第一篇：塑封機的工作原理與操作方法淺析

塑封機的工作原理與操作方法淺析

編輯：湖湘文印聯盟

塑封機的工作原理是在電機的拖動下保持勻速轉動，通過發熱裝置將膠輥加熱，加上一定的壓力，兩張預涂膠的塑封膜相對粘貼在被塑封物上。

由此看出，在工作時，膠輥的損耗是比較大的，因此在保養時，應該特別注意膠輥的保養與維護。另外，我們在平時操作機器時，也應注意操作方法，切忌錯誤操作；這樣在保養時可以省些麻煩，延長機器的使用壽命。

塑封機的操作方法介紹：

1、將塑封機平穩妥放置在工作平臺上。

2、將控制面板上的調節溫度旋鈕，置于溫度較低的刻度位置，電源開關在關的位置。

3、接通電源，插頭要插按牢靠，打開電源開關，紅色電源指示燈亮，塑封機同時開始升溫。

4、根據塑封膜熱熔溫度的高低和劃片厚度的不同，調節溫度旋鈕，設定適宜的溫度。

5、當綠色指示燈亮時，表示溫度已到設定溫度可以進行塑封工作。

6、將塑封膜分開，將資料頁夾在中間，使塑封膜的涂膠面面對被塑封物，然后將塑封膜合上。

7、從前向后送入塑封機中加熱，經前后膠輥對壓后，從后工作面板輸出，即可得到良好的塑封件。

8、塑封工作結束后，不要立即關機，首先將溫度調節旋鈕置于最低溫度刻度位置，運轉5分鐘后再關機，以利膠輥使用壽命。

9、關機時先關掉電源開關，然后切斷電源。

第二篇：高中史料教學的原理與操作方法

高中史料教學的原理與操作方法

王錫文（廣東省中小學教師工作室，特級教師）

“歷史是一門既包括描述也包括解釋的學科。”隨著歷史課程改革的推進，史料教學的重要性將越來越突出。運用史料解釋歷史、還原歷史現場，進而理解歷史成為新課程改革以來中學歷史課堂教學改革的亮點之一，也是實現三維目標的必由途徑。可以說，幾乎每一節歷史課，都會有史料教學的環節。同時，在近幾年來的高考命題改革中，作為一種重要的能力考查目標，史料分析的色彩和比重在試卷中將越來越顯著。幾乎可以說，“沒有史料無以成題”。

一、歷史史料教學的地位和現狀

（一）歷史史料的分類

史料是研究和認識歷史的依據，是“重現”歷史的基礎。一般來說，史料愈是確鑿、豐富，人們經過研究和解釋，對歷史的認識也就愈是真切，對歷史的“重現”也就愈接近它的本來面貌。史學專家們一般把史料分為三類，即文獻史料、實物史料、口述史料。．文獻史料。一切以文字形式記載的資料，如官私史書、文書檔案、文集日記、野史筆記，以及各方面的書籍和近代以來出現的報刊、雜志等；也包括了碑刻、摩崖，以及考古發現的甲骨文、金文、簡帛、墓志等都屬于文獻史料。今天，除了以紙張為載體的文獻資料以外，還有大量以電子媒介為載體的文獻資料。對于世界上發生的大小事件，人們通過電子郵件、BBS 跟帖等方式表明自己的態度，歷史記載變得更加豐富多樣，也為我們利用好文獻史料組織教學活動提供更為廣闊的資源。．實物史料。是歷史上人類活動遺留下來的各種物件，主要是各種歷史遺存和考古發現，如遺址、墓葬及出土文物等。．口述史料。是指人們口頭講述并被記錄下來的資料，其記錄的方式有筆錄、錄音、錄像等多種。這些資料包括神話、傳說、故事、史詩、俗諺、遺訓，以及回憶錄、對話錄、采訪記、座談錄音等。

從另外一個角度分類，也可以把史料大體分為第一手史料和第二手史料。一般說來，第一手史料是指原始資料，即歷史人物、事件、現象發生的那個時代留下來的材料，特別是當事人和目擊者提供的史料，直接反映了所研究對象的情況；第二手史料是指距離那個時代較遠的記錄、轉述，或者后人的研究成果，間接反映了研究對象的情況。一般來說，第一手史料的史料價值較高，但也不是絕對，古人說：“不識廬山真面目，只緣身在此山中。”史料的撰寫者，有時也會“當局者迷”，反倒不如后人或者局外人看得全面、客觀。

（二）當前歷史史料教學的現狀

當前史料教學進行得如火如荼，涌現了大量優秀的教學案例。下面談談一些問題。第一，教師的理念沒有跟上。不少教師僅僅是把史料教學理解為史料的簡單堆積，并沒有把史料教學與三維目標緊密聯系，更沒有有意識地培養學生的質疑精神和質疑的能力。在課堂上，給出大量史料，也只是做“依靠教材既定論點，加以佐證”的工作而已。這樣的話，違背了史料教學法的初衷。史料教學的教學目標是什么？用什么方法比較好？培養學生的基本能力有哪些？等這些基本問題搞清楚了，才有助于歷史教師在使用史料教學中高效勝出。

第二，學生的能力有待提高。在目前的教法下，大多數學生“史從證來、論從史出、史論結合”的歷史思維能力沒有得到很好培養，質疑意識和質疑能力比較低下。日常學生對教師的提問，大部分僅僅局限于自己對教材或者自己在建構知識網絡時遇到了不懂的地方，是一種對文本低級的疑惑。而質疑，應該是一種超越文本對問題提出自己看法的意識和能力。在很多地方，課堂還是教師一言堂，并沒有“發揮學生的主體作用”。學生對大量、不同的觀點的史料，顯得無所適從，帶有恐懼感。

第三，史料的獲取途徑狹窄。也許這個本來不應該是問題，但是卻是制約史料教學的另一大因素。捫心自問，除了大學時候的教材和工作之后斷斷續續買了幾本書，我們手頭上還有什么別的資料？日常大量瑣碎的工作占據了中學教師不少的時間，使得我們無暇看書，漸漸與高校的學術研究脫節。

第四，教學時間安排失當。一節四十分鐘或者四十五分鐘的歷史課，應該如何合理安排呢？指導學生閱讀史料的時間是多少呢？學生練習的時間又是多少呢？不少老師都比較糊涂。

二、例談歷史史料教學的策略與方法

在實際教學活動中，如何鑒別史料、選擇史料、分析史料，不少一線教師都遇到了困惑。本視頻試圖從這些問題著手，拋磚引玉，希望給廣大教師提供參考。

（一）從哪里選取史料

史海浩瀚，單文字史料就多如牛毛，隨著時代的發展，史料的記載方式還包括了圖片、音頻、視頻等。史料如此豐富，史料的來源當然也豐富多樣的，獲取的途徑相當多。

作為中學教師，史料的來源首推教科書，教科書的大字小字、插圖等是教材編者精心選取的，是課堂教學的第一材料，平時在教學中應充分利用好課本的素材。其次，可以從網絡上擷取史料。一般采用關鍵詞、關鍵句搜索的辦法就可以找到相關史料，相當方便；另外還有不少網站提供大量的學術史料。但網絡資料有其自身弊端，教師在采納網絡資料的時候要充分鑒別真偽與準確性。

再次，從歷史專業書籍和歷史專業論文中選取。這就意味著廣大一線教師要多關注史學動態，與時俱進，擴大閱讀范圍。

另外，可以從每一年的高考試題和各類模擬題中找史料。近幾年的高考題或模擬題都以“新材料、新情境”出現，涌現了很多新穎的史料，可以為教學所用。除了上述的途徑，還可以通過看新聞、到檔案館或博物館參觀等方式來獲取。總之，方式多種多樣，只要平時多留意多積累，肯定可以構造屬于自己的史料庫。

（二）怎樣選取史料

選取史料組織教學之前，先要明確幾個大的原則：一是根據課程標準，靈活調整教學的目標，并選取史料（更多選取第一手史料），有所偏重；二是根據學生情況來選擇史料（不宜選取文字閱讀量過大的史料），對癥下藥；三是研讀史料，精心設問，置疑解惑；四是選擇多樣化的史料，豐富課堂內容，在觀點的碰撞中鍛煉學生思維；五是帶著問題去研讀史料，多選取能夠激發學生情感、態度、價值觀的史料。

1.根據課程標準，靈活調整教學的目標，并選取史料（更多選取第一手史料），有所偏重

《普通高中歷史課程標準(實驗)》就知識與能力方面的課程標準中明確指出 “在掌握基本歷史知識的過程中，進一步提高閱讀和通過多種途徑獲取歷史信息的能力；通過對歷史事實的分析、綜合、比較、歸納、概括等認知活動，培養歷史思維和解決問題的能力。”其中閱讀與獲取歷史信息，需要在教學中學會運用史料；而對歷史事實的分析更要建立在史料的搜集、甄別與運用上。課標還就教學過程與方法方面提出了“努力做到論從史出、史論結合”、“注重探究學習”、“養成獨立思考的學習習慣”等要求。“探究學習、獨立思考”，需要建立在對歷史本來面貌的認識的基礎上，特別需要進行史料教學；而“論從史出，史論結合”更是對教學中史料的運用提出明確和更高的要求。從國家新課程標準的表述中，不難看出，善于運用史料教學，在中學歷史課堂教學過程中是十分必要的。課標是教材編寫的出發點，更是教師平時備課上課的依據，在史料教學中，應緊緊按照課標的要求，設置每一課的教學目標。華附劉敏老師的《王安石變法》一課的課標要求為：（1）了解王安石變法的歷史背景；

（2）歸納王安石變法的主要內容，評價其歷史作用。在學習新課之前，教師布置了《自學提綱》，加上平時的“通史講壇”活動，學生可以自己掌握變法的歷史背景和主要內容，因此劉老師將課堂的重點列為課標的后部分——評價王安石變法。劉老師通過史料教學來引導學生身臨其境王安石的時代，用歷史的眼光來評價這場偉大的變法，并引導學生聯系改革開放三十年后的今天，得出啟迪，落實情感態度價值觀目標。

相比劉老師的“循規蹈矩”，東莞東華高級中學的李小萍老師的《洋務運動》一課同樣采用了史料教學法，但更顯得“靈活多變”。《洋務運動》一課，在高中三本必修中都有所涉及，分別是必修Ⅰ的第 12 課，必修Ⅱ的第 10 課，必修Ⅲ的第 20 課。課程標準里是這樣規定的：“簡述鴉片戰爭后中國經濟結構的變動和近代民族工業興起的史實，認識近代中國資本主義產生的歷史背景。”“了解鴉片戰爭后中國人學習西方、尋求變革的思想歷程，理解維新思想在近代中國社會發展過程中所起的作用。”顯然，課標的這兩處要求都沒有明確要求把握洋務運動，但岳麓版教材里有關近代中國經濟結構的變動和影響民族工業發展的因素，皆與洋務運動相關。因此，李老師在立足于課程標準的基礎上，根據學生現階段對洋務運動的模糊和片段理解，著力點在閱讀新材料材料，根據新情境，提取信息，得出更人性化的新認識，通過細節來展示一個和學生以往結論中不一樣的洋務運動，針對高三學生提出了這樣的教學目標：“能通過觀念細節的變化分析洋務運動前的時代挑戰；能通過李鴻章和張之洞的洋務人生認識洋務運動艱難曲折的應戰細節；學會通過新材料得出新認識，提升材料分析的史學能力；通過李鴻章和張之洞的洋務人生感悟中國近代歷史改革者的艱難、智慧、局限以及他們事業深遠的影響。”

從上面這兩位教師的教學目標設計，我們可以看出教學活動的設計或教學資源的選取，在一般情況下都是以主題為中軸而展開的；教學設計系統的各個基本構成要素，也是圍繞主題聯結而來的。不管是采用史料教學法，還是使用其它的教學方法，都要先確定好本課的教學主題，即課堂的教學靈魂。

2.根據學生情況來選擇史料（不宜選取文字閱讀量過大的史料），對癥下藥 學生是課堂的主體，學生的情感、行為變化是衡量教學有效性的最重要的尺度之一，史料的選取要根據學生的實際情況。學生在學習本堂課的知識前，他們已有的知識技能怎樣？學習本課主要需要準備哪些學習方式或學習方法，學習本課需要準備怎樣的情感態度與價值觀呢？

為了更好的了解學生的情況，李小萍老師在課前設置了一個問卷調查，要求他們選取其中之一解答，也可全部解答。如下：

（1）洋務運動中的哪些人物你最感興趣，為什么？選取一二簡述。（2）當時的清政府是否需要一場洋務運動？觀點自選，說明之？

（3）洋務運動創辦過程的那個環節你最渴望探求，為什么？試用自己的方式來完成你的心愿。（4）洋務運動的指導思想是什么？你對這個思想的認識和評價是什么？為什么？

（5）在傳統認識里洋務運動的目的是什么？你的觀點有和不同？為什么？（6）洋務運動是否能讓中國富強起來？為什么？（觀點自選，史論結合說明）（7）對洋務運動的評價，史學家范文瀾和胡繩認為“洋務運動是反動的賣國的運動，其作用在于加深了中國的半殖民地化。”，華東師范大學 歷史系教授夏東元指出：洋務運動是“以學習和利用西方先進的科舉技術來維護和拯救清王朝為首的封建統治的活動。”你同意哪些觀點？你怎樣評價洋務思想和洋務運動？你能說明自己的觀察視角和評判標準嗎？從國人對洋務運動前后不同的評價，你認識到了什么？

從學情調查中，教師發現學生對洋務運動中的李鴻章和他的洋務事業有特別的渴望，但是他們缺乏相應的資料，無從探究，也不可能得到更多的認識。針對學生的情況，李老師精心設計了這節課，引導學生在新材料、新情景下重新構建對洋務運動進行全方位的認識和探究，力圖跳出學生已有觀念的限制，引導學生在細節中探尋一個真實的洋務運動和洋務派。

根據學生情況來選擇史料，除了表現在課前的調查和跟蹤，更重要的是表現在針對學生的情況選擇合適的史料，不同年齡和能力的學生需要使用不同形式的史料。高中生閱讀史料，提取要點的能力還有待加強，因此我們課堂選擇的材料最好是那些大眾化、容易理解的史料；并且要對難度較大的原始文獻進行加工和編輯，刪掉文獻中難懂和沒用的部分，當然也不能過分改寫和編輯，以至于改變文獻的原意。

李小萍老師在新課一開始給學生展示了三則簡單有趣的史料“英國人的膝蓋能彎曲嗎？”“夷和洋不一樣嗎？”“胡林翼被嚇暈了。”這三則史料側重于細節，反差較大，在課堂的開始就制造一個思維的沖擊點，在驚奇的刺激下學生的思維被調動。課堂的開頭有凝神、起興之效。第二則史料內部本身有矛盾而且又能和第一個細節對應，二者形成一個相互的比較和發展。第三則史料充滿戲劇性，在課堂上制造笑點之外更能制造思維點。三則史料容易理解，材料之間起到了闡明與沖突的作用，達到了史料教學的效果。

一般來說，對史料的摘引與轉述較可行的方法有三種，一是對那些易于知曉但散于各處的文獻資料，用“摘引”的方法，將有關的文字資料摘出來放在一起來說明某個問題；二是對那些文字難懂且篇幅較大的文獻，宜采用“轉述”的方法，即教師將其內容用通俗易懂的話介紹給學生；三是摘引和轉述兩者相結合，這一種形式常用。

3.研讀史料，精心設問，置疑解惑

一節好課，史料選取是否恰當，有沒有組織學生針對史料進行有效的研討十分重要。有的教師在備課過程中選取了大量的史料，但在教學實踐中卻將這些極有價值的史料只作“走馬觀花”似的瀏覽，這樣就起不到史料教學法的效果。在教學中，史料要精心選取，并且精心設問，方能突顯史料教學的效果。對待典故史料，需要細嚼慢咽，逐句過關。在一些教學內容中，我們常常會引用官私史書、碑刻、墓志等文獻史料。教師對一些冷僻的讀音、字義，難懂的典故等細節，要給予講解，不能粗枝大葉，脫離學生的實際認知情況。

東莞的李小萍老師在上《洋務運動》一課時，在史料選擇上采用了李鴻章寫給恭親王奕的一封信：“鴻章竊以為天下事窮則變，變則通。中國士大夫沉浸于章句小楷之積習，武夫悍卒又多粗蠢而不加細心，以致用非所學，學非所用。??鴻章以為，中國欲自強則莫如學習外國利器。欲學習外國利器則莫如覓制器之器，師其法而不必盡用其人。欲覓制器之器與制器之人，則我專設一科取士，士終身懸以為富貴功名之鵠，則業可成，業可精，而才亦可集。”

這封信在歷史上比較出名，是史學家研究李鴻章洋務人生必不可少的材料。但這份典型材料長度較長，而且多是文言文，對于高中生來說閱讀有一定的難度。這就需要教師在設置問題、解釋史料上下功夫了。為此，李小萍老師選擇在課前就先提供材料，留給學生充足的時間閱讀史料。同時選擇了學生的認知沖突點來設置問題，因為這段材料里體現出的李鴻章和學生原有認識里的李鴻章是有一定矛盾沖突的，材料里的李鴻章是一個改革家，一個有遠見卓識、又本著經世致用的傳統精神的改革家，與平日教科書里那個“狹隘”的李鴻章不太一樣。李老師設置了兩個問題（1）根據材料，提取李鴻章認為改革的必要性何在？提取李鴻章的改革規劃。（2）李鴻章的這封信被蔣廷黻譽為 19 世紀最有價值的文章，值得再三的閱讀，在信中體現了李鴻章的哪些遠見卓識呢？ 問題精辟有力，貼近史料，緊扣目標，引發了課堂的一個小高潮，學生通過一封信引發的思考，對李鴻章的再認識，逐漸形成。在層層深入后，李老師又找到了“李鴻章請修鐵路卻遭到反對”的原始史料，組織學生在研讀史料中學會找關鍵詞，再通過關鍵詞去總結核心問題，解決疑惑。

4.選擇多樣化的史料，豐富課堂內容，在觀點的碰撞中鍛煉學生思維平時的歷史課堂教學所選用的史料形式應該是多種多樣的，史料的形式包括歷史文獻、摘錄、歷史地圖、統計資料、歷史圖片、藝術作品、名言警句、詩詞楹聯、民間傳說、照片郵票、漫畫插圖、音像資料等。將各種形式的史料結合起來使用，培養學生“史由證來，論從史出，史論結合”的歷史思維，我們的歷史課堂也更有生命力。

劉敏老師在《王安石變法》一課就選擇了多樣化的史料，除了我們常見的文字史料外，還有漫畫材料（“西夏軍隊與北宋作戰”的漫畫）；柱狀圖表（北宋官員增長圖、北宋兵員增長圖、北宋前期的財政收支圖）；直觀的數據史料（收復河湟五州，拓地 2000 余里，受撫羌族 30 萬帳）等等。李老師的課堂所采用了的史料同樣豐富多樣，有各種漫畫插圖、還有歷史地圖、音像資料等。其中既有一手史料，也有大量的二手史料。當然，史料不是越多越好，而是要精心挑選，有所取舍。選擇的史料應能全面反映所考擦的歷史現象，避免選擇非典型性材料。

5.帶著問題去研讀史料，多選取能夠激發學生情感、態度、價值觀的史料 不少教師都有過困惑，采用史料教學法的時候如何落實情感、態度、價值觀目標呢？比較可行的方法是制造認知或思維的沖突點。華附劉敏老師在講述《王安石變法》時，用了“歷史的遺憾”的標題引出王安石變法的背景。她選取的材料為“公元 1127 年，靖康之變。距離王安石發起他那著名的變法運動剛好五十八年；距離司馬光廢除這些變法，也過去四十一年；距離另一位反對變法的蘇東坡去世，相隔了二十六年。這三人，在中國歷史上享有同樣偉大的名聲，并且一度是相互傾慕的好朋友。因為這場變法，三人漸行漸遠，終于徹底葬送了友情，并且成為政治上的死敵。”這樣的材料引人思考，提高了學生的學習興趣，有利于激發學生情感、態度、價值觀。

除此，劉老師還羅列了大量史料，比如“不愿讓人抬、不坐轎的宰相；拒奢華、拒納妾的宰相”的精辟概括、“拒喝上司包拯的敬酒”的趣味小故事等，生動刻畫了王安石的性格特征，展示了一個有強烈社會責任感、有豐富的地方工作經驗、品德高尚、意志堅定、性情執拗的北宋改革家形象。

另外，史料教學不僅僅是教師收集史料，通過多媒體課件提供給學生研討，也可以組織學生進行自主探究，合作學習。如讓學生針對某些問題搜集史料(設疑)→選擇史料(甄別)→整理分析史料→運用史料(講述、討論等)→撰寫小論文。華附劉老師的課堂就鮮明體現了上述特色。史料的學習始終貫穿其中，在過程中突出培養了學生實踐能力和獨立思考能力等。

總之，史料教學法只是一種教學策略之一，其原理和方法都應服務于課堂的目標，服務于學生的發展。

參考資料

【相關資源】

1.論史料教學（CAJ）

2.論史料教學的分層進行方法及操作原則 _ 以 _ 中國近代史 _ 為例（CAJ）3.論史料教學的價值 _ 兼論中學歷史教學發展趨勢(CAJ)4.史料教學略論(CAJ)5.史料教學淺談(CAJ)

6.史料教學與其它教學方法的整合(CAJ)7.談中學歷史新課改背景下史料教學的加強(CAJ)8.關于高中歷史史料教學現狀的調查與分析(KDH)9.課改背景下史料教學作用新探(KDH)10.利用史料教學培養學生的綜合素質(KDH)

11.美國歷史教育的特點之一 _ 收集和使用第一手資料(KDH)12.史料教學淺議(KDH)

13.史料教學在歷史課堂中的運用(KDH)14.談歷史學科的史料教學(KDH)15.談新課程背景下的史料教學(KDH)16.試論史料的歷史教學應用(NH)

17.試論史料在美國中學歷史教學中的運用(NH)18.對美國史料教學的方法論及實踐意義之探索(NH)19.王錫文：對外開放格局的形成教學設計 20.一課時講完隋唐史的實驗 21.李小萍：洋務運動教學設計

高一歷史學習的障礙與破除》

許多老師感覺教高三比教高一輕松，這是有道理的，高一學生的歷史學習習慣尚沒建立起來，反而有諸多的障礙在那里等著老師破除，老師是一個教書先生，又要承擔更為繁重的清道夫的工作，且要在道路的兩旁催發四季的美景，在道理的終點建造一個巍峨英華的發展中心，這怎不叫一個辛勞呢？高三呢？學生早就整裝待發在跑道上，教師只要在他們的跑車里加進去適當的燃料就可以了，至于自我的操控那是車手的事情了，教師主要是欣賞賽車的盛況與等著收獲賽終的儀式，二郎神三只眼，也常做翹起二郎腿的愜意姿態的。那么高一的學生，歷史學習的障礙有哪些呢？我粗略籠絡了一下，至少一下六處。

第一，學科多，作業多，歷史學習沒時間。周三下午，監考歷史模塊考試，徜徉于奮筆疾書的學生森林里，我感覺大腦呼吸到了負氧離子，特別的舒坦，有唐太宗天下英雄盡入轂中矣的浩然之氣。于是深切感悟到那些頻繁考試和毫不猶豫批發作業量的學科的老師，他們為何那般的作為，原來其中幸福多多啊。我們的學生早已經沒有了個性，早已經成為作業與考試的奴隸，所以在考試和作業中才能是溫順可愛的形象，沒有考試和作業，他們是不會關注歷史的。但我們的歷史，卻太多的歷史使命感，至于我們的老師不忘記那一份良心驅使下的惻隱之心，告誡自己作業要少，考試要少，不要驚擾了學生發展的夢。而其他學科，則是品嚐作業與考試如蜜的狗熊了，歷史的時間被完全擠兌掉了。

第二，學習的板塊不完整。學習有預習、聽習、復習這三習板塊，共同構成一個學習過程。因為歷史復習的時間被擠兌掉，所以造成學生歷史學習的板塊殘缺問題，這是很有害的。今年我將作業資料上的作業前置為預習性作業，發現學生大部分能自我解決，作業的質量在表面上看與后置性作業沒有明顯差別，這說明學生的預習階段是認真的。——不過，作業的內在質量還是有區別的，前置性的作業，學生更多是查閱教材來完成的，并非教師所期望的先看書，然后作業的程序，后置性的作業呢，學生更多是脫離開教材，更多依賴回憶、調取內化庫存的結果，這導致作業的效果的不同。

因為沒有復習環節，前兩個環節的學習效果被時間銷蝕掉，最終幾乎剩余為零，這是一個零化的學習游戲，有點悲哀的色調。我常給學生算一筆賬，一節歷史課40分鐘，一課的作業要花費40分鐘，這樣平均下來，每天的歷史學習用時在半個小時以上，因為沒有復習，這每周的幾個小時就等于荒廢掉，人生的好大一段失去了意義，實在是傷懷的孽業。

第三，不科學的課堂觀。一個課堂過程里，包括眼看、口動、腦思腦記、手動、耳聽，這中間，腦子的運動主要內容是思維和記憶。很多學生的課堂觀是錯誤的，以為課堂上就一個播撒汗水的過程，是聽課攝取、手記筆記的任務，卻并沒有收獲記憶的機制，其實。學生應學習收割機的原理，收割與入倉的工作同時進行，然后待課堂結束了，學習的內容基本打包了。一些學生不懂得這個課堂的原理，課堂的效率就比較低。一些學生甚至把課堂作為最放松的時間，課下有大量的作業在那里被逼迫著，課堂上用腦是輕松的、聽講是享樂的，這種課堂最為輕松的情況，讓人哭笑不得。

第四，歷史為副業的思想。大部分學生是要選學理科的，這就導致他們將歷史做副業，只求60分萬歲，沒有將歷史學精的心理姿態。這樣的思想具有感染性和傳染性，這個學生的歷史學習會比較敷衍，這種思想傳染下去，整個班級的風氣也將是敷衍的，班級的基調就會發生偏移，歷史教師不可不警惕。第五，初中學習缺陷制約高中學習。舉一個例子，我出了一個依靠徐州來判斷淮海戰役的題目，學生的錯誤率比較高，原因之一是歷史教材中對三大戰役只羅列了名稱，沒有展開，另一個原因則是學生初中的地理學習，人文地理很是薄弱，他們不知道中國這樣一個重要的交通樞紐和區域性中心城市，這對于現代中學生來說，無疑是一種諷刺。但這種諷刺實實在在存在的，這就是中國如今的教育。這種初中教育導致的知識缺陷，對高中歷史的教學是很影響的。

第六，對中國教育的叛逆思想與行為。有個學生，極力否定中國式教育，在課堂上表現為對筆記、作業、記憶的不屑，將許多的表現給予了不作為。他的課堂表現是糟糕的，考試同樣糟糕，但他并不反省，反而認為這是一種個性的光輝。這樣的學生并非少數，因為非主流的脫序，他們大多是淪落為邊緣人的，應試教育傷害了他們，他們同時也傷害著教育環境，成為一個很吊詭的群體。

那么我們如何破解上述的幾種問題呢？

第一、將學習的環節完善起來。（1）適當增加考試，歷史不拒絕考試，通過考試端正學生態度，激勵學生情致，檢驗學生學情；（2）增加課后作業，最好是精選而針對性強、量少的作業，保證學生將復習的環節重視起來；（3）課堂觀的教育，并調整課堂的機制，讓學生的記憶在課堂上有一定的空間督促和展示。

第二、對一些應試教育不配合的學生，教師可以利用他們進行素質教育的點綴，如讓他們進行研究性的課題，依靠課堂展示讓他們獲得價值認可，并在這種成就感中由不配合發展為配合，從而進入教育的程序里。排斥不如接納，批判不如認可，否定不如激勵。

第三、建立師生接觸機制。如成立“教師小助手”小組，使學生多與教師接觸，在接觸中了解他們，發展他們，培養一批歷史學習上的積極分子，樹立一批學習典型，須知，榜樣的力量勝過無量的說教。如成立“后進生進辦公室談話”機制，每天都有這樣的一些學生與教師進行接觸，從而給他們心理的照應，促進他們的學習興趣、情感、策略，甚至督促。教師應將觸角延伸。

第三篇：關于《高中史料教學的原理與操作方法》的一些收獲和建議[推薦]

關于《高中史料教學的原理與操作方法》的一些收獲和建議

通過這次《高中史料教學的原理與操作方法》的培訓后，我對高中歷史史料方面有了一些新的認識和收獲。

一、史料教學在歷史教學中的重要地位

高中歷史學科的特點決定了史料教學在歷史教學中具有重要的地位。史料教學具有明顯的優點：能夠激發學生的探究欲望。史料是對教材內容的補充，它拓展了歷史知識，往往能夠把學生帶進歷史的時空，引發他們學習的興趣；有了學習興趣，學生就會主動參與到教學活動中來，而不是被動地接受知識。

二、史料教學的面臨的問題

廣大高中歷史教師基本上能從思想上認識到史料教學的重要意義，認識到史料教學在促進學生學習方式轉變上的重要作用，但是史料教學仍然面臨著一些問題：

第一，“許多高中歷史教師對于史料教學的相關常識性知識仍比較缺乏，比如什么是史料？可利用的史料種類有哪些？史料選擇最基本的原則是什么？”

第二，許多教師由于時間安排不合理，對于史料抱著有時間講，沒時間放過的教學態度，造成史料教學不全面，不系統，難于促進學生歷史思維的發展、歷史觀的形成以及歷史方法的掌握，更別談培養學生的探究精神和創新意識了

第三，基層中學由于條件限制，所利用的史料基本上局限于課本上的文字或圖片史料，難于開展課外各種史料的搜集、整理、分析、利用等活動.三、史料教學方法探討

目前史料教學的這種現狀，不利于完成新課程的要求，更不利于學生自主思維的培養。那么，如何改變這種現狀呢？除了教師提高自身認識，加強對史料知識的學習之外，筆者認為還可從以下幾個方法入手：

（1）由淺入深，循序漸進。所選史料或所提問題必須符合客觀的認知規律，遵循由淺入深、循序漸進的原則。無論是一段式還是多段式的史料，所設計的問題應該要有一定的啟發性，由淺入深，由易到難；無論是一題多問還是幾題幾問，問題之間要相互聯系，又彼此區別，角度應有所不同，層次有深有淺，形成立體結構。

（2）適當補充，加深理解。在教學中，充分利用新教材的史料是非常必要的，但也不是說就只能完全局限于課本的史料。教師應根據教學目的和教學內容并結合學生的實際能力適當補充相關史料和提出不同層次的問題，從而逐步培養學生分析和解決問題的能力。

總之，史料教學在歷史教學中具有十分重要的作用，而且隨著教育改革的不斷深入，它的地位將越來越穩固。歷史教師應在加強理論學習的同時，在教學實踐中根據實際的需要，不斷地探索史料教學的方法，從而更好地為中學歷史教學服務。

第四篇：汽車涂料空氣噴涂的原理及噴槍的操作方法概述

汽車涂料空氣噴涂的原理及噴槍的操作方法概述

空氣噴涂的原理是將壓縮空氣從噴槍空氣帽的中心孔噴出，在噴嘴前端形成負壓區，使液-氣相急劇擴散，使汽車涂料成為微粒，呈漆霧狀飛向并附著在被涂物表面，涂料微粒迅速集聚成連續的涂膜。空氣噴涂是上世紀20年代為適應快干涂料而開發的涂裝工藝，如今已有很大改進。空氣噴涂具有涂裝效率高、適應性強、涂膜質量好等優點，至今仍是應用最廣泛的涂裝工藝之一，但同時它也有漆霧容易飛散、污染環境等缺點。

空氣噴涂裝置包括噴槍、壓縮空氣供給和凈化系統、輸漆裝置和噴漆室等。噴槍是空氣噴涂的主要工具，對涂膜的質量影響最大。壓縮空氣供給和凈化系統包括空氣壓縮機、貯氣罐。油水分離器和輸氣管等。壓送式噴槍還需要增壓箱或輸漆泵等輸漆裝置。噴漆室可保護環境和保證涂裝質量。1，噴槍的種類

噴槍可按很多方式進行分類，按混合方式可分為內混式和外混式噴槍。內混式噴槍的涂料和空氣在空氣帽內側

混合后噴出，可用于噴涂油性漆、多色美術漆、汽車涂料和涂裝小物件，噴霧圖形也僅限于圓形。外混式噴槍的涂料和空

氣在空氣帽的外側混合，這種噴槍用途廣泛。

2，噴槍的結構

噴槍一般由槍頭、調節部件和槍體三部分組成。槍頭包括空氣帽、涂料噴嘴和針閥等部分，其作用是將漆料霧

化，并以一定圖形噴涂至被涂物表面。調節部件是指調節涂料噴涂噴出量、空氣流量和噴霧圖形的裝置。槍體

上裝有扳機和防止漏漆、漏氣的密封件。3，空氣噴涂作業（1）涂料的霧化

空氣噴涂是通過空氣和涂料混合使涂料霧化，霧化效果直接影響到涂膜的質量。涂料的霧化程度取決于空氣噴

出量與涂料噴出量之比Qi。即在涂料噴出量一定的情況下，空氣噴出量決定于空氣帽中心孔與輔助空氣孔噴出

空氣的速度與流量。對于不同規格的噴槍，在進行噴涂作業時為了達到必要的霧化程度，必須首先確定Qi。盡

管大噴槍的空氣噴出量和涂料噴出量都比小噴槍大，但要達到相同的霧化程度，其Qi值應該是相似的。對于同 一噴槍，既可以采用增大空氣噴出量的方法，也可以減小涂料噴出量的方法，來增大Qi值，使漆霧變細。（2）噴槍的調節

噴涂作業前，必須根據被涂物的形狀、涂裝的質量要求，將噴槍的空氣壓力、涂料噴涂量和漆霧圖形的幅寬調

整到適宜的噴涂條件，而這三者之間有著密切的關系。A,空氣壓力的調節

噴槍的空氣壓力有一定的調節范圍。空氣壓力高，漆霧粒子細，分散多，涂料損失大；空氣壓力低，漆霧粒子

粗，涂膜表面粗造，會產生橘紋、針孔等缺陷，所以應適當選擇壓力，并且保持壓力穩定。B,涂料噴出量的調節

涂料噴出量大，工作效率高，但是對于吸上式和重力式噴槍，涂料噴出量受到空氣壓力（或空氣量）的限制。

由于空氣壓力的升高是有限的，過多地增加涂料噴出量，會造成漆霧粒子粗，影響涂膜質量。壓送式噴槍是通

過調節增壓罐的壓力來調節涂料噴出量，然后再調節噴槍的涂料噴出量調節機構，達到合適的噴出量。

C.噴霧圖形的調節

噴霧圖形的大小稱為噴霧幅寬，對于圖形的噴霧圖形是指它的直徑，對于橢圓形的噴霧圖形是指它的長軸長度

。通過噴槍上部的調節螺栓可以控制空氣帽側面空氣孔的空氣流量，實現噴霧圖形的調節。關閉側面空氣孔，噴霧圖形呈圓形，主要用于較小的被涂物表面；打開側面空氣孔，噴霧圖形變成橢圓形，主要用于大面積噴涂，應用廣泛；側面空氣孔的空氣流量越大，噴霧幅寬越大。雖然增加空氣壓力會增加噴霧幅寬，但超過一定的

限度，噴霧圖形的中心部分會變窄直至斷開。橫向噴涂時，應將空氣帽的側面空氣孔調到橫軸位置；縱向噴涂

時，應將側面空氣孔調到縱軸位置。（3）空氣噴涂的操作要點

噴涂距離、噴槍運行方式和噴霧圖形的塔接是空氣噴涂的三個操作要點。

噴涂距離指噴槍前端到被涂物的距離。一般情況下大噴槍噴漆距離為20-30cm，小噴槍為15-25cm。噴涂距離

越近，在單位時間形成的涂膜厚，易產生流掛；噴涂距離過遠，涂膜變薄，涂料損失大，嚴重時涂膜表面粗造。

噴槍的運行方式包括噴槍與被涂面的角度和噴槍的運行速度。噴槍與被涂面應垂直，平行運行，才能保證噴

涂距離恒定。噴槍的運行速度一般在30-60cm/s，并保持恒定。如果噴槍傾斜或運行速度多變，都得不到厚度均

勻的涂膜，并且產生缺陷。尤其是在噴涂汽車涂料時，要特別注意。

漆霧圖形的塔接指噴涂時，噴霧圖形之間部分重疊。由于噴霧圖形中部較厚，邊沿較薄，所以前后噴霧圖形 的邊沿部分互相塔接，才能保證涂膜厚度均勻。前后塔接的程度一般為有效噴霧圖形幅寬的1/4-1/3，且應保持 不變。

（4）選擇噴漆的原則

無論是內混式噴槍還是外混式噴槍，在選用時主要考慮以下四個因素：槍體的重量和大小、涂料的供給方式、噴嘴口徑和空氣使用量。（1）槍體重量和大小

從減輕勞動者的工作強度來看，希望選擇用小型體輕的噴槍。但是小噴槍涂料噴出量和空氣量都比較小，效

率低，不適宜大量涂裝。如果用大型噴槍噴涂小型被涂料物，則會造成漆霧飛散多，涂裝損失大，也不適合。

因此應在滿足噴涂作用條件的情況下，考慮噴槍的重量和大小。（2）涂料的供給方式

涂料用量少、顏色更換頻繁的小批量涂裝可選用涂料罐容量1L以下的重力式噴槍，但不適用于仰面涂裝。涂料

用量稍大、顏色更換次數多，特別是側面噴涂時，選用涂料容量罐1L以下的吸上式噴槍。涂料用量大，顏色比

較單一的連續噴涂可選用壓送式噴槍，配以容量為10-100L的增壓罐或帶有循環管路的涂料泵。

（3）涂料噴嘴口徑和空氣使用量

噴涂噴嘴口徑要適應所要求的涂料噴出量。噴嘴口徑越大，涂料噴出量越大。因而，黏度高的涂料應選用噴 嘴口徑大的噴槍。壓送式噴槍的涂料噴出量隨壓送涂料的壓力增高而增大，可選用噴嘴口徑小的噴槍。噴涂底

漆以及對涂膜外觀要求不高或涂膜較厚時可選用噴嘴口徑大的噴槍。噴涂面漆時，對漆料霧化要求較高，可選

用噴嘴口徑較小的噴槍。噴嘴口徑不同，空氣使用量也不同。噴嘴口徑小，空氣使用量小，相應的涂料噴出量 也小，反之亦然。

4，熱噴涂法

噴涂加熱的涂料稱為熱噴涂。加熱的方式可替代加稀釋劑使涂料粘度下降，所以熱噴涂最初是為了提高硝基

涂料的固含量而開發的，由于具有涂裝質量高、作業周期短和環保等優點，得到廣泛應用。通常熱噴涂設備是空氣噴涂噴槍配以涂料加熱器。涂料加熱器的加熱方式有熱上加熱、蒸汽加熱、電加熱等，其中電加熱使用方便快捷，控溫準確，應用最廣。為了保持溫度恒定，涂料加熱器與噴槍之間必須形成循環 通道。

熱噴涂法適用于加熱后黏度顯著下降的涂料，如水溶性涂料、高固含量涂料扽個，對于雙組分涂料，可分別

對兩組分加熱，然后在噴嘴前混合。

第五篇：免疫組化操作方法、原理、步驟以及常見問題處理大總結

免疫組化操作方法、原理、步驟以及常見問題處理大總結

1、方法操作不難，最大的難處是出現異常結果時如何解決？這就需要掌握免疫組化實驗原理，每一步知道為什么這樣做，這樣你才敢大膽地改革先前的不對的方法步驟。如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時間，這三者一般是相互成反比的（相對），其中濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應的速度、時間決定反應的量。就拿溫度來說，可以有4度、室溫、37度，我推薦4度最佳，反應最溫和，背景較淺；而37度反應速度較快，時間較短；室溫我不太提倡，除非你每次都把環境溫度控制在一定的范圍，否則，盡量選擇前兩者。

2、免疫組化最大的優勢是定位和定性。相比于其他蛋白檢測方法，免疫組化具有定性靈敏度高、定位較直接準確，是定位檢測分析首選方法。尤其對于有些因子的轉位研究十分有用。

3、免疫組化結果定量分析的前提是高質量的染色切片。免疫組化結果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準確，這種原則可能也是我們日常審稿時判定研究結果的必備條件。

4、免疫組化實驗一定要設置陽性對照和陰性對照。陽性對照一般是用肯定表達這種抗原的切片來做；陰性對照一般是用PBS或非一抗替代一抗來進行反應，其余步驟均一致。前者是排除方法和實驗系統有無問題；后者是排除有無一抗外的非特異性染色。

5、免疫組化的應用廣泛，是當前實驗研究的最重要方法之一。如今發SCI論文時，明顯感覺僅靠量化的數據來發文章很難，加一些形態學數據或圖片，老外十分歡迎，可能是怕你學術造假吧。當然也不能做假陽性或假陰性結果。

6、免疫組化技術掌握與否的鑒定標準是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優良的染色切片。我在平時帶教中就發現許多研究生把我已經摸索很成熟的反應條件、濃度、方法步驟，重復運用于同一性質的切片和同一種抗體，做出來后就覺得自己已經掌握了免疫組化方法，更換一種抗體后，居然連二抗的種屬來源都拿錯了。失敗往往促進你去思考試驗原理和過程，成功有時也加快你自傲。

7、實驗方法需要動手+動腦。如今我還不敢說我在免疫組化什么都知道。我只所以今天敢在這里說這說那，這是因為我經過了反復的動手+動腦，把理論原理運用于實踐，在把實踐中發現的問題帶到理論知識中去解決，最終把理論與實踐融會貫通。

一、概念和常用方法介紹

1、定義用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術。

2、原理根據抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結合，最后通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。

3、分類 1）按標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標法和免疫金銀法等。2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3）按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內源性生物素含量高的組織抗原檢測。

4、目前幾種常用免疫組化方法簡單介紹

1）免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用較廣。

2）免疫酶標方法免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于60年代發展起來的技術。基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。本方法與免疫熒光技術相比的主要優點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標方法的發展非常迅速，已經衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進和創新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統等。

3）免疫膠體金技術免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。

5、被檢測的物質 組織或細胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激 素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。

6、特點 1）特異性強。免疫學的基本原理決定抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時，才會出現交叉反應。2）敏感性高。在應用免疫組化的起始階段，由于技術上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現在由于ABC法或SP三步法的出現，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結合，這樣高敏感性的抗體抗原反應，使免疫組化方法越來越方便地應用于常規病理診斷工作。3）定位準確、形態與功能相結合。該技術通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態與功能相結合的研究，對病理學領域開展深入研究是十分有意義的。

7、從蛋白水平檢測角度，免疫組化技術與Western blotting、ELISA的異同1）Western blotting：蛋白質免疫印跡，也是利用抗體抗原反應原理，結合化學發光等技術來檢查組織或細胞樣品內蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術相比，定量可能更加準確；當然Western blotting也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進而間接反映它們的定位），但敏感性遠遠低于免疫組化技術。2）ELISA：酶聯免疫吸附試驗，也是利用抗體-抗原-抗原結合反應原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測。與免疫組化技術相比，定量最準確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一。

二、實驗流程簡介

1、SP三步法

1）石蠟切片，常規脫蠟至水。2）0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內源性過氧化物

酶活性。3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘4）候選步驟：采用抗原修復：微波（建議30分鐘內4次中火）、高壓、酶修復方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。6）滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（最好復溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。7）滴加生物素標記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。8）PBS沖洗，3分鐘×5次。9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10）PBS沖洗，3分鐘×5次。11）顯色劑顯色（DAB等）。12）自來水充分沖洗。13）可進行復染，脫水，透明。14）選擇適當的封片劑封片。

2、即用型二步法 1）脫蠟、水化組織切片。2）根據所應用的一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理。3）0.3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗。4）滴加一抗，室溫或37℃孵育30~60分鐘，或4℃過夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。5）滴加enhangcer增強劑，37度30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37℃孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗，3分鐘×5次。7）應用DAB溶液顯色。8）蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。

三、免疫熒光技術

1、免疫熒光方法中的重要環節 1）冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。2）組織切片固定：切好片風干后立即用冰西奈山環保組織固定液固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。3）血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。4）一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。具體條件還要摸索。5）二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。最后，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當的離心。6）復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。7）封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。8）切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）9）拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。

已有的常見免疫組化難題集錦

1、石蠟切片和冰凍切片的比較？（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結論。因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。（2）冰凍切片的優點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。缺點是細胞內易形成冰晶而破壞細胞結構，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。（3）石蠟切片的優點可以保持組織細胞的形態結構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態都較冰凍切片好。

2、一抗的選擇要點和技巧是什么？（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等避免）。（2）應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。（3）種屬反應性的選擇（species reactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。(4)種屬來源，一般兔來源的多是多克隆；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據此來源來選擇相應的二抗。(5)生產廠家的選擇。如santa Cruz公司抗體一般1ml，價格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，價格2800元左右。這兩個廠家的同一種抗體它的實際效價穩定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Western blotting效果還可以。

3、在什么情況下使用TritonX-100？（1）Triton X-100化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(>10um厚切片)和免疫細胞化學中一般用Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。（3)Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用，具體參閱： http://www.tmdps.cn/bbs/post/view?bid=68&id=12301317&sty=1

4、封閉血清的選擇原則是什么？（1）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續結果的假陽性！（2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發生結合，會造成背景。（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。

5、抗體孵育條件的比較？（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。

6、一抗4度孵育后為什么要進行37度復溫？（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；（2）另一方面，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4度和37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。（3）其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后，直接用PBS洗沒發生過脫片現象。事實勝于雄辯！

7、DAB顯色時間如何把握？（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現淺棕色本底時即可沖洗；（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；（3）此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。

8、免疫組化結果如何分析？（1）陽性著色細胞計數法。在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數陽性著色細胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區域、相同條件下用image j進行灰密度分析，然后進行統計分析即可。（3）評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最終可以分數相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量切片。

9、在什么情況下進行組織抗原修復，抗原修復的條件是什么？（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。（2）修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修復，我們一般用6min*4次，效果不錯。

10、內源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？（1）一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右；而0.3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般10~30min。（2）用西奈山環保組織固定液配置過氧化氫比雙蒸水或PBS能更好保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片。（3）現用現配，配好后4度避光保存。

11、如何才能充分脫蠟？（1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短；（2）脫蠟的時間要根據季節，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長。（3）當天切的切片，燒烤2小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。總之，操作時應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。

12、如何最大限度地降低組織非特異性染色？（1）縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。（2）一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。（3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；（4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；（5）縮短DAB孵育時間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等；（6）適當增加PBS沖洗次數和浸洗時間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；（7）防止標本染色過程中出現干片，這容易增強非特異性著色。

13、蘇木素復染時間的把握？（1）蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數秒-數分鐘。不過這個如果染色不理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。（2）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。（3）如果分化的顏色過淺，可以復置于蘇木素中染色。

14、PBS的清洗方式選擇、次數和時間的選擇？（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續2分鐘左右就完全足夠了。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（PH7－8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。免疫組化PBS我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配制方面，使用效果好。（5）常用試劑的配制和使用。在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。

15、脫片產生的原因和如何防止脫片？（1）多聚賴氨酸玻片質量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。（3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。（4）沒烤好，時間短溫度不夠之類。（5）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。（6）修復的問題：抗原修復的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。（7）此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

16、背景染色較深的原因有哪些？（1）抗體濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。（4）組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。（5）切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在4oC冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

17、蘇木素復染后氨水返藍這一步如何做、濃度多少、時間多長?答：返藍可以用堿性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45度溫水、冷水藍化均可。一般藍化5~10 min。淡氨水有人用50ml自來水＋三四滴的氫氧化銨