第一篇：基因工程教學大綱

基因工程教學大綱

課程性質：專業課

課程教學目的：基因工程是分子生物學和分子遺傳學等學科綜合發展的基礎上，于上個世紀70年代誕生的一門新的生物技術科學。它的創立和發展，直接依賴于基因分子生物學的進步，兩者之間有著密切而不可分割的內在關系。通過基因工程的教學，達到如下教學目的：

1.使學生了解和掌握基因工程的基本概念和原理； 2.使學生了解基因操作的主要技術原理和應用； 3.使學生了解基因工程的研究內容和操作規程； 4.使學生初步掌握基因工程基本的實驗操作技術。課程教學原則與教學方法：

采用多媒體教學方法，并在教學過程中有機地結合以下幾個基本教學原則。

1.突出直觀教學的原則。通過多種直觀教學形式如觀察、實驗、電影、投影、錄相等，來豐富學生的直接經驗和感性認識。

2.理論聯系實際原則。在講授理論之基礎上，通過具體的實驗操作使學生了解和掌握基因工程的基本操作技術和過程。

3.注重學生學習科學過程的原則。教學要將重點放在學生的學習過程上，而不是放在學習內容上，要讓學生了解基因工程的科學過程。

4.既教書又育人的原則。教學過程中結合教學內容，對學生進行辨證唯物主義教育、愛國主義教育、職業道德教育等。

課程總學時：58學時；

課程教學內容要點及建議學時分配：

（一）教學內容要點

第一章 基因工程及其主要的研究內容

第一節 基因工程的誕生

1.理論基礎 2.標志性研究

第二節 基因工程與相關學科之間的關系 第三節 基因工程的重要歷史事件

第四節 基因工程的基本概念和主要的研究內容

1.遺傳工程與基因工程 2.克隆與基因克隆 3.主要的研究內容和步驟 第五節 基因工程的安全性 1.基因工程的安全問題 2.物理防護標準 3.生物防護標準 第六節 基因工程的應用和展望

第二章 基因工程的主要技術原理

第一節 核酸的凝膠電泳

1.基本原理

2.瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰氨凝膠電泳 第二節 核酸的分子雜交

1.基本原理

2.southern印記雜交和northern印記雜交 3.菌落（或噬菌斑）雜交 第三節 細菌的轉化

1.肺炎球菌的轉化 2.大腸桿菌的感受態 3.大腸桿菌的轉化 第四節 DNA核苷酸序列分析

1.雙脫氧測序 2.化學法測序 3.序列測定的自動化 第五節 基因的定點誘變

1.盒式誘變 2.寡核苷酸引物誘變

第六節 研究DNA與蛋白質相互作用的方法

1.凝膠阻滯試驗 2.DNaseI足跡試驗

第七節 聚合酶鏈式反應技術與基因擴增

1.PCR技術的基本原理和特點 2.Taq DNA聚合酶 3.寡核苷酸引物 4.PCR技術的應用

第三章 基因工程的酶學基礎

第一節 核酸限制性內切酶與DNA分子的體外切割

1.寄主控制的限制與修飾現象 2.限制性內切酶的類型和基本特性 3.II型限制性內切酶的基本特性 4.核酸限制性內切酶的命名法 5.影響限制酶活性的因素

第二節 DNA連接酶與DNA分子的體外連接

1.DNA連接酶

2.粘性末端和平末端的連接 第三節 DNA聚合酶

1.DNA聚合酶與缺口平移法制備核酸雜交探針 2.Klenow酶和DNA末端標記

3.T4DNA聚合酶和取代合成法標記DNA片段 4.逆轉錄酶與cDNA的合成 第四節 DNA及RNA的修飾酶

1.末端轉移酶與同聚物加尾 2.T4多核苷酸激酶與5末端的標記 3.堿性磷酸酶與DNA脫磷酸作用 第五節 核酸外切酶 第六節 單鏈核酸內切酶

第四章 基因克隆的載體

第一節 質粒載體

1.質粒的一般生物學特性 2.質粒DNA的復制與拷貝數的控制 3.質粒DNA的分離與純化 4.質粒載體的類型 5.重要的大腸桿菌質粒載體 6.質粒載體的穩定性問題 第二節 噬菌體載體

1.雙鏈噬菌體載體—λ噬菌體載體 2.單鏈噬菌體載體—M13噬菌體載體 第三節 柯斯質粒載體和噬菌粒載體簡介

1.柯斯質粒載體 2.噬菌粒載體

第五章 基因克隆與鑒定

第一節 DNA克隆片段的產生與分離

﹩1.基因組DNA的片段化 2.DNA片段的大小分布

第二節 重組體DNA分子的構建及導入受體細胞

1.外源DNA片段同載體分子的連接重組 2.重組體分子導入受體細胞的途徑 第三節 基因克隆的實驗方案

1.互補作用基因克隆 2.cDNA克隆 3.基因組DNA克隆 第四節 克隆基因的分離

1.應用核酸探針分離克隆的目的基因

2.應用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因 3.應用mRNA差別顯示技術分離克隆的目的基因 4.應用表達文庫分離克隆的目的基因 第五節 重組體分子的選擇和鑒定

1.遺傳檢測法 2.物理檢測法

3.菌落或噬菌斑雜交篩選法

（二）建議學時分配

第一章 基因工程及其主要的研究內容 4學時 第二章 基因工程的主要技術原理 8學時 第三章 基因工程的酶學基礎 8學時 第四章 基因克隆的載體 12學時 第五章 基因克隆與鑒定 12學時

課程的實踐教學環節要求：實驗課在理論課講授完之后集中進行，每組原則上不超過20人。由于基因工程實驗耗時長、所需儀器設備及試劑藥品多而復雜等特點，實驗課的開設情況根據實驗條件允許進一步調整。在本院實驗條件允許的情況下，將以基因工程大實驗的方式連續進行，正取一周內集中完成。教材與主要教學參考書：

1.尹俊、邢萬金、恩和巴雅爾、劉麗華編著。基因工程.呼和浩特。內蒙古大學出版社2006.9 2.吳乃虎 編著.基因工程原理（第二版）.北京，科學出版社.1998.3 3.陸德如，陳永青 主編.基因工程.北京，化學工業出版社.2002.7 4.薩木布魯克等編著，金冬雁等譯，分子克隆實驗指南（第三板）.北京，科學出版社.2002 5.奧斯伯等 編著（美），顏子穎、王海林譯.精編分子生物學實驗指南.北京，科學出版社1998.6 6.第四軍醫大學分子生物學教研室等制作.分子生物學多媒體教程—PCR理論、實踐與應用.北京，高等教育出版社.1998 7.英國皇家醫學院制作，軍事醫學科學院譯.遺傳工程實驗技術錄象教材.1994 課程考試與評估：

1．平時成績占40%，其中：作業和平時測驗30% + 考勤10%，期末考試占60%，閉卷考試。

2．評估：系教學委員會和教研室不定期對教師的講授情況以聽課、與學生座談等方式進行了解并作出評估，并與學生的評估結果結合，作出綜合評估。

（執筆人：恩和巴雅爾）

第二篇：基因工程藥物教學大綱（范文）

基因工程藥物教學大綱

課程名稱：基因工程藥物

課程編號：0235203 學分：1.5 學時數：28

考核方式：N+2。筆記10%，考試成績占40%，過程成績N占50%。先修課程：生物化學、微生物學、基因工程等。課程說明：專業選修課。

一、課程的性質

基因工程技術, 不僅使整個生命科學的研究發生了前所未有的深刻變化, 而且也給工農業生產和國民經濟發展帶來了巨大的經濟和社會效益, 給人類進步帶來了新的契機。目前，基因工程學正以新的勢頭繼續向前迅猛發展, 成為當今生物科學研究諸領域中最具生命力、最引人注目的前沿學科之一, 特別是基因工程在醫藥生物技術領域中的研究和應用，其意義深遠、潛力之巨大。

二、課程的目的與教學基本要求

課程目的：為了適應生物工程技術的迅速發展、拓寬專業面, 為了使學生對當今世界生物工程領域日新月異地發展的高新技術有更多的了解, 進一步擴大學生的知識面和視野，同時為他們今后從事這方面的工作和研究打下一定理論基礎, 特開設該課程。

課程任務: 通過講授基因工程制藥的概貌及國內外研究進展、基因工程制藥常用的工具酶和克隆載體、基因工程藥物無性繁殖系的組建以及基因工程藥物的生產和質量控制等, 使學生對基因工程的基本理論、基本步驟和操作技術以及基因工程藥物的生產技術原理和方法有比較系統的了解, 初步掌握基因工程制藥有關基本知識。

三、課程適用專業

本課程適用于生物技術專業等相關專業。

四、教學內容、要求與學時分配

第一章 基因工程制藥概述(2學時)

第一節：基因工程的概貌 簡述基因工程的誕生和興起，基因工程的定義、特點與基本步驟，基因工程早期的開創性研究成就，基因工程的應用與發展趨勢等。

第二節：基因工程與生物制藥 簡述基因工程藥物的研究和發展概況，介紹應用基因工程和蛋白質工程技術研究開發的幾種新型基工藥物。

第二章 基因工程制藥常用的工具酶(2學時)

第一節：限制性核酸內切酶 簡述限制酶的發現、限制酶的種類、限制酶的命名和限制酶的特性與用途等。

第二節 DNA連接酶 重點介紹DNA連接酶連接作用的特點，基因工程中常用的連接酶(T4噬菌體DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶)的酶活性和用途，DNA連接酶連接作用的分子機理。

第三節 DNA聚合酶 重點介紹大腸桿菌DNA聚合酶

1、Klenow大片段酶、T4噬菌體DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及、反轉錄酶等的酶活性和用途。

第四節 DNA修飾酶 重點介紹末端脫氧核苷酸轉移酶、堿性磷酸酶、T4噬菌體多核苷酸激酶等的酶活性和用途。

第五節 單鏈核酸內切酶 重點介紹S1核酸酶、Bal31核酸酶等的酶活性和用途。

第三章 基因工程制藥常用的克隆載體(4學時)第一節 質粒載體 內容：質粒的定義、質粒DNA分子的特性、質粒載體的改造及構建。重點介紹基因工程制藥中常用的幾種質粒載體的結構和用途，主要包括pBR322及其衍生栽體、pUC系列載體。

第二節 λ噬菌體載休 內容：λ噬菌體的基本特性、λ噬菌體基因組的結構與功能、λ噬菌體DNA的改造及其載體的構建。重點介紹基因工程制藥中常用的幾種λ噬菌體載體，主要包括 Charon系列載體、EMBL系列載體、λgt系列載體。

第三節 M13噬菌體載體 內容包括：M13噬菌體的基本特性、M13絲狀噬菌體載體的構建、常用的M13噬菌體載體，主要包括M13mp18和M13mp19載體。

第四節 粘粒（Cosmid）載體 內容：粘粒載體的構建、常用的粘粒載體。

第五節 哺乳動物細胞載體系統 主要介紹：SV40載體、BPV載體、EBV病毒載體。

第四章 目的基因的制取(2學時)

第一節 目的基因的化學合成 內容：目的基因的設計, 寡聚核苷酸片段的合成, 寡核苷酸片段的分離和純化, 用寡核苷酸片段組裝目的基因, 化學合成寡核苷酸的其它用途。

第二節 構建基因文庫法分離目的基因 內容：構建基因文庫法分離目的基因的基本步驟, 真核基因組DNA文庫的構建過程

第三節 酶促合成法制取目的基因 內容：真核生揚細胞中的mRNA, 從構建 的cDNA文庫中篩選目的cDNA, RT-PCR法合成目的cDNA。

第五章 目的基因與克隆載體的體外重組(2學時)

第一節 目的基因與質粒載體的連接 內容：粘性末端連接法, 定向克隆法,平末端連接法, 同聚物加尾法, 加人工接頭連接法, 加DNA銜接物連接法, 其它轉換末端形式連接法。

第二節 目的基因與噬菌體載體的連接 內容包括：噬菌體載體臂DNA的制備, 噬菌體載體臂與外源目的DNA片段的連接。

第六章 重組克隆載體引入受體細胞(2學時)

第一節 概述 內容：基因工程的受體細胞, 重組體分子導入受體細胞的途徑。

第二節 重組體DNA分子的轉化或轉染 內容包括：用氯化鈣制備新鮮的感受態細胞轉化法, 用復合劑制備感受態細胞轉化法, 高壓電穿孔轉化法。

第三節 重組噬菌體DNA的體外包裝與轉染 內容：噬菌體體外包裝的基本原理, 噬菌體DNA的體外包裝, 包裝提取物的制備, 重組DNA的體外包裝與感染方法。

第四節 重組克隆載體導入哺乳動物細胞的轉染

第七章 含目的基因重組體的篩選、鑒定與分析(6學時)

第一節 重組體(菌)的篩選 內容：抗生素抗性基因插入失活法, b-半乳糖苷酶 基因插入失活法, 快速細胞破碎與凝膠電泳篩選法, 放射性標記核酸探針雜交篩選法, 免疫化學篩選法。

第二節 重組體的鑒定 內容：酶切及凝膠電泳鑒定法, Southern印跡雜交法, 電鏡R-環檢測法, 基因產物鑒定法。

第三節 重組DNA的序列分析 內容：Sanger雙脫氧鏈終止法DNA測序, Maxam-Gilbert化學修飾法DNA測序。

第八章 目的基因在宿主細胞中的表達(2學時)

第一節 外源目的基因在原核細胞中的表達 內容：原核基因表達載體的構建, 常見的原核細胞表達載體系統, 外源目的基因在原核細胞中的表達形式, 在原核細胞中高效表達目的基因, 基因定點誘變技術。

第二節 外源目的基因在真核細胞中的表達 內容：真核細胞表達載體的功能元件, 酵母菌表達系統, 哺乳動物細胞表達系統。

第九章 基因工程無性繁殖系的組建(2學時)

內容：人胰島素原融合蛋白重組菌的組建, 人a2b型干擾素工程菌的組建, 集落刺激因子工程菌的組建, 白細胞介素融合蛋白工程菌的組建, 乙型肝炎表面抗原重組酵母的組建, 人組織型纖溶酶原激活劑細胞株的組建, 紅細胞生成素CHO細胞株的組建, 人腫瘤壞死因子昆蟲細胞株的組建。

第十章 基因工程藥物的生產(2學時)

第一節 基因工程菌（細胞）的培養與發酵 內容包括：工程細菌的培養與發酵, 工程酵母的培養與發酵, 工程細胞的培養與發酵。

第二節 基因工程藥物的分離純化 內容包括：影響分離純化工藝的主要因素, 各種產物表達形式采用的分離純化方法,。

第三節 基因工程藥物的分離純化實例 內容包括：以包涵體形式表達的rGM-CSF中試分離純化, 以分泌型表達的人a1-干擾素的分離純化, 以可溶性形式表達的rhG-CSF的分離純化, 在酵母中表達的HBsAg的分離純化。

第十一章 基因工程藥物的檢驗(學生自學)

第一節 基因工程藥物的質量控制 內容包括：主要的基因工程藥物, 基因工程藥物的特點, 基因工程藥物的質量要求, 基因工程藥物的質控要點, 基因工程藥物的制造及檢定規程。

第二節 基因工程藥物常用的檢驗方法 內容：化學檢定法, 肽圖分析法，外源性DNA殘留量的測定，宿主細胞蛋白雜質的檢測，無菌試驗，內毒素試驗，異常毒性試驗，熱原質試驗，生物學活性(效價)檢定。

第三節 主要基因工程藥物的檢驗 內容：重組人胰島素的檢驗，重組人生長激素的檢驗，重組人干擾素的檢驗，重組人白細胞介素的檢驗，重組人紅細胞生成素的檢驗，重組人集落刺激因子的檢驗，重組人組織型纖溶酶原激活劑的檢驗, 重組人腫瘤壞死因子的檢驗，重組乙型肝炎疫苗的檢驗。

五、教材和主要參考資料

理論教學教材： 《基因工程》, 楊汝德主編，華南理工大學出版社，2006.8 主要參考教材： 《基因克隆技術在制藥中的應用》, 楊汝德主編，化學工業出版社，2004.1

執筆人：闞勁松

教研室：

系主任審核簽名：

第三篇：基因工程課程實習教學大綱

基因工程課程實習教學大綱

課程名稱：基因工程

Gene Engineering 課程編號： 開課院系：生物科學與工程學院

實習周數： 1周 課程學時： 30學時 課程總學分： 2 適用專業： 生物科學

一、實習的性質、目的、任務

認知實習是學生進入專業課學習階段的一個實踐性教學環節。通過實地參觀調查，增強學生對實際基因工程的感性認識，從而加深對課堂教學內容的理解，激發學生學習專業知識的熱情，為今后創造性地從事專業工作打下良好的基礎。

通過了解基因工程的操作過程、實驗室設置、設備結構、工作原理等，為學生將來進入分子生物學實驗室實習做好了理論知識與基因工程實踐知識兩方面準備。

二、實習的組織實施

基因工程課程實習主要在學生完成基因工程工程理論后，由生物科學與工程學院的領導和任課教師聯系相關分子生物學實驗室，組織學生去分子生物學實驗室參觀和參與基因工程的實驗。

三、實習教學的基本要求

1.通過實習要求學生了解以下幾點內容

基因工程操作的一般過程原理，包括各階段操作原理和相應的分子生物學原理； 應能清楚基因工程操作的注意事項，并能指出所用儀器設備種類及其作用。

對一些基因工程相關的重要實驗操作及其儀器設備，如PCR、分子雜交、電泳等能有清楚地了解。

2.學生應結合參觀項目及課堂教學內容進行紀錄、總結，并寫出實習報告；報告內容除規定的流程調查等專題外，學生應結合參觀項目，總結自己的參觀體會。

四、實習內容

1.按知識實習講義要求做好預習

預習基因工程操作的基本流程，掌握主要基因工程操作原理（酶切操作、連接操作、轉化、檢測），了解各步驟涉及的儀器設備及其使用。2.觀看基因工程操作過程 將基因工程操作流程與實際設備、流程對號，初步建立分子生物學實驗室的實驗設備、廢棄物處理等環節。

3.重要的分子操作實驗，如電泳、PCR、分子雜交及一些試劑盒（如DNA提取試劑盒）4.討論、答疑、完成實習報告。

五、實習方式和時間安排

實習方式：由教師組織學生到分子生物學實驗室參觀調查 時間安排：第6學期

六、實習考核和成績評定

實習紀律：遲到、早退、出勤、安全等方面的執行情況。（30分）預習報告：（20分）實習報告：（50分）

綜上面三個方面最終按優、良、中、及格和不及格評出實習成績。

七、實習注意事項及其他

實習過程中教師必須和實習企業的相關負責人密切配合，遇到困難要協商解決，確保整個實習過程緊湊、有序、順利和保證學生的人身安全。

制定人簽名：陳明輝 制定時間： 2008年 12月 院系簽章： 審核時間： 年 月

第四篇：基因工程

寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

基因工程

摘要：基因工程是20世紀70年代在分子遺傳學、細胞生物學基礎上發展起來的，是一種可以按照人們的意愿設計、改造和組建生物品種的新技術。包括它通過基因操作，將目的基因活DNA片段與合適的載體連接轉入目標生物細胞，通過復制、轉錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質的活性表達，使轉基因生物獲得新的遺傳性狀。

關鍵詞：生物技術；基因工程

一、基因工程的誕生：

從20世紀40年代開始，受分子生物學、分子遺傳學發展的影響，基因分子生物學取得巨大進步，為基因工程的誕生奠定了基礎。現在人們公認的誕生日期是1973年，其中現代分子生物學領域上的三大發現及技術上的三大發明起了決定性作用。

理論上的三大發現包括：第一，20世紀40年代，Avery 在美國的一次學術會上報道了肺炎球菌的轉化，證明了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的雙螺旋結構以及半保留復制機理，解決了基因的自我復制和傳遞問題；第三，20世紀50年代末的“中心法則”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操縱分子學說，并成功的由一批科學家破譯了遺傳密碼從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。

以上問題的解決使得人們自主改造生物遺傳性狀從理論上成為現實。

技術上的三大發明：第一，1967年發現的DNA連接酶，以及1979年發現的具有更高活性的T4 DNA連接酶。在1970年Smith和 Wilcox從流感嗜血桿菌中分離并純化的限制性核酸內切酶HindⅡ和1972年發現的EcoRⅠ核酸內切酶。后來發現的大量的限制性核酸內切酶。第二，一些病毒、質粒和噬菌體等載體技術的發現使把目的基因的導入更加容易。第三，DNA分子序列分析及瓊脂糖凝膠電泳、Southern雜交技術的發展使得基因工程的誕生越來越近。1973年，斯坦福大學將抗四環素質粒和抗新霉素的質粒用限制性內切酶切割并連接成重組質粒導入到大腸桿菌中是基因工程誕生的標志。

二、基因工程有幾個重要特征：（1）、打破了物種的界限，實現跨物種的基因轉移；（2）、通過已知功能基因的遺傳轉化，進行物種的定向改良；（3）、創造出自然界中本來不存在的物種。

三、基因工程技術流程包括：（1）、目的基因克隆，即從特定生物基因組和cDNA中分離提純和擴大繁殖目的基因；（2）、選擇合適的載體，并對載體DNA進行克隆；（3）、將目的基因與載體寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

連接；（4）、將重組DNA導入到大腸桿菌或酵母菌體內培養；（5）、利用載體上的標記基因進行篩選，獲得轉目的基因的細胞或植株。

四、基因工程的應用：

（1）基因工程應用于農業生產方面：農業領域是目前轉基因技術應用最為廣泛的領域之一。農作物生物技術的目的是提高作物產量，改善品質，增強作物抗逆性、抗病蟲害的能力。基因工程在這些領域已取得了令人矚目的成就。

（2）基因工程應用于醫藥方面：目前，以基因工程藥物為主導的基因工程應用產業已成為全球發展最快的產業之一，發展前景廣闊。基因工程藥物主要包括細胞因子、抗體、疫苗、激素和核苷酸藥物等。它們對預防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內的各種傳染病、類風濕疾病等有重要作用。在很多領域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統化學藥物難以達到的作用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類利用基因工程技術研制成的多功能細胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發性硬化癥和類風濕關節炎等多種疾病。

（3）基因工程應用于環保方面：基因工程技術可提高微生物凈化環境的能力。美國利用DNA重組技術把降解芳烴、萜烴、多環芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接，轉移到某一菌體中構建出可同時降解4種有機物的“超級細菌”，用之清除石油污染，在數小時內可將水上浮油中的2/3烴類降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達成功。它能釘死蚊蟲與害蟲，而對人畜無害，不污染環境。現已開發出的基因工程菌有凈化農藥的DDT的細菌、降解水中的染料、環境中有機氯苯類和氯酚類、多氯聯苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸藥的工程菌及用于吸附無機有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90年代后期問世的DNA改組技術可以創新基因，并賦予表達產物以新的功能，創造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細菌的基因通過PCR技術全部克隆出來，再利用基因重組技術在體外加工重組，最后導入合適的載體，就有可能產生一種或幾種具有非凡降解能力的超級菌株，從而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性問題：

自基因工程誕生以來，基因工程的安全性問題就受到人們極大的關注，關于重組DNA潛在的危險性問題的爭論，在基因工程還處于醞釀階段的時候就已經開始。爭論的焦點是擔心基因工程寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：的雜種生物會從實驗室溢出，在自然界造成難以抑制的災難，有害的雜種菌或病毒與化學物質不同，它們會在自然界不斷繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美國國立衛生研究院（NIH）在加利福尼亞州的Asilomar 會議中心內，160名來自美國和16個國家的專家學者對重組DNA的危害辯論，雖然與會代表分歧挺大，但最后也達成了一些重要的共識，在1976年6月23日美國NIH制定并公布了《重組DNA研究準則》。為了避免可能造成的危害，除了規定禁止若干類型的重組DNA實驗外，還制定了許多具體的規定條文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技術是繼工業革命、信息革命之后 對人類社會產生深遠影響的一場革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療、基因芯片和基因克隆等技術方面取得的革命性成果，將極大地改變人類生命和生活面貌。

參考文獻：

1、基因工程/樓士林，楊盛昌，龍敏南等主編.—北京：科學出版社，2002

2、基因工程技術/鐘衛鴻主編.—北京：化學工業出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主編.—北京：科學出版社，2008

4、基因工程原理與技術/劉志國主編.—2版.—北京：化學工業出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法與應用/徐煜泉等編著.—北京：北京大學出版社，2008.12

第五篇：基因工程

《基因工程論文》

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構建

學

院：生命科學學院 班

級：生物技術12-2 學

號：7011208209 姓

名：陳 昆 任課教師：張銳

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構建

摘要﹕從以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長的解烴菌———地芽孢桿菌MD-2細胞中獲得了1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA。將基因sladA克隆到質粒pSTE33上,構建了重組質粒pSTalk。通過電轉化將pSTalk轉化入嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3內,構建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜熱和解烴的功能,在70℃條件下,14d后對原油的降解率達75.08%。研究結果表明,可以通過體外重組的方式向嗜熱菌中引入烴降解基因,從而構建嗜熱解烴基因工程菌。關鍵詞:微生物采油;烴類降解菌;嗜熱解烴基因;質粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要機理之一。研究結果表明,在解烴菌作用下原油的族組分發生變化,輕質組分增加,粘度下降,改善了原油的流動性;同時,解烴菌還可以將烴類分子轉化成有機溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅油物質。迄今為止,從自然界篩選的高效解烴菌絕大多數為嗜溫微生物,最適合生長溫度一般為20-45℃,很難適應油藏的高溫環境。筆者從1株解烴菌細胞中分離出1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段將此基因轉化到另外1株最適合生長溫度為70℃的嗜熱菌體內,構建了嗜熱解烴基因工程菌SL-21。該基因工程菌既具有高效的解烴功能,又能適應油藏高溫環境,在微生物采油中具有良好的應用前景。1.1 實驗材料

實驗材料包括限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR片斷回收試劑盒;大腸桿菌感受態細胞E.coliDH5α;pGEM-T easy載體;質粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培養基按文獻配制。無機鹽培養基組成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸餾水100mL;pH值為7.2。嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3,分離自勝利油區孤島油田中一區館3區塊采出液,最適合生長溫度為70℃;地芽孢桿菌MD-2,以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長,分離自勝利油區原油污染土壤。1.2 實驗方法

DNA的操作 基因組DNA小量提取,利用聚合酶鏈式反應(PCR)對DNA擴增、PCR產物的回收、酶切與連接,質粒DNA提取和基因序列測定等均按文獻[13-14]方法進行。菌株培養 所涉及到的菌株培養均在溫度為70℃,轉速為180r/min的條件下進行振蕩培養。基因工程菌的構建和篩選方法 ZJ-3感受態細胞的制備按文獻[13-14]方法進行。用構建的重組質粒pSTalk在最佳條件下電轉化ZJ-3感受態細 胞構建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB瓊脂平板上挑選10個陽性克隆接種到5mL LB培養基中,培養過夜,獲得種子液。將該種子液接種到200mL以液蠟為惟一碳源的無機鹽培養基中,培養5d后用CCl4抽提剩余的液蠟,用紅外測油儀測定烴的剩余量,根據菌株降解液蠟的速率篩選出目的基因工程菌。基因工程菌的誘導表達及SDS-PAGE檢測挑取陽性克隆接種于含100μg/mL Amp的10mL的LB液體培養基中,180r/min下振蕩培養至光密度值達到0.6(檢測光波波長為600nm),加誘導物IPTG至終濃度為1mmol/L,振蕩培養8h,收集表達菌體,加SDS上樣緩沖液,于100℃水浴10min后上樣,用12%的SDS-PAGE電泳檢測。基因工程菌降油能力測試 將基因工程菌接入20mL LB培養基中,培養12h,以5 000r/min的速度離心5min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌菌體1次,加20mL無菌生理鹽水懸浮,作為菌株利用烷

烴生長的種子液。取菌懸液按1%接種量接入200mL無機鹽培養基中,加入2%孤島油田中一區館3區塊原油或2%的液體石蠟作為惟一碳源培養,取樣稀釋涂布計數。原油降解實驗 在無機鹽培養基中添加2%的原油,按1%接種量接入基因工程菌,培養14d。用正己烷萃取降解后的原油,用氣相色譜儀測定原油飽和烴組分的降解情況。原油降解率為菌株降解前、后原油量的差值與菌株降解前原油量的比值。2 實驗結果與分析

2.1 MD-2基因組DNA的檢測

對MD-2基因組進行提取和純化。提取后的染色體DNA經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,相對分子質量不小于23kb,說明提取的DNA完好。在檢測光波波長為260280nm條件下分別測出DNA的光密度,其比值為1.95,換算出DNA的質量濃度為1 400g/mL,表明DNA純度較好,無蛋白、RNA、酚和多糖物質的干擾。2.2 烷烴單加氧酶基因的克隆與序列分析依據美國國立衛生研究院基因序列數據庫(Genbank)中的烷烴單加氧酶基因開放閱讀框兩端保守序列,設計了一對兼并引物以MD-2基因組DNA為模板進行PCR擴增,將約1.3kb的PCR產物回收后連接到pGEM-T easy載體上,轉入E.coliDH5α,挑取陽性克隆質粒進行測序。測序結果經Genbank檢索,表明該DNA序列是個新的烷烴單加氧酶基因,命名為sladA。2.3 基因工程菌的構建及篩選

通過PCR擴增sladA后,將PCR產物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分離純化出1 329bp的片斷,與經EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33質粒連接,構建成含sladA的重組質pSTalk。經電泳鑒定表明(圖1),重組質粒構建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的誘導表達

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE圖譜可見(圖2),在烷烴單加氧酶基因sladA對應蛋白大小的地方掃描到高信號強度,表明sladA基因在SL-21中得以表達。2.5 基因工程菌SL-21碳源生長

基因工程菌SL-21在以原油和液體石蠟為惟一碳源的無機鹽培養基中培養,在70℃和180r/min條件下,經過3d的延滯期后進入對數期,菌體數增加。17d后,菌體數為接菌初期的5倍,表明SL-21能夠利用原油或液體石蠟作為惟一碳源生長。2.6 對原油的降解作用

由原油飽和烴組分的降解情況可看出(圖3),基因工程菌對原油有很明顯的降解效果,幾乎將飽和烴降解完全。經對氣相色譜各峰面積對比,計算出各峰面積的含

量和飽和烴組分降解率(表2)。基因工程菌SL-21對原油的降解率為75.08%。

實驗結果表明,烴類降解菌地芽孢桿菌MD-2細胞提取的烷烴單加氧酶基因sladA可以在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中表達。但不同的基因工程菌株中烷烴單加氧酶基因sladA表達的效率不同,需要通過菌株對原油的降解評價進一步篩選。獲得的對原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高溫條件下生長,并且對原油降解效果明顯。因此以體外重組方式向嗜熱菌中引入烴類降解基因構建嗜熱解烴基因工程菌在技術上是可行的。3 結論

以地芽孢桿菌MD-2為目標菌株,克隆和表達了降解長鏈烷烴的單加氧酶基因sladA,并在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中正確表達了基因sladA,構建了基因工程菌SL-21。基因工程菌SL-21在70℃條件下,能以原油或液體石蠟為惟一碳源生長。14d對原油的降解率為75.08%,對原油飽和烴組分均有明顯的降解效果。該基因工程菌既可以用于微生物驅油技術,又可以用于高溫油田污水的生物處理。利用基因工程的方法可以獲得既能耐受極端環境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌種選育的重要方向。參考文獻: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烴降解菌的篩選及性能研究[J].大慶石油地質與開發,2007,26(6):119-123.[2] 汪衛東,汪竹,耿雪麗,等.美國微生物采油技術現場應用效果分析[J].油氣地質與采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁長忠,宋永亭,段傳慧.微生物采油用營養物質在石英砂上的靜態和動態吸附規律[J].油氣地質與采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龍,董漢平,俞理,等.微生物提高采收率數值模擬研究現狀[J].油氣地質與采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花麗.本源微生物降解原油的飽和烴色譜分析[J].油氣地

質與采收率,2008,15(1):77-79.[6] 宋智勇,張君,馬繼業,等.微生物菌液的界面特性[J].油氣地質與采收率,2008,15(3):73-75.[7] 蔣焱,曹功澤,趙鳳敏,等.聚合物驅后微生物提高采收率的可行性分析[J].油氣地質與采收率,2008,15(5):63-65,68.[8] 陳愛華,方新湘,呂秀榮,等.克拉瑪依油田內源微生物驅油機理探索[J].油氣地質與采收率,2008,15(5):75-77.[9] 宋紹富,劉菊榮,張忠智.微生物采油替代營養源的研究[J].油氣地質與采收率,2007,14(2):96-98.[10]李希明.微生物驅替盲端類剩余油的微觀實驗[J].油氣地質與采收率,2008,15(3):91-92.[11]沈萍.微生物學[M].北京:高等教育出版社,2000:143.[12]唐赟,馮露,劉沐之,等.嗜熱解烴菌NG80-2的鑒定及其特[J].南開大學學報,2006,39(2):46-50,70.[13] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆實驗指南[M].金冬雁,譯.北京:科學出版社,1992.[14]盧圣棟.現代分子生物學實驗技術[M].2版.北京:高等教育出版社,1993.4