

二 基因工程的應用

基因工程在醫藥業中的應用。許多藥品的生產是從生物組織中提取的。受材料來源限制產量有限，其價格往往十分昂貴。微生物生長迅速，容易控制，適于大規模工業化生產。若將生物合成相應藥物成分的基因導入微生物細胞內，讓它們產生相應的藥物，不但能解決產量問題，還能大大降低生產成本。如基因工程胰島素、干擾素、人造血液、白細胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實現工業化生產，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發揮了重大的作用。

基因診斷與基因治療。遺傳病是長期困擾人類的一類不治之癥，迄今已發現的有3000多種。其根源于遺傳基因存在缺陷，主要特征是可隨生育而傳代。基因治療是把正常基因導入病人體內，使該基因的表達產物發揮功能，從而達到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段?；痉椒ㄊ牵夯蛑脫Q、基因修復、基因增補和基因失活等。如運用基因工程設計制造的“DNA探針”檢測肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷，不但準確而且迅速。通過基因工程給患有遺傳病的人體內導入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。

基因工程在農牧業、食品工業上的應用。運用基因工程技術，不但可以培養優質、高產、抗性好的農作物及畜、禽新品種，還可以培養出具有特殊用途的動、植物。如轉基因魚（生長快、耐不良環境、肉質好），轉基因牛（乳汁中含有人生長激素），轉黃瓜抗青枯病基因的甜椒，轉魚抗寒基因的番茄，轉黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯，不會引起過敏的轉基因大豆，抗蟲棉等。

基因工程在環境保護工業方面的應用?；蚬こ套龀傻腄NA探針能夠十分靈敏地檢測環境中的病毒、細菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分靈敏地反映環境污染的情況，卻不易因環境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉化污染物。如有一種超級細菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。這種超級菌是美國科學家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一個菌株內而產生的。

總之，基因工程的發展將會給人類社會帶來巨大的變化。

三 基因工程的進展狀況

基因工程技術是一項正在蓬勃發展的技術，而且也已經取得了許多重要的應用成果，但我們也應該看到，基因工程技術不是一項已經成熟的技術，仍然還很粗糙和原始，在許多方面尚需完善和改進。

1．基因工程在技術上存在一定的不確定性和盲目性。目前的基因工程在技術上有很多的不確定性。這種不確定性表現在兩個方面，一是技術方面的不穩定性，二是由于對不同生物的生理特性的了解不很深入，如我們將魚類抗凍蛋白基因轉移到不抗寒的羅非魚等熱帶魚中，雖然抗凍蛋白基因得到表達，但并沒有使受體魚產生預期的抗寒效果。目前我們所進行的基因工程基本上只能對簡單的、單基因控制的性狀進行設計和改造，操作對象只限于一些比較簡單的單因子基因。但生物絕大部分的重要性狀是由多個基因共同控制的，對這些多基因控制的性狀，現有的基因工程技術幾乎仍然是束手無策。我們對活的生物體中基因表達調控的機制知之甚少，有關的知識僅限于對啟動子和增強子有所了解，對生物體整體的調節復雜性的認識還剛剛開始。

2．在安全性方面存在著不確定性。對社會大眾來說，最主要和最關心的是基因工程的安全性問題，基因工程的安全性問題包括兩個方面：一是基因工程產品的消費安全問題，二是轉基因生物的生態安全問題。目前用轉基因技術生產出來的食品因其成分的某些改變是否會對人類的健康產生不良的影響，這需要實驗和時間來驗證。有著某種生存優勢的轉基因生物如果進入到自然生態系統，就有可能排擠自然種群，降低生態系統里物種的多樣性，打破生態平衡。

所以我們在大力發展轉基因技術的同時，必須高度重視對轉基因動物、植物及微生物品種的生物控制和控制技術的研究。在轉基因品種的安全性沒有進行全面的評估和沒有可靠的生物控制措施之前，應嚴格禁止其進行生產和進入開放的自然生態系統，只有其生態安全性達到了傳統育種方法培育的新品種時，或無生殖能力的轉基因動物和植物才能允許進入自然界進行生產，也只有這樣才是有益于人類和社會進步的。

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