第一篇：細胞工程總結

廣州大學生命科學學院

08生工2班

黃永平

0820020044

細胞工程考點總結

名詞解釋：

細胞工程：是指以細胞為對象，應用生命科學理論，借助工程學原理與技術，有目的 地利用或改造生物遺傳特性，以獲得特定的細胞、組織產品或新型物種的一門綜合性 科學技術。

細胞周期：通常將通過細胞分裂產生的新細胞的生長開始到下一次細胞分裂形成子細 胞結束為止所經歷的過程稱為細胞周期。

細胞全能性：細胞具有該個體全部遺傳的可能性，在一定條件下如受精卵一樣，有發育成完整個體的固有潛在能力。兩層含義：細胞無論是體細胞還是生殖細胞，均具有該物種全部的遺傳信息；每個細胞均具有發育成完整個體的潛在能力。

細胞分化：指細胞在形態、結構和功能上發生差異的過程，包括時間上和空間上的分化。實質是基因的差異表達。

細胞脫分化：又稱去分化，是指分化的細胞失去特有的結構和功能變成具有未分化細胞特性的過程，即分化細胞在適當的條件下轉變為胚性狀態而重新獲得分裂能力的過程?？刹捎萌斯ふT導技術誘導體細胞脫分化。

細胞再分化：指在離體條件下，無序生長的脫分化細胞在適當的條件下重新進入有序生長和分化狀態的過程。事實上是基因選擇性表達與修飾的人工調控的過程。

植物組織培養：是將植物器官，組織，細胞和原生質體等外植體在離體無菌條件下培養在人工培養基上，在適當的條件下誘發長成完整植株的一種技術。

植物激素：是植物自然狀態下產生的對生長發育有顯著作用的微量有機物，包括生長素家族、細胞分裂素家族、赤霉素、乙烯和脫落酸。

愈傷組織：原指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團薄壁細胞。植物組培中，指脫分化后的細胞經過細胞分裂，產生無組織結構，無明顯極性的松散的細胞團。

體細胞胚：又叫胚狀體，是指離體條件下沒有經過受精過程而形成的胚胎類似物。其發生途徑是指體細胞在離體培養的過程中經歷了胚胎發育過程，起源于非合子細胞。發生實質是細胞再分化。

人工種子：含義為將植物離體培養產生的體細胞胚或芽包埋在含有營養成分和保護功能的人工胚乳和人工種皮中，在適宜條件下發芽出苗的顆粒體，即人工種子。

細胞核移植：是一種利用顯微鏡操作技術將一種動物的細胞核移入同種或異種動物的去核成熟細胞內的技術。用該方法所得到的動物為核質雜種。

胚胎分割：是指借助顯微操作儀切割早期胚胎成多等份，再移植給受體，從而制造同卵多仔后代的技術，是一種廣義上的動物克隆技術。

性別控制：是通過人工操作手段繁殖所需要性別后代的一門技術，其方法主要包括受精前控制、胚胎移植前控制。

試管動物：又叫體外受精動物，是指將供體的精子與卵子在體外受精，體外培養胚胎發育到一定階段，通過胚胎移植移入受體完成發育出生的動物。

試管嬰兒：指將卵子與精子在體外受精，培養發育成早期胚胎再植回母體子宮內發育出生的嬰兒也就是采用體外受精聯合胚胎移植技術培育的嬰兒。

細胞重組：是指從活細胞中分離出細胞器及其組分，在體外進行重新裝配成為具有生物活性的細胞的一種技術。

細胞拆和：把細胞質與細胞核分離開來，然后把不同來源的細胞質和細胞核相互結合，形成核質雜交細胞。

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0820020044 細胞融合：又叫體細胞雜交，是指將不同來源的原生質體融合并使之分化再生，形成新物種或新品種的技術。

體細胞雜交：是指將不同來源的體細胞融合并使之分化再生、形成新品種的技術。胚胎嵌合：又稱胚胎融合，是將兩枚或兩枚以上的胚胎（同種或異種動物）的部分或全部細胞混合在一起，使之發育成一個胚胎，然后移植到受體內繼續發育成嵌合體后代的技術。雌核發育：或孤雌生殖，精核進入卵細胞后未與卵核融合而退化，卵核未經受精而單獨發育成單倍體。遠緣雜交中有時會出現此種現象。

植物細胞培養：在離體條件下，將分離的植物細胞通過繼代培養增殖，獲得大量細胞群體的一種技術。

細胞株：通過克隆化培養從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質或特異性標記的細胞群。

細胞系：是由原代培養經傳代培養純化，獲得的能在體外生存的細胞群體，第一次傳代培養后的細胞，即稱之為細胞系。

單克隆抗體：是指經過免疫哺乳類動物單一的B淋巴細胞，要以分泌單一性抗體，這種抗體具有特異性和同質性。

干細胞：同時具有自我更新以及產生分化細胞的增殖性細胞。

組織工程：是利用生命科學、醫學、工程學的原理與技術，利用細胞、生物材料、細胞因子實現組織修復或再生的一門技術。

細胞凋亡：也叫程序性細胞死亡，是機體維持環境穩定、有基因控制的細胞自主的有序性死亡。與細胞增殖、分化一樣，都是正常的生理現象。這種細胞行為在數量控制和形態塑造中具有的意義。P27 染色體工程：按設計有計劃削減、添加和代換同種或異種染色體從而達到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術。

胚胎移植：又稱受精卵移植，是指將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態相同的其他雌性動物體內，使之繼續發育為新個體的技術。

胚胎工程：是按照一定的設計，有計劃地消減、添加或替換同種或異種染色體從而達到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術。

簡答題或問答題：

1．細胞工程的應用：

細胞工程的應用領域非常廣泛，主要包括：優質植物快速培育與繁殖；動物胚胎工程快速繁殖優良、瀕危品種；利用動植物細胞培養生產活性產物、藥物；新型動植物品種的培育；供醫學器官修復或移植的組織工程；轉基因動植物的生物反應器工程；珍稀動植物資源的保存與保護；在遺傳學、發育學等領域的理論研究；在能源、環境保護等領域的應用。

2．為一農業生物技術企業設計一用于花卉快速繁殖組培工廠？畫簡圖，并說明各室要求。

實驗室一般由準備室、無菌間、操作間、培養室、分析室等幾部分組成，其首要要求是工作環境和條件必須保證無微生物污染，環境清潔，各室的要求如下；

準備室；一般要與其他室分割開來，需放置藥品柜、器械柜、滅菌鍋、過濾除菌器、天平，加熱設備等；要求寬敞明亮，通風條件好。

無菌間：進行無菌操作。要求封閉性好，無塵、干燥清潔，大小要合適，沒有死角，能較長

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0820020044 時間保持無菌保持清潔，應防止空氣對流，墻面和地面要求光滑，密封、安裝滑門，定期用甲醛和高錳酸鉀產生的蒸汽消毒，使用前開紫外光燈20min，更衣換鞋。嚴格的應包括更衣間、緩沖間和操作間3部分，緩沖間處于兩者間 操作間：

培養室：對離體材料進行控制培養，能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，應保持干燥和清潔，一般設置在室內較少走動的內側，需放置搖床、二氧化碳培養箱、生化培養箱光照培養箱、人工氣候箱培養架等； 分析室：

3．分析比較細胞培養不同操作方式的優缺點。

分批式培養方式的優點有操作簡單，培養周期短，能直觀反映細胞生長代謝過程，生產規模放大比較容易，其缺點有不能控制底物濃度、細胞容易老化、生長周期短、效率低等；流加式培養的優點有可合理充足補充營養、減少產物反饋抑制、排除有害代謝物積累對細胞的損傷及細胞不易老化，另外還能避免一次性投料過多，改善培養液流體性質，延長指數生長期，其缺點是操作較麻煩，受生物反應器容積的限制等；半連續式培養能使細胞持續指數生長，可多次收獲并且操作簡便，生產效率高，其缺點是菌種易老化；連續式培養可使細胞在恒定狀態下生長，細胞生長速率可基本保持不變，持續指數增長，但其缺點是收獲細胞濃度不高、細胞分裂快、易變異、易污染等；灌流式培養可維持較高的細胞密度，使細胞處于較穩定的營養環境中，有害代謝廢物積累低，反應速率易控制，培養周期長，目標產品回收率高，其缺點是儀器設備要求較高，操作較復雜等。

4．植物快速繁殖的技術路線：(P81)1）采集材料：①受精卵/②發育中的分生組織細胞（分生組織/根尖/嫩莖/幼葉/花等）/③雌雄配子及單倍體細胞；2）消毒材料：①自來水洗凈然后用無菌紗布吸干水分，切成小塊/②無菌環境中用70%酒精浸泡30~60秒/③材料移入漂白粉飽和液或0.01%升汞（HgCl2）水中消毒10min/④無菌水沖洗三四次；3）制備外植體：無菌環境下，用無菌刀剝去材料的鱗片、嫩枝的外皮或種皮胚乳（葉片不需），切成0.2~0.5cm厚的小片，操作中不可用手觸碰；4）接種和培養：①接種：無菌環境下將切好的外植體立即接種在培養基上，每瓶4~10個②封口：接種后瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶封口③溫度：培養基大多應保持在25℃左右，但要因花卉種類及材料部位不同而區別對待④增殖：在新梢等形成后需要繼代培養；5）根的誘導：繼代培養形成的不定芽和側芽一般沒有根，必須轉到生根培養基上進行生根培養，一個月后即可獲得健壯根系；6）組培苗的練苗移植：試管苗進入自然環境前必須進行煉苗，一般先將培養容器打開在室內自然光照3天，然后取出小苗，自來水洗凈根須，栽入消毒過的基質，移植前適當遮陰，加強水分管理，保持較高的濕度，但基質不宜過濕，以防爛苗。

5．請分析植物激素在組織培養中的作用？

（答題要點：（1）、每種植物生長調節劑各自的作用。（2）、相對濃度）

植物激素：是植物自然狀態下產生的、對生長發育有顯著作用的微量有機物。

植物激素包括：生長素家族、細胞分裂家族、赤霉素、乙烯和生長抑制素。其中前三者是正向激素，后兩者為負向激素。

生長素 植物體內的生長素是由色氨酸通過一系列中間產物形成的，主要途徑是通過吲哚乙

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0820020044 酸。作用：在植物組織培養中，生長素主要用于誘導愈傷組織形成、誘導根的分化、促進細胞分裂、伸長生長。

Eg：吲哚乙酸：促進生長點細胞的分裂和非生長點細胞的伸長，誘導根原基的發生和根系的生成，促進雌花的分化和果實的成熟。

Eg：萘乙酸為代表的人工合成生長調節劑是一種生長素合成前體。

細胞分裂素 大多是嘌呤族衍生物，細胞生理素的生理作用主要是引起細胞分裂，誘導芽的形成和促進芽的生長。

赤霉素：廣泛存在于植物體內，能促進細胞生長，與生長素一起可誘導細胞分化。經常使用的人工合成分裂素：6-芐氨基嘌呤（BA）、6-呋喃氨基嘌呤（又稱激動素，KT）天然細胞分裂素:玉米素

分裂素和生長素通常一起使用，來促使細胞分裂、生長，一般在培養基中生長素與細胞分裂素的比值高時可誘導外植體生根，比值低時，可誘導外植體出芽，而比值適中時，愈傷組織增殖。

6、植物組織培養中出現的問題：

⑴玻璃化問題，即出現一些半透明狀的畸形試管植物，該現象由于能引起植物的組織結構和生理功能異常，因此分化能力低，難以增殖成芽，也難以生根成苗，已成組織培養的一大問題；玻璃化現象主要是適應性的生理問題，其主要的防治措施有；適當提高光照強度，適當降低培養基中NH4﹢濃度，注意通氣，注意細胞分裂素和生長素的配合以及激素和K+之間的配合使用，及適當進行低溫處理等；⑵褐變問題，也是一種植物組織培養中常見的現象，已成為植物組織培養發展的一大障礙，防止或緩解褐變的方法有：選擇適宜的外植體（生長旺盛時期的材料）；選擇適宜的培養條件（酸性環境）；細胞篩選和材料的預處理，主要是剔除是褐變的細胞，減少材料醌類物質的產生等；使用抑制劑和吸附劑；⑶微生物污染問題；⑷其他問題，如研究水平，難培養植物，品種退化問題等。

7．什么是植物胚胎培養？植物胚胎培養有怎樣的意義？

植物胚胎培養是指將植物的胚及具胚器官（如子房、胚珠、胚乳）在離體條件下培養，使之發育形成幼苗的過程。其意義有：克服雜種胚的敗育，獲得稀有雜種；獲得單倍體和多倍體；打破種子休眠，促進胚萌發；快速繁殖良種，縮短育種周期；克服種子生活力低下和自然不育性，提高種子發芽率；提高后代抗性，改良品質；用于種子活力快速測定、種質資源的搜集和保存等。

8．植物脫毒的原理、方法：

答案

一、主要有物理、化學和生物三種方法；物理方法有高溫處理和低溫處理兩種方法，高溫處理又稱熱療法，原理是有些病毒對熱不穩定，植物基本不受傷害，得該方法只對部分病毒有效且高溫處理容易使植物材料受熱枯死，造成損失；低溫處理又稱冷療法，原理是降低溫度能使病毒活力下降，但該法用時長?；瘜W方法是利用化學藥品（嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸、抗生素等）處理患病植物以抑制植物體內病毒的復制，但該法一些化學物質不能使病毒失活，且對植物有毒害；生物方法，其原理是病毒不會侵染植物的每一部位，因此選擇不帶病毒的外植體來再生植株就可以達到去病毒的目的；有莖尖培養，通常取0.2~0.5mm莖尖，該法周期短、效率高但培養基及剝離技術要求較高；微體嫁接法，適用于莖尖培養脫毒生根困難、不能形成完整植株的植物；另外，還有愈傷組織誘導脫毒、珠心胚培養法和花藥培養脫毒。答案

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0820020044 1物理方法：a.高溫處理.去除病毒的原理是一些病毒對熱不穩定，在高于常溫的溫度下（35-40度）即鈍化失火，繁殖力下降，失去侵染能力，而植物基本不受傷害。包括溫湯處理（50度熱水中處理數分鐘至幾小時）

熱風處理（35-40度處理幾十分鐘至數月）

a.低溫處理

原理：降低溫度能使病毒代謝能力下降，活力下降。

2.化學方法：原理:利用嘌呤和嘧啶類似物、氨基酸、抗生素等化學藥品處理患病植物可以抑制植物體內病毒的復制。3.生物方法 原理：病毒并不會浸染植物的每一個部位，因此選擇不帶病毒的外植株來再生植株就可以達到祛病毒的目的。

a.莖尖培養

最有效的植物脫毒方法，具有周期短、效率高的特點。原理：因為莖尖區無維管束，病毒難以進入。

b.微體嫁接法 原理：將極小的莖尖嫁接到不帶病毒的種子實生苗砧木上得到無毒苗。c.愈傷組織誘導脫毒

原理：由無病毒細胞的產生的愈傷組織可以獲得無病毒苗。

d.珠心胚培養法：原理：通過珠心胚培養可以獲得無毒的再生植株，同時又保存了母株的遺傳特性。

e.花藥培養脫毒

原理：花藥培養可產生無病毒植株。

9．脫毒植物的鑒定：

直接檢測法（觀察癥狀）

指示植物法，指采用對某種病毒反應敏感、癥狀明顯的植物來檢測病毒，指示植物一旦

1摩擦接種（與金剛砂混合）感染病毒就會在葉片或全株上表現出特有的病斑，具體方法有○和○2嫁接法；○3電鏡法，用電子顯微鏡觀察樣品材料有無病毒存在，并可同時鑒定病毒顆粒大小、形狀和結構；○4抗血清檢測法，病毒攜帶抗原，注射進動物體內會在血清中產生抗體得到抗血清，不同病毒產生的抗血清具有高度的特異性和專一性；○5分子檢測技術，利用已知病毒的核苷酸序列設計引物，采用PCR技術體外擴增病毒的DNA片段，或者通過探針雜交等分子技術檢測。

10．什么是試管動物？試管動物培育一般經過哪幾個步驟？其繁殖技術的關鍵問題有哪些？

試管動物，也稱體外受精動物，是指將供體的精子和卵子在體外受精，體外培養胚胎發育到一定階段，通過胚胎移植移入受體完成發育出生的動物。其培育步驟一般經過以下五個步驟：⑴精子采集與體外獲能，卵子采集與成熟培養；⑵體外受精；⑶重組胚激活與體外培養；⑷胚胎移植；⑸體內發育、出生。關鍵問題有：①精子的采集、獲能和卵子的采集與成熟培養；②體外受精問題；③胚胎體外培養中的發育阻滯問題；④胚胎移植成活率低的問題；

11．胚胎細胞克隆動物與體細胞克隆動物各有什么優勢？

胚胎細胞克隆動物的優勢有：⑴受體、供體均是胚胎細胞，胚胎細胞分化程度較低，成功率較高；⑵核供體取自同一胚胎，因而可能一次性繁殖性狀相同或高度相似的動物。

體細胞克隆動物的優勢有；⑴體細胞數量豐富，易于獲得；⑵被獲取核供體的動物不受性別限制，年齡不要求在能產生胚胎的年限。

12．胚胎工程動物培育的關鍵技術環節有哪些？如何控制成功率？

關鍵技術環節有：體外受精、人工受精、核移植和胚胎移植四個環節；要控制成功率，首先要對各個環節技術熟悉了解及掌握，即深化理論知識；另外在各個環節總結成功的經驗，第5頁，共9頁 廣州大學生命科學學院

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0820020044 如在胚胎移植上，應選擇與供體發情周期同步的、生殖道正常、無疾病、繁殖史良好的雌性動物為受體接受胚胎移植；最后，還應加強術后護理等，這樣將可提高成功率，總之，要控制成功率，應對各個環節的相關技術、應注意的問題進行精細控制，這樣才能控制成功率。

13．植物細胞融合的過程：

首先取材（生長旺盛、生命力強的組織）并制備原生質體，即去除細胞壁，去除的方法有機械去除法和生物酶解法，然后純化原生質體，純化的方法有離心法（原生質體沉于離心管底部）、漂浮法和離心和漂浮結合法；接著是誘導細胞融合，誘導的方法分為生物法、化學法和物理法；生物法是利用病毒誘導細胞融合（病毒能與宿主細胞膜直接融合，打破兩個細胞膜的隔閡引發細胞質的交流）該法需在適當pH下，有足夠量的Ca2+存在；化學法是指采用化學誘導劑促使細胞融合的方法，常用的誘導劑有：NaNO3、高pH的高濃度Ca2+、聚乙二醇（PEG）等；物理法，常采用的方法是電融合誘導法，是利用電場來誘導細胞彼此連接成串，再施加瞬間強脈沖促使質膜發生可逆性電擊穿，促進細胞融合的技術。

14．怎樣獲得植物的單倍體、三倍體和四倍體？

植物四倍體獲得的方法：因秋水仙素能特異性地與細胞中的微管蛋白分子結合從而使紡錘絲合成受阻，最終形成染色體加倍的核，故可用秋水仙素來獲得四倍體，其具體方法是根據不同植物對秋水仙素的敏感性不同調整秋水仙素濃度，其有效含量一般在0.01%~0.4%，以0.2%左右最為常用，然后，以適宜濃度處理分裂能力強的細胞，處理方法包括浸染法、涂抹法等，浸染法是先將種子浸種催芽，待胚根露白時把種子浸在秋水仙素溶液內24h，濃度高時處理時間可相應短些，且對于幼嫩而分裂迅速的組織也可短些，且處理時溫度應在18~25℃之間；另外還可用細胞松弛素B來處理。單倍體的獲得方法是：花藥和花粉培養，具體方法是先花藥制備與培養：取特定時期（單核期）未開放的花蕾，低溫處理（放在4℃冰箱預處理）3~5天，然后用70%乙醇擦拭花蕾表面，在無菌條件下剝取花粉，接種于適當的培養基中，于25℃光照條件下培養，然后通過分離、過篩、清洗獲得花粉外植體，最后經過植株再生發育成單倍體植株。獲得植物三倍體的方法是，用以上獲得四倍體的方法得到四倍體后，再以二倍體作父本，與四倍體母本植株雜交便可獲得。

15．魚的三倍體的獲得方法：（如何用細胞工程的方法獲得動物的三倍體？）

（1）溫度休克法獲得。溫度休克法包括冷休克法（0~5℃）和熱休克法（30℃）兩種其關鍵是能否成功地阻止細胞分裂或卵子第二極體的釋放。一般來說冷水性魚類應用熱休克法好，溫水性魚類用冷休克法效果較好。（2）水靜壓法，指采用較高的水靜壓（如65kg/gm2）可抑制卵子第二極體的釋放或細胞分裂，產生多倍體，處理時間較短，一般在3~5min。（3）體細胞雜交，即通過四倍體個體與二倍體個體雜交而獲得。

如何利用細胞工程方法獲得魚類或者是貝類的三倍體，四倍體。

生物學:主要通過雜交尤其種間雜交獲得異源多倍體

物理學:溫度休克法、水靜壓法和高鹽高堿法等

溫度休克法原理阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出

水靜壓法原理

抑制第二極體的放出或第一次卵裂產生多倍體

化學:化學物質可用來阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產生3n或4n，如細胞松弛素B。細胞松弛素Ｂ原理能抑制肌動蛋白聚合微絲，從而抑制細胞質分裂。

三倍體---原理，四倍體---原理？

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0820020044 如何鑒定得到了三倍體/四倍體？

16．什么是植物細胞培養？其特點有哪些？

植物細胞培養是在離體條件下，將分離的植物細胞通過繼代培養增殖，獲得大量細胞群體的一種技術。其特點有：①D10-200um,較微生物大30-100倍，②以一定細胞數的非勻相細胞團形式存在，很少單一細胞懸浮生長；③具纖維素細胞壁和大液泡，很容易被剪切力損傷；④生長速度慢,操作周期長,分批培養需2-3周,半連續/連續培養則2-3個月；⑤培養基成分豐富/復雜，適合微生物生長，防止污染更困難；⑥一般需光照光合, O2 和 CO2的含量與傳遞對細胞培養影響較大等特點。

17．什么是植物細胞固定化培養，它有什么優點？

植物細胞固定化培養是將游離的細胞包埋在惰性支持物內部或貼附在它的表面多糖或多聚化合物置備成的網狀支持物中、培養液呈流動狀態進行無菌培養的技術。其方法有：吸附、交聯、共價結合和包埋等。其優點有：①細胞包埋后所受剪切力損傷減小，維持了細胞穩定性，適于植物細胞傳統生物反應器的大規模培養；②細胞密度較高時不會改變培養液流體性質，利于傳質；③次級代謝產物在細胞停長后才大量合成，固定化可將細胞生長與產物合成2個階段分開；④細胞生長較緩慢，利于次生代謝產物積累；⑤增加細胞之間接觸，促進了細胞間信息傳遞，利于代謝產物合成；⑥固定化細胞可反復使用，可利于連續培養和收獲產物，降低成本等優點。

18．什么是次級代謝產物，如何提高植物次級代謝產物？

次級代謝產物上通過次級代謝合成的產物，大多是分子結構比較復雜的小分子化合物，如抗生素、激素、生物堿、毒素等。提高次級代謝產物產量需要考慮的因素有；細胞株、培養工藝、培養技術及培養設備等，具體是選育優良的細胞株，培養時保證培養基和培養條件符合細胞生長和代謝的需要，通過添加次級代謝產物的前體物質進行調控，還可以通過添加表面活性劑增加細胞膜的通透性等。

限制植物細胞培養大規模生產有價值次級代謝產物的影響因素

1.生物因素

（1）細胞株（2）細胞凋亡（3）細胞團（4）生物合成機制 2.化學因素

（1）營養鹽（2）前體（3）誘導子（4）反饋抑制 3.物理因素

主要包括：光照、溫度、通氣、攪拌、pH值等。（1）光照（2）溫度（3）pH 4.工程技術問題

（1）培養液的流變特性、（2）氣體傳遞（3）攪拌與剪切力（4）泡沫與器壁表面粘附性

19．毛狀根培養生產次級代謝產物：

毛狀根又名發狀根，是植株或組織、器官受到發根農桿菌感染后而形成的類似頭發一樣的根組織。利用毛狀根培養可以克服天然根培養存在的難培養等問題與不足。將發根農根桿菌含有的Ri質粒中的T-DNA片段整合到植物細胞的DNA上誘導出毛狀根；常用的毛狀根誘導的方法有外植體接種法（共同培養2~3d）、莖稈接種法（植株的莖尖、葉片切去，劃出傷口，將發根農桿菌接種在傷口處培養）和原生質體—農桿菌共培養法（培養3~5d）。毛狀根培養的優點有；生長快，易培養；毛狀根分化程度高，產生次級代謝產物能力強；通過

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0820020044 T-DNA改造，易于采用基因工程途徑提高次級代謝產物產量等。

20．微藻特點與分類：

微藻分為原核藻類和真核藻類，現國內外已可以大量培養的微藻分別屬于藍藻門、綠藻門、金藻門和紅藻門。微藻的特點有：①利用太陽能和CO2通過光合作用生產有機物，生長速度快，效率高，耗能低；②微藻提取有效成分需要復雜的前處理；③種類多，許多微藻可產生有生物活性的化合物；④可能利用貧瘠土地、鹽堿地等極端環境；⑤微藻培養簡單，容易產業化等。

21．動物細胞體外培養的特點有哪些？需要哪些條件？

培養特點有：①動物細胞大，無細胞壁，對機械攪拌或剪切力敏感；②動物細胞生長緩慢，易受污染；③正常細胞培養的世代數有限，只有癌細胞和發生轉化的細胞才能無限生長下去；④動物細胞間主要以聚集體形式存在，大多需要貼附在載體表面才能生長等。動物細胞體外培養需要的條件有：①培養基，應包括細胞各種代謝所需的各種成分；②需平衡鹽溶液、培養基pH調整液、細胞消化液和抗生素液等；③生長條件，包括溫度、pH、滲透壓、氣體等；④培養工具，如GO2培養箱、相差顯微鏡、培養皿、培養瓶等。

22．動物細胞大規模培養的方法有哪些？各自主要是為了解決什么問題？

動物細胞大規模培養的方法及其為了解決的問題是：⑴轉瓶（管）培養系統，為了解決從小量培養到大規模培養的過度問題；⑵微載體培養，為擺脫傳統的培養瓶（管）培養限制，實現三維立體貼附培養；⑶中空纖維生物反應器培養，為改善傳統培養方法的氣體、營養物質及水分等物質的通透性使水分子、營養物質和氣體可以透過，細胞也能在上面貼附生長；⑷大規模培養方式，常采用的是流加式培養和灌流式培養的操作方式，該法是為使細胞持續生長到較高的密度，目標產品達到較高水平。

23．動物細胞原代培養及技術要點：

接種組織塊直接長出單層細胞或將組織分散成單外細胞再進行培養，在首次傳代前的培養稱為原代培養。原代培養的優點有：在一定程度上能反映體內的形態學特征，原代細胞是很好的實驗材料，原代培養也是建立各種細胞系（株）必經的階段。

原代培養取材時需要注意的幾個問題是：①選擇性取材，應選分化程度低、容易培養的組織，如胚胎、新生組織等；②取材要注意使用新鮮材料和保鮮，取材后一般6h內分離細胞；③取材應該嚴格無菌；④防止細胞機械損傷；⑤避免組織干燥等。動物細胞原代培養有組織塊原代培養和細胞原代培養。

24．與常規細胞工程技術相比，轉基因技術在生物遺傳改造方面有什么特點？

轉基因技術是通過人工方式將外源基因整合到生物體基因組內，并使該轉基因生物能穩定地將此基因遺傳給后代的技術。其與常規細胞工程技術相比，在生物遺傳改造方面的特點有：可實現不同種類生物之間的基因重組，可使人類根據自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，創造新的生命類型等。

25．乳腺生物反應器：

乳腺生物反應器是將外源基因置于乳腺特異性調節序列之下，使之在乳腺中表達，然后通過回收乳汁獲得有重要價值的生物活性蛋白的技術。其在生產藥用蛋白上具有巨大的優勢，主要表現在：①生產出的藥用蛋白與天然蛋白質的活性一致；②動物乳腺不僅能大量持續地表達蛋白質，可維持所表達蛋白質的穩定性，而且可通過誘導系統調控表達；③成本低，第8頁，共9頁 廣州大學生命科學學院

08生工2班

黃永平

0820020044 安全性可靠；④藥物分離純化工藝簡便等。

26．干細胞有什么特征？如何獲得？

特性：具有自我維持與自我更新的能力，具有多方向分化的潛能，即可發育成各種胚胎組織的細胞，或可分化為本系統各譜系的細胞，干細胞分裂能力可維持相當長時間，有的可保存終生，既有生理性的更新能力，也具有對損傷與疾病導致的反應與修復能力。形態特征：通常呈圓形或橢圓形，體積小，核質比例大，具有較高的端粒酶活性，因此具有較強的增殖能力。增殖緩慢，質穩性。

獲得的方法：可從早期胚胎內生細胞團或原始生殖細胞也可從自發或誘發的畸胎細胞中分離得到，也可通過核移植方法獲得（？）。倫理方面的問題？？

27．目前，胚胎干細胞研究存在的問題：

有：⑴來源限制；⑵體外培養困難；⑶安全性不高；⑷倫理道德問題等。

28．什么叫組織工程，其基本要素有哪些？組織工程有什么作用？

組織工程是利用生命科學、醫學、工程學的原理與技術，利用細胞、生物材料、細胞因子實現組織修復或再生的一門技術。其基本要素包括：種子細胞、支架材料、細胞因子三個。其作用主要表現在臨床應用上，如用組織工程技術生產一些骨、肌腱、血管，人工肝等器官為醫療提供原料等。

第9頁，共9頁

第二篇：細胞工程總結

★緒論：

細胞工程：是應用細胞生物學和分子生物學方法，借助工程學的實驗方法或技術，在細胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學特征，以獲得特定的細胞、細胞產品或新生物體有關理論和技術方法的學科。★第一章：

細胞全能性：一個生活細胞所具有得產生完整生物個體的潛在能力。（作為植物組織或器官的基本單位細胞，在離題培養條件下，實現分裂和分化并能發育成胚胎和完整植株的能力）

細胞分化：導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在發育方式改變的過程。

脫分化：培養條件下使一個已分化的細胞回復到原始無分化狀態或分生細胞狀態的過程。

再分化：當細胞脫分化以后，無序生長的細胞及其愈傷組織要重新進入有序生長才能再生為個體的過程。

按細胞分裂能力植物細胞可分為3類：第一類始終保持分裂能力：莖尖、根尖及形成層細胞。第二類分化終端細胞，永遠失去分裂能力：篩管、導管、氣孔保衛細胞等特化細胞。第三類暫不分裂細胞（G0細胞）在受到外界刺激后可重新啟動分裂：表皮細胞及各種薄壁細胞。離體培養中器官發生的方式：先芽后根、先根后芽、愈傷組織的不同部位形成芽和根，在通過維管組織的聯系形成完整植株。

器官分化過程：第一階段外植體經過誘導形成愈傷組織。第二階段是“生長中心”（即分生組織，愈傷組織中形成器官的部位）形成。第三階段器官原基及器官形成（生長中心部位形成不同的器官原基，進而分化出相應的組織和器官）。

體細胞胚：離題培養下沒有經過受精過程，但經過了胚胎發育過程所形成的胚的類似物。

體細胞胚形成的途徑：1直接途徑就是從外植體某些部位直接誘導分化出體細胞胚，如：直接從子葉基部的表皮細胞或切口處產生體細胞胚。

2、間接途徑是在固體培養中外植體先形成愈傷組織，再分化發育產生體細胞胚；懸浮培養中先產生胚性細胞團再形成體細胞胚。與器官發生形成個體的途徑相比，體細胞胚發育再生植株的特點：一是體細胞胚具有雙極性，二是體細胞胚形成后與母體的維管束系統聯系較少，即出現生殖隔離現象。

體細胞胚的特點：

1、起源于非合子細胞

2、雙極性細胞能同時允許根芽發生

3、存在生殖隔離

4、經歷類似合子胚發育的各種胚共四個發育階段

5、遺傳穩定變異相對較小

6、由性細胞發育而來 ★第二章;

離體培養條件下遺傳變異的特點：普遍性、局限性、嵌合性、生理適應性。

影響體細胞遺傳與變異的因素：1供體植物（原有的倍性水平在培養細胞多倍化過程中起著重要作用）2培養基及培養方式（培養方式、激素以及其他附加成分均會誘導體細胞變異的發生）3繼代培養的次數（繼代時間越長繼代次數愈多細胞變異的概率就越高）?！锏谌拢?/p>

實驗室的組成：基本實驗室，輔助實驗室，實驗室布局。其中基本實驗室分為準備室（進行一切與實驗有關的準備工作）接種室（進行材料的離體無菌操作）培養室（對離體材料進行控制條件下的培養）。輔助實驗室又分細胞學實驗室和生化分析實驗室。

基本設備配置：常規設備（天平、冰箱、酸度計、離心機、加熱器、純水器、分裝設備）、滅菌設備（高壓蒸汽滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒裝置、紫外燈）、無菌操作設備（凈化工作臺、接種箱）、培養設備（培養架、培養箱、搖床、生物反應器）、其他設備。滅菌技術：培養基滅菌（高壓蒸汽滅菌或過濾滅菌）玻璃器皿滅菌（濕熱和干熱滅菌）金屬用具滅菌（使用前干熱滅菌使用中浸泡在70%的酒精中，再以火焰將酒精燒去，冷卻）操作環境滅菌（氣體熏蒸或紫外線照射）

培養基成分：無機鹽類、有機化合物、生長調節物質、水、其他附加成分。

外植體：指用于離體培養的活的植物組織，器官等材料。

外植體的來源有三種：生長在自然環境下的植物、有目的地培養在溫室控制條件下的生長的植物、無菌環境下已經經過離體培養的植物。培養基組成：

1、無機鹽類：大量元素、微量元素；

2、有機化合物：糖類、維生素、肌醇、腺嘌呤、氨基酸、其他復合成分；

3、生長調節物質：生長素類、細胞分裂素類、赤霉素類；

4、水；

5、其他附加成分：瓊脂、活性炭。

外植體滅菌選擇：

1、種子滅菌；

2、芽，葉片，莖等組織材料滅菌；

3、未成熟胚，子房，及花藥滅菌。注意：滅菌后的材料應立即接種培養，否則會造成二次污染。★第四章：

快速繁殖：利用細胞的再生特性，在組織培養條件下加速繁殖材料的個體生產提高繁殖系數

植物脫毒和快繁的意義：1能夠有效保持優良品種特性2生產無病毒種苗，防止品種退化3快速繁殖新品種，加速優良品種推廣4節約耕地，提高農產品商品產出率5便于運輸

離體繁殖：在人工控制的無菌條件下，使植物在人工培養基上繁殖的技術。

立體繁殖的一般技術環節：1無菌培養物的建立2培養物的增殖3器官分化4植株的形成和移栽

培養基的增殖方式：芽增殖，不定芽增殖，胚狀體的增殖，愈傷組織增殖。

增值方式的選擇：首先選擇莖芽增殖，其次是不定芽，除非萬不得已不宜選擇愈傷組織增值方式。

花藥培養：把發育到一定階段的花藥接種到人工培養基上，使其發育和分化成為植株的過程。

花粉培養：從花粉中分離出花粉粒使之成為分散的或游離的狀態，通過培養使花粉粒脫分化進而發育成完整植株的過程。共同點：利用花粉染色體、單倍體性培養發育

不同點：1.花粉培養可以避免花藥壁花絲和藥隔等體細胞組織的干擾能更好地調節控制雄核發育的各種因子；2.花粉數量大具有單細胞單倍性和較高同步性等特點，可以從較少的花藥獲得大量的花粉植物，3.花粉培養還能為研究細胞分化條件胚胎發生和形態發生機理提供較為理想的實驗系統，4花藥培養的成功為深入展開原生質體的培養遺傳操作和發育分子生物學的研究提供了有用的材料和良好的技術基礎。

單培體培養的特點;1體細胞染色體數目減半；生長發育弱，體型小，各種器官明顯減??；2各種器官明顯減少；3雌雄配子嚴重敗育，有的甚至不能進入有性世代。

單培應用潛力:1迅速獲得純和性材料，縮短育種年限2獲得育種中間材料3與誘變育種結合可提高誘變率4作為遺傳工程受體更有效5與體細胞融合6用作基礎研究的各個領域。

胚培養的意義:1克服雜交育種中雜種胚的早期夭折2克服珠心胚的干擾，提高育種效率3理論研究的意義，胚培養可用于探討植物器官發生過程的許多問題，研究胚發育中胚乳的作用和進行胚胎切割實驗等。胚培養類型:成熟胚培養和幼胚培養。

幼胚培養的生長發育方式：1胚胎發育2早熟萌發3愈傷組織 胚乳發育類型：核型 細胞型 沼生目型 ★第五章

植物細胞培養：在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養使其增殖的技術。

細胞懸浮培養：將單個游離細胞或小細胞團在液體培養基中進行培養增殖的技術。

用于建立細胞懸浮培養的愈傷組織要求：有較好的松散型，使之在懸浮培養的起始階段易打散；還必須必備較強的增殖和再生能力。滿足細胞懸浮培養體系的三條件：1懸浮培養物分散性良好，細胞團較小一般在30到50個細胞以下；2均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色；3細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2到3天甚至更短時間可增加一倍。

懸浮細胞培養的同步化:同一懸浮培養體系中的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。

同步化方法：分選法，饑額法，抑制劑法，低溫處理法。

單細胞培養方式:微室培養，看護培養，平板培養，其他單細胞培養技術。

生物反應器類型：攪拌式，氣動式，固定化細胞。懸浮細胞的生長動態（S曲線）：延遲期、指數生長期、直線生長期、減緩期、靜止期。當細胞生長進入減緩期時，就要及時繼代。★第六章

原生質體：除去細胞壁后的裸露的球形細胞。

原生質體的特點：雖然沒有了細胞壁，但仍能進行植物細胞的各種基本生命活動，如蛋白質和核酸的合成、光合作用、呼吸作用以及通過質膜的物質交換等。

原生質體純化方法：

1、沉降法；優點是搜集方法方便，操作簡單，原生質體丟失少。但這種方法在漂洗過程中易造成原生質的損害且純度不夠好，常存在少量脫壁不完全的細胞和破碎的原生質體。

2、飄浮法；優點是可收集較純凈的原生質，還可避免在離心純化過程中因震蕩撞擊或擠壓引起的原生質損傷或破裂，所用試劑簡單，成本低，從而造成原生質體的獲得率較低。缺點是原生質在數量上損失較多。

3、梯度離心法：優點：獲得原生質體更為純凈。原生質活力測定原理：

方法:熒光素雙醋酸酯染色法（FDA），酚藏花紅染色法，熒光增白劑染色法(CFW)，伊凡藍染色法。

原生質的應用：1原生質由于脫去了細胞壁并且在離體培養條件下能夠實現細胞的全能性而且再生植株，可以作為一個良好的試驗系統而用于細胞壁的形成與功能，質膜的結構與功能，細胞骨架細胞分化與脫分化等基礎理論問題的研究。2原生質體容易攝取外緣DNA、染色體、細菌、細胞器和質粒等，從而為高等植物細胞水平和分子水平的遺傳操作提供理想的實驗體系。3原生質體還可應用于體細胞雜交，無性系變異及突變體的篩選，細胞器的分離等研究。4原生質體可以作為植物生理學，分子生物學，遺傳學，病毒學，育種學，體細胞遺傳學和實驗生物學等學科的理論和應用研究提供重要的實驗體系。5作為遺傳轉化的受體?！锏谄哒?/p>

植物體細胞雜交:又稱原生質體融合將植物不同屬種甚至科間的原生質體通過人工方法誘導融合，然后進行離體培養，使其再生雜種植株的技術。

融合方法：

1、PGE誘導融合方法，優點是融合成本低，不需特殊設備；融合子產生的異核率較高，融合過程不受物種限制。缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害作用。

2、電融合法：優點是不存在對細胞的毒害問題，融合效率高，融合技術操作簡便。缺點是儀器昂貴，給融合技術的實際應用帶來一定的限制?！锏诎苏?/p>

人工種子的概念：任何一種人工種皮包被或裸露的具有形成完整植株能力的繁殖體。人工種子的分類：（根據包被的需要程度分）

1、裸露或休眠的繁殖體。

2、被人工種皮包被的繁殖體。

3、水凝膠包埋在包被的人工種皮的繁殖體。（根據繁殖體的類型分）1體細胞人工種子2非體細胞人工種子 人工種子的特點：一 重要的經濟作物、糧食作物以及多年生經濟林木的人工種子報道日益增多。二 是以微器官為繁殖體的報道呈增加趨勢，其中包括微芽、微枝、原球莖、小鱗莖和小塊莖等。人工種子組成的三個部分：繁殖體、人工胚乳和人工種皮?！锏诰耪?/p>

玻璃化:是指液體轉化為非晶體的固化過程。

玻璃化法：是將生物材料經極高密度的玻璃化溶液快速脫水后直接投入液氮，使生物材料連同玻璃化溶液發生玻璃化轉變，進入玻璃態。玻璃化的途徑：1 大幅度提高冷卻速率 2 增加溶液濃度 影響超低溫保存效果的因素：植物的基因型 抗凍性及器官、組織和細胞的年齡及生理狀態。

冰凍保護劑的特點：易溶于水，對細胞無毒，容易從組織細胞中清除。冰凍保護劑的類型：滲透型冰凍保護劑、非滲透型冰凍保護劑。第十章

植物基因轉化受體系統：用于轉化的外植體通過組織培養途徑及其它非組織培養途徑，能高效、穩定的再生無性系，并能接受外源基因的整合，對用于轉化選擇的抗生素敏感的再生系統。植物基因轉化受體系統的類型：1 經過愈傷組織的受體系統 2 不經過愈傷組織的受體系統 3 原生質體在生系統 4 細胞系及其體細胞胚受體系統 5 生殖細胞受體系統。★論述題：

植物細胞工程的應用：

1、在植物育種上的應用：將常規植物育種技術與植物組織培養技術相結合，可以獲得常規技術難以獲得或無法獲得的種質材料。（快速獲得特殊倍性材料、克服遠源雜交不親和、克服雜種胚早期夭折、導入外援基因、突變體篩選、種質資源保存）

2、種苗脫病毒與快速繁殖：利用莖尖培養脫毒，在組織培養條件下或在具有良好的病毒傳播隔離條件下進行無病毒種苗的快速繁殖；利用組織培養技術，亦使許多傳統上繁殖系數很低的有性繁殖植物得以快速繁殖，大大提高了經濟效益。

3、細胞培養生產有用次生產物：植物幾乎能生產人類所需要的一切天然有機化合物，如：蛋白質、脂肪、糖類、天然藥物、香料、生物堿及其它活性物質。4在植物生物學和發育生物學研究中的應用：植物不同組織、細胞培養獲得再生個體，及其在此過程中所形成的調控技術本身，進一步揭示里植物細胞全能性學說的本質和內涵，是對細胞生物學領域的重要貢獻。

5、在植物遺傳、生理生化以及植物病理等基礎研究中心的應用：利用細胞途徑進行染色體操作，可以有目的地創造植物附加系，代換系，易位系為染色體工程的研究開辟新途徑；細胞培養和組織培養為研究植物生理活動提供了理想技術體系；在人工培養條件下對植物抗病性進行研究，免除了環境條件的干擾，使得結果更加真實可靠。人工種子的應用前景：

1、微器官人工種子可能最先用于無性繁殖植物：微器官如微芽、試管塊莖和試管鱗莖等作為繁殖體時，成苗率高且出苗整齊，具有田間應用的可行性，同時，在立體培養中，可采用脫毒技術首先出去病毒后再進行人工種子生產，可大大提高無性繁殖植物種子的質量，避免天然種苗引起的病害傳播。

二、人工種子可用于天然種子繁殖后代群體變異大的植物：不定芽試管苗繁殖體技術已在生產上顯示了樹體整齊的優越性，以微芽為繁殖體的人工種子技術已經建立，可大大降低生產成本，減少運輸損耗。

三、以體細胞胚為繁殖體的應用的可能性體細胞胚胎發生在多種作物中已經進行過深入研究，然而迄今仍未達到實際應用的程度。總之，目前體細胞人工種子技術還不完全成熟，但它在生物學和社會經濟發展中的潛在利用價值不容否認。

第三篇：細胞工程學習總結

主要學習內容 植物細胞工程? 是在植物細胞全能性的基礎上，以植物細胞為基本單位，在體外條件下進行培養、繁殖或人為的精細操作，使細胞的某些生物學特性按照人們的意愿發生改變，從而改良品種或創制新種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用產物的過程。2 植物細胞的全能性? 生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能的特性。3植物細胞的全能性原理 ? 生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質，都有發育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，生物體 的每一個活細胞都應該具有全能性。4 植物組織與器官培養? 是指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞（體細胞、生殖細胞等）、胚胎、原生質體等培養在人工配置的培養基上，給予適當的培養條件，誘發產生愈傷組織、潛伏芽，或者長成新的完整植株的一種實驗技術。5 愈傷組織? 是指由外植體組織增生的細胞產生的一團不定型的疏散排列的薄壁細胞。6 脫分化? 一個已經停止分裂的成熟細胞轉變為分生狀態，并形成未分化的細胞團或愈傷組織的現象。7 再分化? 指原已分化的細胞過脫分化后再次分化的現象，最終可進一步形成完整的小植株。8繼代培養 ? 是指愈傷組織在培養基上生長一段時間后，營養物枯竭，水分散失，并已積累了一些代謝產物，此時需要將這些組織轉移到新的培養基上進行培養的方式。9 植物細胞培養? 是指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養基中進行振蕩培養，得到懸浮細胞，再通過繼代培養使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的技術。它是在組培基礎上發展起來的。10 動物細胞培養? 動物細胞與組織培養是從動物體內取出細胞或者組織，模擬體內的生理環境，在無菌、適溫和豐富的營養條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結構和功能的一門技術。11細胞系? 由初代培養產生的能進行無限次傳代培養的細胞群稱細胞系.12干細胞? 是指具有無限或較長期的自我更新能力，并能產生至少一種高度分化子代細胞的細胞。13胚胎干細胞? 指由胚胎內細胞團或原始生殖細胞經體外抑制培養而篩選出的細胞。14成體干細胞? 指存在于一種已經分化組織中的未分化細胞，這種細胞能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類型組織的細胞。15全能干細胞? 具有自我更新和分化形成任何類型細胞的能力，有形成完整個體的分化潛能。16細胞融合（體細胞雜交）? 將不同來源的原生質體相融合并使之分化再生、形成新物種或新品種的技術。17合胞體 ? 在細胞融合過程中，開始階段只來自兩個細胞的細胞質先聚集在一起，而細胞核仍保持彼此獨立，這種特定階段的細胞結構稱為合胞體。18同核體 ? 基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體。是由同源的原生質體融合產生的。19異核體 ? 來自不同基因型的細胞融合形成的雜交細胞為異核體。由非同源的原生質體融合產生的。

20雜種細胞（體細胞雜種）? 來自不同細胞核的染色體合并到一個細胞核內，產生出雜種細胞。由于這種雜種細胞的雙親都是體細胞，因此又叫做體細胞雜種。21單克隆抗體（McAb）? 是由遺傳性高度一致的克隆細胞分泌出的成分單

一、有特異性的抗體。22胚胎移植? 也稱受精卵移植，是指將良種母畜配種后，從其生殖道（輸卵管或子宮角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同種生理狀態相同的母畜體內，使之繼續發育成為新個體技術，所以也稱為“借腹懷胎”。23染色體工程? 是人們按照一定的設計，有計劃地消減、添加或代換同種或異種染色體，從而達到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術。廣義上講它還應包括染色體內部的部分遺傳操作技術，因此也稱為染色體操作。24 雌核發育? 是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細胞核發育成個體的生殖行為。同種或異種精子進入卵內只起刺激卵子發育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質，其子代的遺傳物質完全來自雌核，只具有母本的性狀。轉基因動物？將外源重組基因轉染并整合到動物受體細胞基因組中，從而形成在體表達外源基因的動物，稱為轉基因動物。

26隨著細胞生物學，分子生物學，遺傳學等學科發展核研究的日益深入，細胞工程近年來得到快速的發展，以及成為現代生物工程的一個重要代表性領域，具體而言，細胞工程的一些研究領域包括：1動植物細胞與組織培養 2細胞融合 3染色體工程 4胚胎工程 5細胞遺傳工程 動植物細胞與組織培養可分為三個層次上的培養：細胞培養、組織培養和器官培養

28植物細胞與組織培養技術最顯著的價值在于: 優良植物的快速繁育與代謝產物的大量制備方面。

29染色體工程主要分為: 動物染色體工程和植物染色體工程 胚胎工程采用的新技術包括:胚胎分割技術、胚胎融合技術、卵核移植技術、體外授精技術、胚胎培養、胚胎移植以及性別鑒定技術、胚胎冷凍技術 31當今，細胞工程已經稱為生物學家手中經常應用的技術之一。并已經成為生物工程的重要組成部分和主導領域之一，涉及面及其廣泛，在許多領域都有非常重要的應用價值，并且已經取得了驚人成就。如1動植物細胞與組織培養2細胞融合3染色體工程4胚胎工程5細胞遺傳工程？

細胞工程應用，內容包括

1、優質植物快速培育與繁殖

2、動物胚胎工程快速繁殖優良、瀕危品種

3、利用動植物細胞培養生產活性產物、藥品

4、新型動植物品種的培育

5、供醫學器官修復或移植的組織工程

6、轉基因動植物的生物反應器工程

7、珍惜動植物資源的保存與保護

8、在遺傳學、發育學等領域的理論研究

9、在能源、環境保護等領域的應用1234567？

33胚胎工程的最成功的應用領域體現在畜牧業---，主要是采用胚胎移植技術進行優良品種的快速繁殖與胚胎保存-----，----？

染色體工程技術最大的價值體現在-新品種的培育------，主要是單倍體和多倍體----，---育種方法？

35植物細胞工程主要利用傳統的-雜交，回交---，-------的方法達到改變染色體的目的？

36動物細胞培養基分類: 1）天然培養基2）合成培養基3)無血清培養基 37干細胞增殖特性1緩慢性:2自穩性:干細胞能自我更新維持自身數目 的恒定

38干細胞的分類，按發生學來源:1胚胎干細胞2 成體干細胞 按分化潛能: 1全能干細胞2多能干細胞3單能干細胞 39體外受精技術主要包括以下幾個主要方面：12345？

精子的采集與獲能、卵子的回收及成熟培養、體外受精、受精卵的體外發育及試管胚胎的移植等。

胚胎工程是在胚胎移植技術上發展起來的現代生物技術，在畜牧業生產和臨床上具有廣泛的應用，它主要包括12345等？

外受精技術、胚胎移植技術、胚胎分割技術、胚胎冷凍保存技術和性別控制技術 41染色體要確保在細胞分裂中保持穩定，必須要能夠自我復制和向子細胞中平均分配。它需要3個關鍵序列，包括123。？ 自主復制DNA序列、著絲粒DNA序列和端粒DNA序列

42人造微小染色體在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結構與功能關系等研究中得到了廣泛的應用，具有極為重要的價值。目前，正在研究或應用的有123？

43轉基因動物的方法，123？

反轉錄病毒法；基因顯微注射法；胚胎干細胞移植法 44植物組織培養基本步驟 ？

①培養材料的采集；②培養材料的消毒；③制備外植體；④接種和培養；⑤根的誘導；⑥組織苗的練苗移栽。45圖繪植物體細胞雜交的基本過程？

46植物間的體細胞雜交意義？

植物間的體細胞雜交所得到的雜交細胞，已達到了完整的植株水平，獲得了新的雜交植物，使來自兩個親本細胞的基因有可能都被表達，這就打破了遠緣生物不能雜交的屏障，提供了創造新物種的可能。47圖繪植物組織培養過程？

動物細胞特點？

無細胞壁；倍增時間長，生長緩慢；培養中需氧量少，對攪拌敏感；多以聚集體存在；原代細胞培養50代即開始退化；細胞連接復雜 49動物細胞體外培養特點？

1)營養條件苛刻除一般的營養物質外,還要血清；2)適應性差, 對環境敏感包括對PH、溶解氧、二氧化碳等；3)培養時間長，易污染 主要是生長緩慢;顯著的污染是培養基的PH迅速改變.50動物細胞體外培養條件？

溫度：37度；pH：7.2-7.4；氣體：氧，二氧化碳，氮氣；營養條件：培養基；需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供。

51圖繪動物細胞體外細胞生長增殖過程？

52異種細胞移植存在的問題？

?非自體細胞移植過程中必然發生不同程度的排斥反應，與器官移植不同，它不具有正常器官的解剖結構，一般不需吻合血管；

?在提純、培養的過程中，常發生損傷和活力喪失或減弱，經過幾代傳代繁殖后，有可能發生變異；

?由于失去正常生存環境，長期生長常不利。

?非自體細胞用于組織工程實踐時，病人的免疫系統摧毀植入物是最大的難題。?盡管同種異休移植免疫排斥反應與異種移植免疫排斥反應機理明顯不同，但仍有一些共同特點，補體介導的排斥反應被認為是異種移植的主要障礙(超急性排斥)。

?一旦超急性排斥得以防止，異種移植將面臨與同種異體移植物排斥相同的許多問題。

53體外受精的意義？

家畜體外受精技術經過近20年的發展，已取得很大進步，為實現動物胚胎的工廠化生產提供了可能，對充分發揮良種母畜的繁殖潛力，加快家畜品種改良和優良品種遺傳資源的開發與利用,加速畜牧業的發展具有重要的科學意義和實用價值。

54胚胎移植的意義？

①發揮優良母畜的繁殖力，迅速擴大優良畜種數量，加速優良畜種的推廣 應用；②縮短世代間隔、增加選擇強度，促進家畜改良速度；③長期保存 冷凍胚胎，便于優良品種的種質運輸和保存；④是胚胎分割、胚胎嵌合、性別鑒定和核移植等其它胚胎生物技術的基礎，也是基礎生命科學研究的 重要手段。

雌核發育的意義？

為生產單性種群提供了可能；能迅速地產生同源型二倍體；提供某些致死突變種的生物品質；在農牧漁業生產中，可人工控制性別繁殖；廣泛地用于進行基因-著絲點的定位研究；可利用產生新的純系來篩選除去有害的等位基因。56染色體分離的基本原理？ 由于熒光染料Hoechst 只對A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結合的量和比例是不同的。結合這些染料后，再經激光照射，染色體就會呈現不同的熒光帶。將特定染色體發出的熒光波長輸入計算機，通過計算機控制就可將發出同一波長的染色體收集在一起，從而實現染色體的分離。57體內干細胞的意義？

?在于源源不斷地補充體內一些短命組織的細胞來源，如血液細胞、皮膚細胞以及精巢等，或者組織或器官受到局部損傷時，它們可以再分裂形成新的該組織和器官，是體內的一種自我修復機制。

?人類干細胞工程就是利用人體內干細胞的特征來達到體外產生人類所需的產物的探索。主要用于器官修復，基因治療等。58動物細胞融合技術主要應用？

(1)染色體的基因定位這是融合細胞技術應用的主要成果之一。如：將人體細胞與小鼠細胞融合，在雜種細胞系中，優先排斥人染色體，因此，每種細胞系都僅含有一條或若干條特異性的人染色體。通過對這些細胞系生理生化功能分析，就可以斷定特定的人染色體的功能。已經證明，僅保留著1號人染色體的人-小鼠雜種細胞系，才能合成人尿苷單鹼酸激酶，證實編碼這種激酶的人基因定位在1號染色體上。(2)遺傳疾病的治療與基因互補分析。將不同人類疾病遺傳缺陷的突變細胞融合，產生的雜種細胞由于基因的互補作用，可恢復其正常的表型。應用基因互補分析，斷定突變體所涉及的基因數目，分析基因的結構，剖析遺傳疾病的病因:雜種細胞測定。不互補，缺失同一基因或同一基因產生同樣突變；互補，缺失不同基因或同一基因不同部位發生突變

(3)制備特殊活性物質：生產單克隆抗體：將能分泌胰島素、生長激素等具有特殊功能的細胞，與在體外能長期傳代存活的骨髓瘤細胞融合，就可能選擇到既能生產特殊活性物質，又具長壽命的雜種細胞克隆系。應用細胞融合技術，有可能得到生產生長激素、促性腺激素、催乳素、胰島素等各種雜種細胞系。59圖繪單克隆抗體技術過程？

免疫動物；融合細胞的制備；細胞融合；雜和細胞篩選；抗體檢測；大規模生產

60單克隆抗體技術應用？

①病毒性疾病的診斷和治療：可檢測多種病毒中非常細微的株間差異，鑒定細菌的種型和亞種。診斷異常準確，誤診率大大降低。例如，抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的單克隆抗體，靈敏度比當前最佳的抗血清還要高100倍，能檢測出抗血清的60％的假陰性。

②癌癥治療：可檢查出尚無臨床表現的極小腫瘤病灶，檢測心肌梗死的部位和面積。人們正在研究“生物導彈”——單克隆抗體作載體攜帶藥物，使藥物準確地到達癌細胞，以避免化療或放射療法把正常細胞與癌細胞一同殺死的副作用。在人體掃描圖技術和腫瘤定位方面已獲得很大進展。

③生產免疫避孕藥：可精確地檢測排卵期，將早期胚胎來制備單克隆抗體。新一代免疫避孕藥就是用精子，卵透明帶或早期胚胎來制備單克隆抗體，將它們注入婦女體內，人體就會產生對精子的免疫反應，從而起到避孕作用。

④生產生物藥品：生物藥品主要有各種疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物質、抗體等，是生物體內代謝的中間產物或分泌物。過去制備疫苗是從動物組織中提取，得到的產量低而且很費時?，F在，利用細胞工程或細胞融合途徑，大大提高了效率，還能制備出多價菌苗，可同時抵御兩種以上的病原菌的侵害。⑤免疫學研究：鑒定、區分各種抗原檢測抗原上的決定簇；對抗體的基因定位及表達進行研究。

⑥大分子蛋白的提純：將抗體交聯到溴化氫活化的瓊脂糖基質上，制成免疫親和層析柱。提純得到的蛋白質雜質含量低，對產物起始濃度求低。61 轉基因動物制備過程 ？

外源目的基因的制備；外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞；選擇獲得攜有目的基因的細胞；選擇合適的體外培養系統和宿主動物；轉基因細胞胚胎發育及鑒定；篩選所得的轉基因動物品系。62轉基因動物在生命科學基礎研究中的應用？

研究基因的結構與功能；研究基因的組織特異性表達；研究發育相關基因的表達與調控；克隆在發育中起重要作用的基因；基因多級調節系統的研究；細胞功能研究。

第四篇：細胞工程

正交試驗設計過程

對于單因素或兩因素試驗，因其因素少，試驗的設計、實施與分析都比較簡單。但在實際工作中，常常需要同時考察3個或3個以上的試驗因素，若進行全面試驗，則試驗的規模將很大，往往因實驗條件的限制而難于實施。正交試驗設計就是安排多因素試驗、尋求最優水平組合的一種高效率試驗設計方法。

一、正交試驗設計的概念及原理

1、正交試驗設計的基本概念

正交試驗設計是利用正交表來安排與分析多因素試驗的一種設計方法。它是由試驗因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進行試驗的，通過對這部分試驗結果的分析了解全面試驗的情況，找出最優的水平組合。

2、正交試驗設計的基本原理

在試驗安排中，每個因素在研究的范圍內選幾個水平，就好比在選優區內打上網格，如果網上的每個點都做試驗，就是全面試驗。如上例中，3個因素的選優區可以用一個立方體表示（圖10-1），3個因素各取3個水平，把立方體劃分成27個格點。若27個網格點都試驗，就是全面試驗。3因素3水平的全面試驗水平組合數為33=27，4因素3水平的全面試驗水平組合數為34=81，5因素3水平的全面試驗水平組合數為35=243，這在科學試驗中是有可能做不到的。正交設計就是從選優區全面試驗點（水平組合）中挑選出有代表性的部分試驗點來進行試驗。

3、正交表及其基本性質

3.1 正交表

由于正交設計安排試驗和分析試驗結果都要用到正交表，因此，我們先對正交表作一介紹。常用的正交表已由數學工作者制定出來，供進行正交設計師選用（詳見有關參考書）。正交表記號為La（bc），其中L代表正交表，a表示試驗的次數即行數，b表示因素的水平數，c表示因素的個數即列數。

3.2 正交表的基本性質

3.2.1正交性

?任一列中，各水平都出現，且出項的次數相等；

? 任兩列之間各種不同水平的所有可能組合都出現，且出現的次數相等；

3.2.2代表性

? 一方面，任一列的各水平都出現，使得部分試驗中包括了所有因素的所有水平；任兩列的所有水平組合都出現，使任意兩因素間的試驗組合為全面試驗。另一方面，由于正交表的正交性，正交試驗的試驗點必然均衡地分布在全面試驗點中，具有很強的代表性。因此，部分試驗尋找的最優條件與全面試驗所找的最優條件，應有一致的趨勢。

3.2.3綜合可比性

任一列的各水平出現的次數相等；任兩列間所有水平組合出現次數相等，使得任一因素各水平的試驗條件相同。這就保證了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干擾。從而可以綜合比較該因素不同水平對試驗指標的影響情況。

根據以上特性，我們用正交表安排的試驗，具有均衡分散和整齊可比的特點。?所謂均衡分散，是指用正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布是均勻的。

所謂均衡分散，是指用正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布是均勻的5、試驗結果分析

? 分清各因素及其交互作用的主次順序，分清哪個是主要因素，哪個是次要因素； 判斷因素對試驗指標影響的顯著程度； 找出試驗因素的優水平和試驗范圍內的最優組合，即試驗因素各取什么水平時，試驗指標最好； 分析因素與試驗指標之間的關系，即當因素變化時，試驗指標是如何變化的。找出指標隨因素變化的規律和趨勢，為進一步試驗指明方向； 了解各因素之間的交互作用情況； 估計試驗誤差的大小。

5.1直觀分析法——極差分析法

計算簡便，直觀，簡單易懂，是正交試驗結果分析最常用方法。

Rj為第j列因素的極差，反映了第j列因素水平波動時，試驗指標的變動幅度。Rj越大，說明該因素對試驗指標的影響越大。根據Rj大小，可以判斷因素的主次順序。

Kjm為第j列因素m水平所對應的試驗指標和，kjm為Kjm平均值。由kjm大小可以判斷第j列因素優水平和優組合。

5.1.1確定試驗因素的優水平和最優水平組合分析A因素各水平對試驗指標的影響。根據正交設計的特性，對A1、A2、A3、A4來說，四組試驗的試驗條件是完全一樣的（綜合可比性），可進行直接比較。如果因素A對試驗指標無影響時，那么kA1、kA2、kA3、kA4應該相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。說明，A因素的水平變動對試驗結果有影響。因此，根據kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判斷A1、A2、A3、A4對試驗指標的影響大小。由于試驗指標為產率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可斷定A2為A因素的優水平。

同理，可以計算并確定B、C、D因素的優水平。

5.1.1確定試驗因素的優水平和最優水平組合分析A因素各水平對試驗指標的影響。根據正交設計的特性，對A1、A2、A3、A4來說，四組試驗的試驗條件是完全一樣的（綜合可比性），可進行直接比較。如果因素A對試驗指標無影響時，那么kA1、kA2、kA3、kA4應該相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。說明，A因素的水平變動對試驗結果有影響。因此，根據kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判斷A1、A2、A3、A4對試驗指標的影響大小。由于試驗指標為產率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可斷定A2為A因素的優水平。

同理，可以計算并確定B、C、D因素的優水平。

5.1.2確定因素的主次順序

根據極差Rj的大小，可以判斷各因素對試驗指標的影響主次。極差越大的，該因素對產率的影響越大，反之越小。

5.1.3繪制因素與指標趨勢圖

以各因素水平為橫坐標，試驗指標的平均值（kjm）為縱坐標，繪制因素與指標趨勢圖。由因素與指標趨勢圖可以更直觀地看出試驗指標隨著因素水平的變化而變化的趨勢，可為進一步試驗指明方向。

最后得出試驗的最優組合和次優組合。

5.2方差分析

極差分析法簡單明了，通俗易懂，計算工作量少便于推廣普及。但這種方法不能將試驗中由于試驗條件改變引起的數據波動同試驗誤差引起的數據波動區分開來，也就是說，不能區分因素各水平間對應的試驗結果的差異究竟是由于因素水平不同引起的，還是由于試驗誤差引起的，無法估計試驗誤差的大小。此外，各因素對試驗結果的影響大小無法給以精確的數量

估計，不能提出一個標準來判斷所考察因素作用是否顯著。為了彌補極差分析的缺陷，可采用方差分析。

方差分析基本思想是將數據的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構造F統計量，作F檢驗，即可判斷因素作用是否顯著。

方差分析基本思想是將數據的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構造F統計量，作F檢驗，即可判斷因素作用是否顯著

5.2.1 偏差平方和

1616

nS總?（y?

n?1

2?y）?2

j2?n?12jyn?CT?IV2j2CT?G21616,G??n?1yn,f總?16?1?15S因素?Ij?II?III4?CT

Ij、IIj、IIIj、IVj分別表示第j列中1,2,3,4水平對應的試驗結果之和。

總偏差平方和＝各列因素偏差平方和+誤差偏差平方和。

5.2.2自由度

f總=試驗的次數-1；f因=因素的水平數-1。

5.2.3方差

A因素的方差=A因素的偏差平方和/A因素的自由度

誤差的方差=誤差的偏差平方和/誤差的自由度

5.2.4構造F統計量

5.2.5列方差分析表，作F檢驗

? 當FA>F0.01(f1，f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有高度顯著地影響，記作**。當F0.01(f1,f2)>FA>F0.05(f1,f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有顯著地影響，記作*。當F0.05(f1,f2)>FA>F0.10(f1,f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有一定的影響，記作*-。

查表可得F0.01(f1，f2)、F0.05(f1,f2)、F0.10(f1,f2)的值。

6、驗證試驗結果

經結果分析得出最優生產條件，進行最優試驗條件的驗證。

7、結論

通過了驗證試驗，最后可以得出結論。

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學,1986,2:42-48.[12] 王大元.經濟作物組織培養[M].北京:科學出版社,1988:73-78.[作者簡介] 孫百虎（1981-）男，陜西西安人，助教，天津大學在讀碩士，研究方向：生物技術。

S因素

F因素?f因素S誤差

f誤差

第五篇：植物細胞工程總結

緒論

1, 細胞工程：是應用細胞生物學和分子生物學方法，借助工程學的實驗方法或技術，在細胞水

平上研究改造生物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞、細胞產品或新生物體的有關理論和技術方法的學科。廣義的細胞工程包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養技術。狹義的細胞工程是指細胞融合和細胞培養技術。

根據研究對象的不同，高等生物的細胞工程分為動物細胞工程和植物細胞工程。動物細胞工程包括細胞培養技術（包括組織培養、器官培養），細胞融合技術，胚胎工程技術（核移植、胚胎分割等），克隆技術（單細胞系克隆、器官克隆和個體克隆）。植物細胞工程包括植物組織、器官培養技術，細胞培養技術，原生質體融合與培養技術，亞細胞水平的操作技術等。

2, 植物細胞工程：以植物組織細胞為基本單位，在離體條件下進行培養、繁殖或人為的精細操 作，使細胞得某些生物學特性按人們的意愿發生改變，從而改良品種或創造新物種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用物質的過程稱… 植物細胞工程的應用：

1，利用細胞融合技術，克服遠緣雜交不親和性。2，利用培養變異，篩選優良的突變體。3，倍性育種，縮短育種年限。

4, 離體種質保存。5，細胞培養生產有用的物質。第二章

一，實驗室設置及內部設備

實驗室建設應考慮的問題：

1、實驗的性質

2、實驗室的規模

細胞工程實驗室: 基本實驗室:準備室、無菌操作室、培養室 貯藏室 輔助實驗室：細胞學實驗室、生化分析實驗室 溫室

1、準備室

完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養基分裝及高壓滅菌；器皿、材料的洗滌等工作。

主要設備

純水器 工作臺 藥品廚 天平電磁爐 冰箱 玻璃器皿 酸度計 高壓滅菌鍋 干燥箱等

2、無菌操作室（接種室）

用于植物材料的消毒、接種、培養物的轉移、原生質體的制備以及一切需要進行無菌操作的技術程序。

接種室應用推拉門，設有緩沖間，面積2m2為宜。進入接種室前更衣換鞋，減少帶入接種室雜菌。

接種室主要設備

超凈工作臺 ：每次實驗前要用紫外燈滅菌20min，關掉紫外燈開始工作，工作過程中注意一直開著吹風機。

無菌操作用具： 離心機 細胞融合儀

3、培養室

用于接種材料的培養。培養室的大小可根據需要培養架的大小、數目、及其他附屬設備而定。其設計以充分利用空間和節省能源為原則?？刂疲簻囟取⒐庹铡穸?。

培養室主要設備：培養架 空調 時控器 自動開燈、關燈溫度自動記錄儀 搖床 二，培養基

1，培養基的種類

培養基根據其態相不同分為固體培養基與液體培養基。根據培養物的培養過程，培養基分為初代培養基和繼代培養基。根據作用不同，培養基為誘導培養基、增殖培養基和生根培養基。根據營養水平不同，培養基分為許多種,常用如下：（1）MS培養基：富鹽平衡培養基（還有LS、BL、ER）

特點: ①無機鹽濃度較高，元素比例合適，是較穩定的平衡溶液；②微量元素種類齊全； ③營養豐富。

（2）B5培養基 ：高硝態氮培養基（還有N6和SH培養基）

特點: ①硝酸鉀含量高； ②氨態氮含量低； ③ VB1含量較高。（3）N6培養基：高硝態氮培養基

特點：硝態氮含量高，氨態氮含量較低。

（4）White培養基：低鹽培養基（還有WS、HE、改良Nitsch等 特點：無機鹽含量低，有機成分也很低，適于生根培養。（5）KM-8P培養基：

特點:有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質融合的培養。培養基成分：水 無機鹽 有機成分 植物激素 培養物支持材料 輔助性物質 2，植物激素的應用規律

①先Aux后CKs處理,有利于細胞分裂但不利于細胞分化。容易產生多倍體細胞（核分裂和胞壁形成不同步所至），cks有利于胞壁形成。

②先CKs 后Aux處理，細胞分裂也分化(可能是內源生長素起作用)③ Aux 和CKs 同時處理，分化率提高。Aux與CKs的比值改變形態建成的方向。

高 有利根分化，抑制芽形成； Aux / CKs 適中 促進愈傷組織生長；

低 有利芽分化，抑制根形成；

在組織培養中生長調節物質的使用濃度，因植物的種類、部位、時期、內源激素等的不同而異, 培養基配制：

1、確定配方

2、移母液

3、定容

4、稱蔗糖

5、調PH值（用0.1MNaOH或HCl調PH值為5.8）

6、培養基熬制（加瓊脂）

7、分裝（100ml的三角瓶約裝入30－40ml, 30瓶/L）

8、扎口

9、滅菌

10、接種 三，植物材料滅菌

滅菌方法 ①.培養基滅菌：高壓濕熱滅菌，某些激素采用過濾滅菌

②.玻璃器皿滅菌：干熱滅菌：150℃ 40min;120℃ 2h，濕熱滅菌：121℃, 30min 接種前用酒精棉球擦試，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。

③.接種工具滅菌：用前干熱滅菌，用前濕熱滅菌，接種前用酒精棉球擦試，浸入95%酒精液中，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。電熱石英砂滅菌器 ④.實驗服、口罩滅菌：濕熱滅菌

⑤.接種室滅菌 ：紫外燈照射(接種室、超凈臺)：波長260nm，距離小于1.2m，15-20min。臭氧滅菌機：1-2h,熏蒸滅菌：(5-8ml甲醛+5g高錳酸鉀)/ m3 ,接種臺噴霧消毒：75%酒精。⑥.培養室滅菌 : 新建培養室用前要徹底熏蒸1次。

隔1周用洗衣粉水或來蘇水拖地1次，用高錳酸鉀擦架1次。

⑦.物體表面滅菌: 滅菌方式：噴霧、涂抹殺菌 ,范圍：超凈臺的臺面和四壁、雙手 消毒劑：70%酒精；1-2%來蘇水；1%新潔爾滅等。

⑧.接種材料消毒: A, 取材 營養器官：根、莖尖、莖段、葉片等

生殖器官：胚胎（胚、胚珠、胚乳等）和花藥 等

外植體〔explant〕：從植物體上分離下來的用于離體培養的材料 外植體滅菌

用化學滅菌劑滅菌

消毒步驟：①流水沖洗或洗衣粉漂洗②用化學滅菌劑浸潤消毒通常：70%酒精30S，0.1%升汞4-10min。表面有較厚蠟質層的的可加吐溫-20或吐溫-80等浸潤劑(滅菌液的0.5%)。③無菌水沖洗3-5次。注：滅菌液要浸沒材料 第三章 植物細胞全能性與形態發生

一、植物細胞全能性(totipotency)：植物體每個正常細胞都含有該植物的全部遺傳信息，在適宜的條件下如同受精卵一樣, 具有發育成完整植株的潛在能力。

細胞分化〔cell differentiation〕指由于細胞分工而導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在發育方式改變的過程。細胞脫分化〔cell dedifferentiation〕培養條件下使一個已分化的細胞失去已分化細胞的典型特征，或消除了細胞分工，使之回復到分生細胞狀態或胚性細胞狀態的過程?；蚓哂刑禺惤Y構和功能的細胞轉化成沒有特異結構和功能的細胞的過程。

愈傷組織〔callus〕植物離體培養過程中脫分化后的細胞，經過細胞分裂，產生的無組織結構、無明顯極性、松散的細胞團稱為愈傷組織。多在外植體切面上產生。

愈傷組織的特征：細胞分裂快，結構疏散，缺少有組織的結構，顏色淺而透明。成功地脫分化將導致細胞分裂，形成愈傷組織或胚性細胞團。

植物胚胎干細胞：植物連續的器官分化是由頂端分生組織細胞發育而成，因此，植物頂端分生組織細胞具有較強的表達全能性的能力，被稱為植物胚胎干細胞。

生理脫離效應;當細胞或組織脫離母體以后，在適宜的條件下將進行一些特殊的發育方式，如再生、復壯等，child將其稱為生理脫離效應

（細胞）或（組織）與母體分離和激素的調控是細胞全能性表達的前提。在離體培養條件下，細胞全能性的表達是通過細胞脫分化和再分化實現的。脫分化是細胞全能性的表達前提，再分化是細胞全能性的表達最終體現。

靜止細胞(G0細胞)啟動分裂是分化細胞成功脫分化的重要標志。

細胞脫分化的三個階段 ：1，啟動階段 細胞質增生并開始向細胞中央伸出細胞質絲，液泡蛋白出現。2，演變階段 細胞核向中央移動，質體轉變為原質體 3，脫分化終結期，回復到分生組織。

細胞再分化〔redifferentiatio〕脫分化后無序生長的分生細胞在離體培養下，重新恢復細胞分化能力，經過細胞分化、組織分化和器官分化遞進地進行，最后再生完整植株。

極性(polarity)：植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態結構以及生理生化上的梯度差異。細胞的不均等分裂是細胞極性建立的標志（即細胞分化的標志）。激素在植物生長發育中具有重要的調控作用，也是離體培養條件下，調控細胞脫分化和再分化的主要因素。其中生長素和細胞分裂素是兩類主要的調控培養條件下細胞生長和分化的植物激素。

在離體培養條件下TEs則由愈傷組織薄壁細胞分化形成這是愈傷組織細胞分化器官的前提。植物的離體器官發生：培養條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。

離體培養中器官發生的方式

通過器官發生形成再生植株大體上有3種方式：

①先芽后根:是應該選擇的方式.②先根后芽 ③根芽同長 植物細胞經再分化形成植株有2條途徑：（在離體培養條件下）器官發生 體細胞胚胎發生 體細胞胚（胚狀體、體胚）：指離體培養下沒有經過受精過程，但經過了胚胎發育過程所形成的胚的類似物。

胚狀體有以下幾方面的界定：

①體細胞胚是離體培養的產物，只限于在離體培養范圍使用，以區別于無融合生殖胚；②體 3 細胞胚起源于非合子細胞，以區別于合子胚；③體細胞胚經過了胚胎發育過程，以區別與離體培中器官發生形成個體的途徑。

經過愈傷組織的胚胎發生需要3個培養階段： ①誘導外植體形成愈傷組織；②誘導愈傷組織胚性化，③體細胞胚形成。體細胞胚的結構與發育特點

1、與器官發生途徑相比，體細胞胚在組織學上有3個特征： ①體細胞胚最根本的特征是具有雙極性，即在發育的早期階段從方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都是單極性的；

②體細胞胚的維管組織與外植體現存組織無解剖結構上的聯系，而不定根或不定芽與外植體或愈傷組織的維管組織有聯系。

③體細胞胚胎的維管組織分布是獨立的Y字形結構，不定芽維管組織無此結構。人工種子：（狹義）植物離體培養中產生的體細胞胚，包裹在含有養分和具有保護功能的物質中，并在適宜條件下能夠發芽出苗的顆粒體。

（廣義）在體細胞胚、微型營養變態器官、不定芽等微繁體之外加上必要的營養成分后，用具有一定通透性而無毒的材料將其包裹起來，形成的與天然種子相似的顆粒體。第四章 離體培養下的遺傳與變異

離體培養中的遺傳與變異特點：

1、普遍性：變異可發生在各種培養類型中； 變異發生在各種植物的培養中；變異發生與培養類型有關。

2、局限性：一些單基因控制的性狀不僅發生隱形突變，也發生顯性突變。

3、嵌合性：是指同一有機體中同時存在有遺傳組成不同的細胞它是組織培養中常見的現象。體細胞變異誘導材料的選擇：其一，目標性狀的可行性。體細胞突變的頻率雖然較高，但對于某一個體來講，變異的性狀是個別的，因此選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過誘變改變個別不良性狀，是體細胞突變系選擇的目的。其二，必需充分考慮試驗植物的細胞培養技術水平，只有對起始材料有良好的培養技術，才有可能制定完滿的誘變及選擇方案。如果起始細胞的培養技術不成熟，不能再生整株，則不能進行后續的各項操作。其三，適當的細胞類型亦是提高體細胞突變系篩選效率的重要條件。第五章植物主要的組織培養技術 第一節快繁

無性繁殖途徑：

1、無融合生殖：即不經過減數分裂和受精而形成種子。

2、營養繁殖：即由母株的營養體部分再生出新的植株 植物離體快速無性繁殖：利用離體培養技術,用優良植株的外植體進行培養,在短期內獲得大量遺傳一致的個體的方法，這種離體無性繁殖方法由于繁殖速度快，又稱離體快速無性繁殖。所獲得的株群稱單株無性系或單芽無性系

初代培養 ：芽、莖段、葉片等外植體在離體培養條件下誘導愈傷組織、側芽或不定芽、胚狀體過程。即接種某種外植體后，最初的幾代培養。

生根培養：將芽苗轉接到生根培養基上培養成為完整植株的過程 植物快繁常見問題及對策：

（一）污染的原因及預防：原因：細菌、真菌為病源菌；污染途徑有外植體帶菌，培養基及器皿滅菌不徹底，操作人員未遵守操作規程，環境不清潔。預防措施：（1）防止材料帶菌：避免陰雨天在室外采集外植體；春秋組培；材料預培養。（2）嚴格外植體滅菌（3）接種用具滅菌徹底（4）嚴守無菌操作規程（5）保持培養室清潔

（二）褐變的原因及預防原因（1）植物品種（基因型）（2）生理狀態（3）培養條件（4）材料轉接季節 防止措施（1）選擇適宜的外植體（2）連續轉接3）先液體培養再固體培養（4）加抗氧化劑（5）選擇合適的培養條件加活性炭或 暗處培養。

（三）玻璃化的原因及預防原因：

（1）激素濃度（尤其CTK）高（2）瓊脂濃度低（3）光照弱（4）溫度高（5）通風條件不好（6）培養基離子種類及比例不適宜 預防措施：（1）適當控制培養基中無機鹽成分，適當提高蔗糖和瓊脂濃度，減少含氮化合物的用量，降低培養基的水勢。（2）適當降低CTK的濃度。考慮加入適當的脫落酸。（3）增加自然光照；增加容器通氣，控制溫度。（4）加入活性炭、多效唑或CCC等物質。第二節、植物脫毒快繁技術 1熱處理脫毒原理：

①病毒是DNA大分子，病毒進入植物細胞后，隨植物細胞DNA一起復制。熱處理并不能殺死細胞，只是鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內增殖減緩或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。

②熱處理是一種物理效應，可加速植物細胞分裂，在激烈分裂的細胞中正常核蛋白合成占優勢，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。因此加速分生組織細胞的分裂，能夠獲得無病毒植株。

2、熱處理脫毒方法：(1)溫湯浸漬處理 適用于休眠器官，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。(2)熱空氣處理 熱空氣處理對活躍生長的莖尖效果較好。將生長的盆栽植株移入溫熱治療箱內（35-40℃）處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達數月。

分生組織不帶病毒，可能有4方面的原因：

1、植物體病毒的移動主要靠2條途徑：一是通過維管系統，而分生組織中尚未形成維管系統；二是通過胞間連絲，但這條途徑病毒移動速度非常慢，趕不上莖尖和根尖細胞不斷分裂和活躍的生長速度。

2、當植物細胞分裂DNA復制時，病毒DNA隨著復制。因此，植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭。在旺盛分裂的分生組織中，代謝活動很高，正常核蛋白合成占優勢，使病毒無法進行復制。

3、莖尖中存在高水平內源激素，可抑制病毒的增殖。

4、在植物體內存在有一種“病毒鈍化系統”，在分生組織中的活性最高，因而使分生組織不受侵染。

第三節 花藥和花粉的培養

花藥培養:將花粉發育至一定階段的花藥培養在人工培養基上，誘導其花粉粒改變發育進程，形成花粉胚或愈傷組織，進而分化成苗的過程。（器官培養）花粉培養(小孢子培養)：將發育至一定階段花粉從花藥中分離出來成為分散或游離狀態，花粉脫分化后再生成苗。（細胞培養）

單倍體：具有配子體染色體數的孢子體。

單倍體植物3個明顯特點：

1、體細胞染色體數減半

2、生長發育弱，體形小

3、雌雄配子嚴重不育

花藥、花粉培養的意義

1、迅速獲得純合型材料，提高選擇效率，縮短育種年限

2、獲得育種中間材料

3、突變體選育

4、體細胞融合5、遺傳研究

6、獲得染色體異附加系和代換系

7、遺傳工程受體 花粉植株再生途徑：

1、經由成愈傷組織再生植株

2、經由胚狀體再生植株 花粉分離收集：

由于花粉包于花藥內，必須將它們從花藥中分離、收集才能進行培養。方法： 1）花粉漂浮自然釋放法:將花藥接種于液體培養中，使花粉自然釋放。2）人工擠壓法:用玻璃棒搗碎花藥使花粉釋放。

3）機械法:用磁力攪拌器打碎花藥釋放花粉。

釋放的花粉粒→ 尼龍網（孔徑20—60um）過濾，除去藥壁等組織 → 500-1000轉/分離心1-5分鐘，收集花粉。

花藥培養過程中花藥為什么要經過低溫處理 低溫處理的作用機理：

1）預處理引起花藥、花粉內源激素發生變化，改變了小孢子（花粉粒）第一次有絲分裂的軸向發育（正常發育時，兩次有絲分裂形成三核花粉粒），進而形成愈傷組織或胚狀體。2）提高小孢子的生活力，延緩退化速度，而提高了誘導率。

3）引起小孢子孤立化，即小孢子從花藥中分離。因為低溫處理過程中，花藥內薄壁細胞和絨氈層逐漸退化，從而切斷與小孢子之間的聯系。花藥培養時為什么要用較高濃度蔗糖和較低濃度激素？

蔗糖濃度 培養基中蔗糖濃度比其它組織培養高，尤其早期培養，一般5%—10%原因是花粉母細胞的滲透壓比花絲等體細胞高，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細胞的生長，而利于花粉的生長。

激素 花藥壁分化程度高，重新分裂需要較高的激素濃度才能啟動。因此，花藥培養基的激素水平要相對較低才能抑制二倍體細胞的分裂。確定適宜的激素濃度，以促使花粉細胞分裂的同時又抑制花藥二倍體細胞分裂是成功獲得單倍體的關鍵。第四節 胚胎培養

胚胎培養類型 胚培養 胚乳培養 子房培養 胚珠培養

胚培養概念：無菌條件下，把胚從種子、子房或胚珠中分離出來，在培養基上進一步生長發育形成幼苗的過程。

成熟胚培養：是指子葉已形成的種胚。僅提供一定的溫度、濕度就可以發芽生成植物體。如種子的發育

成熟胚培養意義：克服發芽障礙；打破種子休眠，縮短育種周期等。幼胚培養：胚齡處于原胚期、球形胚、心形期、早魚雷期的培養。

幼胚培養意義：

1、克服遠緣雜交不育

2、克服珠心胚干擾，提高育種效率

3、幼胚具有較高再生能力，可通過體細胞胚胎發生產生大量的再生植株。

4、為原生質體培養、細胞融合及基因轉化提供試驗材料。幼胚培養時胚的發育方式有哪幾種？各有何特點？

① 胚性發育：幼胚的離體培養，仍按在活體內的發育方式發育，最后形成成熟胚，然后再按種子萌發途徑出苗形成完整植株，這種途徑發育的幼胚一般一個幼胚將來就是一個植株

② 早熟萌發：離體胚不繼續胚性生長，而是在培養基上迅速萌發成幼苗，通常稱為早熟萌發。在大多數情況下，一個幼胚萌發成一個植株，但有時會由于細胞分裂產生大量的胚性細胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現象就是所謂的叢生胚現象。

③愈傷組織：在許多情況下，幼胚的離體培養首先發生細胞增殖，形成愈傷組織。一般來講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。胚乳按發育初期是否形成細胞壁分為①核型胚乳②細胞型胚乳③沼生目型胚乳 試管受精：培養未受精的胚珠或子房并在試管內撒播花粉，使其受精形成具有生活力的種子。未授粉胚珠子房培養與授粉后胚珠子房培養有何不同？

根據培養的胚珠是否受精將胚珠培養分為受精胚珠的培養和未受精的胚珠的培養。(1)未受精的胚珠的培養,目的是為試管受精提供雌配子體。(2)受精后胚珠的培養,胚珠內胚的發育處于早期階段,從兩個細胞的原胚開始至球形胚階段。

第六章 植物細胞培養及次生產物代謝生產

植物細胞培養：是指在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養使其 增殖的技術.培養方法：培養規模:小規模培養 大批量培養

培養方式:懸浮培養平板培養 看護培養 產物不同:誘變培養 次生產物培養

培養方式：懸浮培養、單細胞培養、植物細胞的規?；囵B及有用物質生產

懸浮培養（cell suspension culture）懸浮培養是細胞培養的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養基進行培養增殖的技術。

成功的懸浮細胞培養體系必須滿足3個條件：

1、浮懸培養物分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下，在實際培養中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。

2、均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。

3、細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可增加1倍。

培養周期的概念 具有一定起始培養密度的單細胞，從開始培養到細胞數目和總重量增長停止這一過程，稱為一個培養周期。

懸浮細胞培養的同步化：指同一懸浮培養體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。（植物細胞在懸浮培養中的游離性較差，容易團聚進入不同程度的分化狀態，因此要達到完全同步化相當困難。）

細胞同步化的方法：①分選法：通過細胞體積大小分級，直接將處于相同周期的細胞進行分選，然后將同一狀態的細胞繼代培養于同一培養體系中。

②饑餓法：在一個培養體系中，如果細胞生長的基本成分喪失，則導致細胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時期。

③抑制劑法：通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期—G1期的同步化細胞。④低溫法：冷處理也可提高培養體系中細胞同步化程度。

單細胞培養

1、平板培養

2、看護培養

3、微室培養

4、雙層濾紙培養 植物次生代謝產物：植物中一大類并非植物生長發育所必需的小分子有機化合物，其產生和分布通常有種屬、器官組織和生長發育期的特異性。次生產物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。

植物細胞大規模培養的技術要求：從細胞生長與培養技術方面講必須滿足以下3個條件

1、培養的細胞在遺傳上應是穩定的，以得到產量恒定的產物。

2、細胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內能得到較高產量的終產物。

3、代謝產物要在細胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養基中。固定化培養系統--固定化培養技術的優點在于：

1、可以較容易地控制培養系統的理化環境，從而可以研究特定的代謝途徑，并便于調節；

2、細胞位置的固定使其所處的環境類似于在植物體中所處的狀態，相互間接觸密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生產物的合成；

3、由于細胞固定在支持物上，培養基可以不斷更換，可以從培養基中提取產物，免除了培養基中因含有過多的初生產物對細胞代謝的反饋抑制，也由于細胞留在反應器中，新的培養基可以再次利用這些細胞生產初生產物，從而節省了生產細胞所付出的時間和費用；

4、正是由于細胞固定在一定的介質中，并可以從培養基中不斷提取產物，因此，它可以進行連續生產。

利用細胞培養生產有用物質的一般程序

1、選材 應注意條件：①藥效肯定②對其有效成分有充分的了解④市場短缺或價格昂貴；③有測定有效成分和藥理的可靠方法⑤取有藥效成分的部位，且該部位較易形成愈傷組織。

2、細胞株系建立

3、大量培養

4、產品提取與純化 第七章 原生質體培養與融合 原生質體（Protoplast）：去掉細胞壁的由質膜包裹、具有生活力的裸露細胞。

亞原生質體(subprotoplast)：在原生質體分離過程中，有時會引起細胞內含物的斷裂而形成一些較小的原生質體就叫做亞原生質體。它可以具有細胞核或沒有細胞核。

核質體(nuclearplast)：由原生質膜和薄層細胞質包圍細胞核形成的小原生質體。也稱為微小原生質體(miniprotoplast)。

胞質體（cytoplast）：不含細胞核而僅含有部分細胞質的原生質體。

原生質體材料預處理(暗處理，預培養和低溫處理)原因：預質壁分離可使胞壁內表層充分暴露，增加胞壁降解酶與胞壁的接觸面而提高胞壁降解速度；降低原生質體內電解質滲漏，防止在分離期間外來酶被吸入細胞內，降低原生質體對酶液中可能存在的有害影響的敏感，提高原生質體的穩定性和存活率。原生質體純化方法有：

離心沉淀法 原理：應用原生質體的比重大于溶液，離心后原生質體沉于底部。漂浮法 原理：應用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質體漂浮在液體的表面。

接口法 原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質體的密度，另一種溶液的密度小于原生質體的密度，原生質體介于兩種溶液之間。原生質體培養方法

1、固體包埋培養（原生質體純化后，離心，用培養基稀釋至一定密度，再與0.6%瓊脂或低溶點瓊脂糖（37?C左右）混合，培養于培養皿中。）

2、固體平板培養

優點：可以跟蹤觀察單個原生質體的發育情況，易于統計原生質體分裂頻率。缺點: 操作要求嚴格，尤其是混合時的溫度掌握必需合適，溫度偏高則影響原生質體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質體不易混合均勻。

3、液體淺層培養(將含有原生質體的培養液在培養皿底部鋪一薄層，封口后進行培養。)優點：操作簡單，對原生質體的損傷小，且易于添加新鮮培養基轉移培養物。缺點：原生質體分布不均勻，常常發生原生質體之間的粘連現象而影響其進一步的生長和發育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發育情況。

4、固、液培養 優點：固體培養基中的營養物質可緩慢釋放到液體培養基中，如果在下層固體培養基中加一定量的活性炭，則還可以吸附培養物產生的一些有害物質，促進原生質體的分裂和細胞團的形成。

缺點：不易觀察細胞的發育過程。

5、共培養法（將生長迅速的原生質體培養物與難于培養的原生質體混合）

6、瓊脂糖珠培養

7、飼養層培養

原生質體再生：再生細胞壁、細胞分裂和生長、植株再生（愈傷組織形成）

原生質體融合又稱體細胞雜交是指將植物不同種、屬甚至科間的原生質體通過人工誘導融合，然后進行離體培養，使其再生雜種植株的技術。融合方法

1、NaNO3法 NaNO3的作用：中和質膜的負電荷，使原生質體不再相互排斥，而緊密結合 8 在一起 不足：誘導頻率不高。

2、高pH-高Ca離子法 優點：雜種產量高。不足：高pH值對細胞有毒害作用

3、PEG法 特點：融合頻率高、可重復性強、誘發融合無特異性、毒性較低

4、電融合法 特點 不存在對細胞毒害的問題、融合效率高、融合技術操作簡便 原生質體的融合過程包括3個主要階段：1)兩個或多個原生質體的質膜彼此靠近； 2)局部區域質膜緊密粘連，彼此融合；3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。供體-受體式細胞融合包括非對稱雜交和細胞質雜交兩種方式。

非對稱雜交是一親本的細胞核和細胞質與另一親本的少量核物質(1～2條染色體)和全部細胞質融合；

細胞質雜交是一親本的細胞核和細胞質及另一親本的全部細胞質融合，可能使兩種來源不同的核外遺傳成分(細胞器)與一個特定的核基因組結合在一起，這種雜種叫細胞質雜種。第九章后

1, 超低溫通常是指-80℃以下的低溫。常用的保存介質或容器有：超低溫冰箱（-80～-150℃）、液氮（-196℃）和液氮蒸汽箱(-140℃液氮)等。

2, 用于離體超低溫保存的植物材料一般有愈傷組織、懸浮細胞、胚、花粉和莖尖等。3, 細胞內外水的凍結狀態時細胞凍存技術的關鍵。

4, 種質超低溫保存的關鍵是降溫冰凍過程中避免細胞內結冰。在降溫過程中必須使細胞發生適當程度的保護性脫水，使細胞內外的水流到細胞外結冰，并且在化凍過程中防止細胞內次生結冰。因此針對不同種類的植物材料，篩選合適的冰凍保護劑，采用適當的降溫冰凍速度和化凍方式可能使細胞不受損傷或使損傷減小到最低程度。

5, 超低溫保存植物種質資源的程序包括培養材料的準備、預處理、冰凍及保存、化凍處理、細胞活力和變異的評價及植株再生等幾個步驟。

6, 降溫方法從降溫方式來看，有快速冰凍法、慢速冰凍法、兩步冰凍法和逐級冰凍法等。7, 玻璃化：是指液體轉變為非晶體的固化過程。使溶液玻璃化得兩條途徑：大幅度提高冷卻速率和增加溶液的濃度。

8, 玻璃化溶液（PVS1）,其中包含了20.5％的DMSO、15.5％的乙酰胺、10％的1,2-丙二醇以及6％的聚乙二醇，他們分別起到冰凍保護、毒性中和、強化玻璃化和非滲透聚合的作用。9, 超低溫保存方法主要有：玻璃化法、包埋玻璃化法、干燥法、預培養法、預培養-干燥法和包埋脫水法。

10, 包埋脫水法的三個步驟：先將材料用藻酸鈣包埋，然后將包埋后含有保存材料的藻酸鈣小珠在含有高濃度（或梯度濃度）蔗糖的培養基上預培養，最后侵入液氮。

11, 玻璃化法是將生物材料經極高濃度的玻璃化溶液快速脫水后直接投入液氮，使生物材料連同玻璃化溶液發生玻璃化轉變，進入玻璃態。

12, 材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性及器官、組織和細胞的年齡及生理狀態。13, 冰凍保護劑具有的特點：易溶于水、對細胞無毒，容易從組織細胞中清除。冰凍保護劑的作用主要表現在：增加膜透性，加速細胞內的水流到細胞外結冰，穩定細胞膜結構，阻止低溫傷害，降低冰點，提高容液的粘滯性，阻止冰晶生長。