第一篇：豬圓環病毒2型疫苗最新研究進展

豬圓環病毒2型疫苗最新研究進展

豬圓環病毒病是公認的免疫抑制病之一，造成豬場損失慘重，疫苗免疫成了救命的稻草。從2011年豬圓環疫苗上市至今，已有17家圓環產品先后上市，目前，出現嚴重供大于求的現象，同時，養殖場也面臨著幸福的煩惱，大量產品的上市，產品價格可能下降，但是，面對玲瑯滿目的產品，如何選擇疫苗成了養殖場一個重要的課題，針對這些煩惱，本文希望能夠為養殖場選擇疫苗帶來幫助，避免走彎路，為養殖場服務。

1.PCV-2國內外最新流行動態

由PCV-2引發的疾病已成全球流行之勢，在加拿大首次報道該病原引起PMWS后[1]，學者通過調查本國包括SPF豬、部分散養豬以及育肥豬發現，豬群中PCV-2血清中抗體普遍存在，但目前該病在加拿大仍然只是散發。在英國和北愛爾蘭，豬群血清中PCV-2抗體陽性率分別為86％和92％。美國、法國、丹麥、意大利、西班牙、荷蘭、新西蘭、日本、韓國、墨西哥等國家也相繼報道豬群中存在PMWS。在我國豬群中PCV-2感染情況也不容樂觀。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山東、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22個豬群采集了559份血清，用ELISA方法檢測PCV-2抗體，其陽性率高達5l％，表明我國豬群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法對我國北京、山東、河北、深圳、山西、天津、廣東等省(市)的12個規模化豬場發病豬群進行豬圓環病毒2型感染的流行病學調查，結果表明豬圓環病毒2型感染情況在我國豬群中相當嚴重。李超等[4]在2010年對安徽省PCV-2流行病學調查，結果表明安徽省14個市(縣)的PCV-2抗體陽性率平均為74.36％，表明安徽省豬群中普遍存在著PCV-2的感染。從上述報道表明PCV-2在我國豬群中廣泛存在。根據流行病學調查顯示，雖然豬群中PCV-2抗體陽性率較高，但很大比例的抗體陽性豬群并不表現出臨床癥狀。PCV-2與其他多種病原混合感染較為嚴重，調查發現沙門氏菌、大腸桿菌等細菌性病原與PCV-2混合感染率達到了20％[5]。陜西省PCV-2與PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陳義祥等對廣西地區197份組織病料檢測發現，PCV-2與PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占總病料數量的57.73％。2003年王文軍等[7]對黑龍江地區PCV-2陽性豬群的病料調查發現，藍耳病和豬瘟的陽性率也較高。

哈爾濱獸醫研究所劉長明[8]在2007年采用免疫過氧化物酶單層細胞染色試驗（IPMA）對來自與黑龍江、吉林、河北、上海、內蒙古、云南、江西等地的健康豬群480份血清和發病豬群424份血清，抗體陽性率分別為79.2%和91.7%，表明PCV-2在豬群中感染率非常高。山東農科院畜牧獸醫研究所吳家強博士檢測結果也證實PCV-2防控比較糟糕，PCV-2，2010年檢出率為34.66%（124/357），2011年檢出率為25.59%(174/588)；2012年檢出率為2

1.38%(147/683)，圓環病毒病依然嚴重，但有下降趨勢，這個和使用圓環疫苗免疫有關系。

第二篇：豬圓環病毒疫苗應用現狀

豬圓環病毒疫苗應用現狀

摘要

目前在國外只有梅里亞動物保健公司生產全病毒滅活疫苗，使用于母豬免疫。

已經注冊的國產圓環病毒疫苗均為全病毒滅活疫苗。分別由哈爾濱獸醫研究所用LG、南京農業大學用SH株研制而成。①哈爾濱維科生物技術開發公司；②上海海利生物藥品有限公司；③洛陽普萊柯生物工程有限公司；④江蘇南農高科技股份有限公司4家公司生產。國產疫苗亟待提高純化工藝。水性佐劑要比礦物油佐劑疫苗對機體的刺激性小，副反應小。疫苗免疫保護期為3—4月，貯存有效期為12—18月。

FLEX系列茵格發豬圓環病毒疫苗，是具有純化蛋白抗原的水性佐劑的亞單位滅活疫苗。形成形態、大小與活病毒相同的、具有高度免疫原性的純化抗原。該產品是目前所有豬圓環病毒疫苗中唯一的單針疫苗，具有抗原緩解效果，應用時不必加強免疫。

在應用圓環病毒疫苗后滿意度調查中，進口圓環病毒疫苗滿意度最高。如何選擇疫苗、制定適合豬場實際的免疫程序、確定免疫時機適時免疫顯得尤為重要。

疫苗免疫哪些豬群？何時免疫？應對豬場流行病學、臨床癥狀、剖檢變化、生產成績、病原和抗體的實驗室監測進行評估后作出決定。豬場是否應用疫苗，應充分考慮本場發病情況、飼養管理狀況、生物安全、主要相關疫病免疫與控制狀況、藥物預防效果等因素基礎上綜合判斷。母豬是否需要免疫？倘若母豬群因PCV2感染而流產、產死胎、弱仔的比例超出正常，或仔豬因PCV2感染在斷奶后1—2周發病，選擇母豬免疫就是正確的。進口的疫苗可普免2—3次/年，在國產疫苗應用安全的情況下可免疫3—4次/年。研究表明免疫母豬所產仔豬和非免疫母豬所產仔豬接種疫苗后，其免疫效應均未受到母豬免疫的負面影響，盡管這一結果令人鼓舞，但還需進行更多研究。

仔豬免疫的時間可據下游豬發病日齡確定。疫苗起效時間為2周，感染潛伏期約2周。當母源抗體在3—8周下降到較低水平而環境中野毒感染壓力較大時，對于保育豬特別是10周齡后肥育豬是否獲得足夠保護？一般12周齡開始感染。應在豬群出現臨床癥狀至少4周前施行免疫注射。商品豬群只注射1次即可；1針免疫4個月后再進行第2次免疫。在第1次免疫2周后加強免疫一次；在加強免疫的3—4個月后再免疫。

新生仔豬3—4周齡首免，第一次免疫后間隔3周加強免疫一次。

在制定免疫程序時，還應注意與其它免疫的相互干擾作用。至少7d的間隔；若PRRS弱毒疫苗免疫在前，最好有10d以上的間隔再免PCV2疫苗。

圓環病毒疫苗免疫效果通過常規的抗體檢測目前難以給出正確評價，可通過臨床癥狀、生產成績予以評估，免疫后對豬的健康狀況和增重改善明顯。圓環病毒疫苗應用于PCV2急性感染，仔豬群呼吸困難、消瘦、皮炎，母豬群流產、產弱仔等，可減少母豬流產，產死胎、弱仔的數量，可明顯降低保育及生長育肥豬發病率、死淘率；明顯提高日增重、豬群整齊度，降低料肉比，減少皮炎發病率，縮短出生至出欄時間；還有助于豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗、偽狂犬病疫苗免疫效果的正常發揮，降低機體對飼料霉菌毒素的敏感度。

第三篇：豬圓環病Ⅱ型及鑒別診斷技術研究進展

豬圓環病Ⅱ型及鑒別診斷技術研究進展

摘要：豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環病毒科，該病毒有2個血清型：PCV1和PCV2。PCV1廣泛存在于豬體內，無致病性；PCV2能直接或間接導致一系列豬的綜合性疾病。如豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)，斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)，豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)和成年豬皮炎腎病綜合征(PDNS)等，對養豬業危害嚴重。為了深入了解PCV2致病因素，建立快速鑒別診斷技術，綜述了PCV2的豬圓環病毒病及其相關致病因素和目前應用診斷技術研究情況。為研究探討PCV2的發生和診斷提供借鑒。關鍵詞：豬圓環病Ⅱ型；診斷技術；致病基因

豬圓環病毒(PCV)是獸醫學上已知動物病毒中最小的病毒，根據PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，將其分為PCV1和PCV2兩個型，其中PCV1無致病性[1]，廣泛存在于豬體內及豬源傳代細胞系。PCV2則具有致病性，在臨床上主要引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征。PCV對酸性環境(pH3)、氯仿或者高溫(56℃和70℃)有抵抗作用。PCV在原代胎豬腎細胞、恒河猴腎細胞、BHK-21細胞上不生長，可在PK-15細胞中生長，但不引起細胞病變，且需將PCV盲傳多代才能使病毒有效增殖。在接種PCV的PK-15細胞培養物中加入d-氨基葡萄糖，可促進PCV復制，使得感染PCV的細胞數量提高30％。感染PCV的細胞內含有許多胞漿內包涵體，少數感染細胞內含有核內包涵體。

PCV2屬圓環病毒科(Circoviridae)，是最小的無囊膜單鏈環狀DNA病毒，其單鏈環狀DNA染色質由1759個堿基組成，有11個開放閱讀框架，編碼11種蛋白質，豬圓環病毒的抵抗力較強，不易被滅活，在外界環境中可長時間存活。由豬圓環病毒(PCV2)引起的豬圓環病，臨床表現為體質下降、消瘦、皮膚發白、腹瀉、呼吸困難和黃疸。

PCV2與大多數典型的豬病原傳播不同，PCV2既可水平傳播，也可垂直傳播。Shibata等在近期研究中隨機的發現，臨床健康的豬體內含有PCV2[2]，說明PCV2可潛伏于健康豬群中，更出乎意料的是，科研工作者在懷孕母豬和哺乳期母豬的乳汁中檢測出PCV2[3] 1 豬圓環病毒病及其相關性致病因素

1.1 相關的致病因子

PCV2的致病因子主要與免疫刺激、宿主的敏感性和PCV2分離株有關[4]。研究表明，免疫刺激可以激發PCV2從感染向疾病方向發展而出現PMWS的機能障礙特征，這可能是由PRRSV或豬細小病毒(PPV)激活了巨噬細胞，從而促進了PCV2的增殖。

在宿主敏感性研究中發現，長白豬較杜洛克和大白豬更容易出現與PCV2相關的疾病爆發，而皮特蘭仔豬對與PCV2相關的疾病敏感性較低，且公豬的遺傳品系對PCV2相關疾病發病情況有顯著的影響。最新的證據則表明[5]，PCV2分離株在毒力上有一定的差異，但這種微小的分歧可能與病毒的地域來源有關，而與分離株的病毒毒力無關。

1.2 PCV2的協同感染疾病

PCV2的主要協同感染疾病在最初研究中傾向于豬肺炎支原體、PPV、PRRSV，可是隨著研究的深入，發現了如豬皮炎與腎炎綜合征、繁殖障礙、母豬流產和死亡綜合征和PMWS等很多疾病可能都會協同PCV2感染。

充分的證據表明，由于PCV2和PPV在豬體內具有類似的靶細胞，而PPV提高免疫系統的功能導致了更嚴重的疾病，PCV2和PPV的雙重感染會引發比單個感染PCV2更嚴重的臨床癥狀和病變，在發生PCV2相關疾病PMWA的豬群中，PRRSV居最常見的協同感染因子名單之首，其檢出率高達52％[6]。豬呼吸道綜合征(PRDC)、增生和壞死性肺炎(PNP)、豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)是發生在斷奶、育成豬及成年豬群中的疾病，被認為是由多種病因共同感染所致，由于PCV2在這些共同感染疾病中普遍存在，其在這些疾病的共同感染中扮演了何種角色已普遍引起了人們的關注[7-8]，但PCV2與PRRS和PMWS直接相關的證據[9-10]，愈來愈明顯。致病基因

PCV的基因組為單股、負鏈、環狀DNA，病毒基因組以滾環模式(rolling circle model)進行復制。PCV2的復制起始區位于一個324 bp的片段上，其包含1個莖-環結構、保守的九核苷酸基序(AAGTATTAC)、3個六核苷酸重復序列(CGGCAG)和2個五核苷酸重復序列，Rep和Rep’的共表達是起始PCV2的復制所必須的，對PCV2的保守九核苷酸基序進行突變，從而影響病毒的復制過程，Rep和Rep’蛋白協同定位于同一個細胞的細胞核內，二者既可以形成同源復合物，也可以形成異源復合物。

據研究報道認為，豬圓環病的致病基因可能與ORFl-6這6個編碼框編碼的蛋白有關，其中ORFl為Rep基因，編碼2種蛋白，負責PCV2的復制；ORF2為Cap基因，編碼Cap蛋白，是PCV2病毒的唯一結構蛋白，可誘導產生中和抗體；ORF3編碼的一種蛋白可以誘導宿主細胞凋亡[11-12]。

研究表明，ORF3誘導TNF-α達到較高水平可能與并發PPV和PMWS直接相關，ORF5誘導的IL-6可能與PDNS有關(PDNS也是IL-6明顯增強)[13]，OFFR2基因表達的IL-10可能是感染豬逐漸發展成更嚴重的PMWS，而ORFl表達的Thl(IFN-γ)和Th2(IL-13)PMWS和PDNS有某種聯系[14]。鑒別診斷技術

3.1 PCR方法

復合PCR技術具有單聯PCR技術同樣的優點，又能一次反應同時方便快捷的檢測鑒別多種不同病原體。夏平安教授[15]等針對可引起豬免疫抑制病的重要病原PRRSV和PCV2建立了一種復合PCR檢測方法，根據豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)美洲型標準株部分開放閱讀框保守序列和PCV2基因保守序列，設計合成了2對特異引物，最終建立了可同時檢測PRRSV和PCV2的復合PCR診斷方法。

馮志新等研究設計合成了一套引物和TaqMan探針，特異性擴增PCV2-ORF2基因，通過反應條件的優化，建立了快速定量檢測PCV2的實時PCR方法。該方法具有較好的特異性和重復性，對PCV2 DNA檢測的下限為1拷貝／uL，敏感性比常規PCR高106倍[16]。

Chae等報道了一種半槽式多重PCR，成功進行PCV1、PCV2和PPV的鑒別診斷，在98個精液樣品中發現，有20個陽性的PCV和42個陽性PPV，與半槽式PCR診斷結果相同。當PCV或PPV在人為污染的精液樣本中存在時，運用該技術分析發現：PCV和PPVDNA主要存在精

液和一小部分無精子中。實驗數據表明，該方法具有較高的敏感性和特異性，可以很好地區別PCV或PPV在豬上的感染。

Kathleen運用實時PCR檢測Rep基因(ORF1)在自然感染的豬群和實驗室人工感染的豬群的肺、淋巴結等組織，可以檢測到2.2×103～2．2×1010／mLPCV2拷貝數。同時，他們檢測到在所有被PMWS感染的豬群中都存在Rep基因，即證明了存在PCV2的混合感染的可能性。

3.2 ELISA和ELISA試劑盒

林彥星等應用原核表達的PCV2衣殼(Cap)蛋白作為診斷抗原，初步建立了一種檢測PCV2抗體的間接ELISA方法[17]。實驗表明該方法具有較高的敏感性和特異性，適于大規模檢測PCV2血清抗體的流行病學調查。秦承學等將PCV2 ORF1和ORF2基因分別插入桿狀病毒和大腸桿菌表達系統，用親和層析方法提純獲得重組衣殼(Cap)與復制(Rep)蛋白，用細胞融合技術獲得2株Cap和Rep蛋白單克隆抗體，以重組Cap和Rep蛋白作為抗原，通過反應重要條件的優化，建立了間接ELISA方法，有較好的特異性和重復性，可用于PCV2抗體檢測和疫苗免疫抗體鑒別診斷[18]。

研究人員研究對3種抗免疫球蛋白G的ELISA試劑盒檢測抗PCV2a和PCV2b抗體，同時也檢測了抗PCV2和PCV1抗體，55頭3周齡的小豬隨機分成7組，其中7頭為陰性對照，8頭接種PCV2a，8頭接種PCV2b，8頭接種PCV1，其余的24頭接種不同廠家的3種疫苗，收集1周的血液樣本，分別用3種試劑盒進行檢測，反應數值都大于0.94，檢測發現PCV2a和b抗體沒有根本區別，沒有檢測出PCV1抗體，但1種試劑盒可鑒別出經疫苗B接種的豬體內的PCV2a或PCV2b抗體[19]。

3.3 競爭性酶聯免疫吸附試驗(C-ELISA)

Walker以分離的PCV2細胞培養物作為抗原，以PCV2特異性單克隆抗體作為競爭性反應物，C-ELISA敏感性和特異性達到99.58％和97.14％。McNelilly等建立了PCV特異性抗原捕獲ELISA，其與定量病毒分離，可以區別PCV的臨床和亞臨床感染。

3.4 間接免疫熒光試驗

間接免疫熒光技術常用于豬圓環病毒感染的血清學普查，其特點是快速、特異、敏感，是目前診斷PCV2常用的血清學方法。在用于抗體檢測時，可將PCV2按種于96孔細胞培養板的PK-15細胞上，培養一段時間后，經丙酮固定干燥后即可。此方法不僅可以用于檢測抗體，而且可以用已知PCV特異性抗體檢測抗原，主要用于PCV的分離鑒定及豬源細胞PCV污染情況的普查，為疾病診斷和凈化豬源細胞提供了有效手段。

3.5 免疫金標檢測

浙江大學發明公開了一種豬圓環病毒2型(PCV2)抗原或抗體檢測試紙條。檢測試紙條既可以豬圓環病毒2型抗原也可以檢測血清中的PCV抗體，檢測試劑條操作簡單，易于大范圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。

3.6 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的具有明顯優勢的擴增技術，能夠在63℃～65℃等溫條件下擴增特異的DNA序列，在30～60min可以得到肉眼可見的結果，該技術在禽流感的快速診斷中已成功運用。據研究數據統計分析表明，此技術的敏感性高于PCR，同時，在檢測PCV1，PPV，PRV時無交叉反應，特異性較高，能夠完成對PCV2的快速檢測和定性分析，為PCV2的診斷提供了一種快速敏感的檢測方法。

3.7 基因芯片技術

基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的，工作原理是應用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析。基因芯片是在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子識別探針，能夠在同一時間內平行分析成千上萬的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析。基因芯片技術已經成功地應用于禽流感和口蹄疫等重大疾病的快速診斷及分型和定型，但在PCV2混合感染的相關疾病的快速診斷和鑒定上還沒見報道。可以預見，在不久的未來可能會出現基因芯片技術在PCV2引起的相關疾病上的應用。

3.8 原位雜交(ISH)技術

ISH具有高度敏感性，在國內外已經建立了多種方法。應用ISH既可以對PCV1和PCV2進行分型，又可以檢測PCV與其他病毒的混合感染。劉方娜等根據GenBank中已發表的豬圓環病毒2型(PCV2)基因序列，在ORF2內設計l對特異性引物，利用PCR反應擴增出371 bp的核酸片段，回收并純化PCR產物，用地高辛標記，建立了地高辛標記核酸探針診斷PCV2的方法[20]。該探針與8個PCV2重組菌的核酸抽提物均能發生特異性雜交，而與對照組豬圓環病毒I型(PCVI)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)的核酸雜交均為陰性；對PCV2 DNA的最低檢測量為lOpg。結論與討論

PCV2與一系列豬的綜合感染相關，這些疾病包括PMWS，PNP，PDNS，PRDC。很顯然，這些疾病的發生與發展，至少與PCV2損毀豬的免疫系統有關，比如，PMWS發展是由于免疫系統異常和免疫抑制有關。顯微鏡觀察發現，PCV2在淋巴組織的淋巴細胞、組織細胞和巨細胞廣泛存在，導致體液免疫和細胞免疫失敗。同時，由于PCV2分離株在毒力和地理分布上相差較大，這就意味著它的病原學意義有相當高的研究價值。

有文獻報道，PCV2可以感染牛，接種PCV2完全可以致死8周齡的小鼠，這是否意味感染別的動物還需要進行很多的調查研究。目前，PCV2的研究傾向與動物解剖，然后進行分型和鑒定，這明顯不利于動物安全生產、疾病的控制和人類自生安全。PCR技術有存在假陽性的問題，ELISA雖然特異性和敏感性較高，但它所用時間較長，在快速診斷方面顯然不足，LAMP技術花費時間較少，敏感性和特異性也較高，但他是一個相對較新的技術，還需要更多的臨床驗證，基因芯片技術已經成功地應用于禽流感、口蹄疫和人類重大疾病的快速診斷及分型和定型，但在PCV2診斷和鑒定上還沒見報道。如何與PCV2相關疾病的混合感染中進行快速的分型和定型鑒定，如何加強傳統診斷技術的完善，以及加大對PCV2分子致病特性的研究力度，是科學工作者努力探索的問題；從而建立快速、敏感、準確的分子診斷技術和診斷方法，定期檢測和預測即將流行的毒株，不斷提高傳統技術敏感度和特異性，同時不斷推廣和完善新方法、新技術，為早期、快速、特異、敏感地鑒別診斷此病毒，為有效地防控PCV2暴發與蔓延具有重大的理論意義和現實意義，控制PCV2對全世界養殖業及公共衛生構成的巨大威脅。

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第四篇：豬圓環病毒病 概述

豬圓環病毒病 概述： 本病由豬圓環病毒(PCV)引起。病原-----PCV

1、分類：1995 年列為圓環病毒科（Circoviridae)。在本科里還有其 他的病毒，如雞傳染性貧 血病毒（CAV）、鸚鵡喙羽病病毒（BFDV）。PCV、BFDV 列為圓環病毒屬，CAV 列為環形 病毒屬。2.核酸類型：DNA。其單鏈環狀 DNA 染 色質有 1759 個堿基組成。且已克 隆測定了序列。11 個開放閱讀框架，有 編碼 11 種蛋白質。引起 PMWS 的 PCV 和引起 PK-15 污染的 PCV，同屬于圓環病毒屬，且高度的同源，但抗原性及 DNA 序列方面有一定的差異。為了區別，日前將 PCV－PK15 稱為 PCV-1，而將 PMWS 稱為 PCV-2。

3、形態大小： 為無囊膜二十面體，大小約 4～26.5nm。

4、PCV 可在豬源細胞上復制，但 CPE 不明 顯。

5、存在：淋巴結，骨髓，血液。流行病學

1、PCV 易引起豬發病，一 般不與 CAV 和 BFDV 發生交叉感染，但用 ELISA 證實人血清有 30%、小鼠血清 12%~69%、牛血清 35%抗體陽性。

2、血清學調查表明：豬的陽性為 20%~80%，且分布極其廣，幾乎世界各處都有。

3、周齡的豬多發，PRRS 陽性豬群中更易繼發本病。6~8 在

4、發病率高，病死率有高有低，但即使不死，亦誘發其它疾病的發生。癥狀 ①仔豬 斷奶后多系統衰弱綜合癥； ②豬皮炎腎病綜合癥； ③相關性繁殖障礙綜合癥； ④相關性肺炎； ⑤相關性腸炎； ⑥相關性神經系統病。體重減輕，漸進性消瘦，虛弱。呼吸困難，過速，偶有咳嗽。皮膚蒼白，結膜黃染。下痢、腹瀉。中樞神經紊亂。病 變： 全身淋巴結腫大，尤以腹股溝淋巴結為最，腫大達 3~4 倍，切面充血、出血。肺 彌漫性病變，比重增加，堅實成橡皮樣，表面呈花斑狀。肝花斑狀，萎縮。脾腫 大，切面呈肉狀。腎被膜有白色病灶，腫大。回腸有花斑狀。診斷：

一、臨診 腹股溝淋巴結腫大，脾、腎腫大，肝萎縮，漸進性消瘦，有診斷價值。

二、實驗

1、原代腎細胞或 PK-15 可用作培養 PCV-2，但在細胞培養物上還不能判是否有 病毒存在。需要特異抗體用免疫熒光或直接免疫過氧化物酶染色確認。

2、用 PCR 擴 增病毒。

3、待檢材料做組織切片，觀察有否包涵體。

4、ELISA 測定抗體。防 治

1、預防：圓環病毒-繁殖障礙與呼吸綜合癥二聯苗。首免：10-15 日齡。二免： 30-35 日齡。

2、發病后的處理： 1）在飼料中添加呋喃妥咽或病毒靈或病毒唑，多維。2）注射圓環·藍毒康或圓環抗毒殺。3）注射豬用干擾素

第五篇：豬圓環病毒2型(PCV2)衣殼蛋白表達綜述

PCV2是圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬成員，為單股環狀負鏈無囊膜的DNA病毒, 為已知的最小動物病毒之一，約17~ 20nm, 二十面體對稱。根據病毒的抗原性和基因組成不同，可分為2種基因型或稱血清型, 即PCV1型和PCV2型。PCV1無致病性。PCV2具有致病性，基因組全長1767bp或1768bp，包括11個讀碼框，其中ORF2編碼病毒的主要結構蛋白)核衣殼蛋白(Cap)，其N端包含一個由41個氨基酸殘基組成的的核定位信號(Nuclear location signal，NLS)，與PCV2在細胞核內定位有關。Mahe和Liu等分別在sf 9真核細胞及大腸桿菌中進行了PCV2Cap蛋白的表達, 但Cap蛋白的表達量較低。為了提高Cap蛋白的表達量, 本實驗成功構建去除NLS的重組質粒, 并對其進行表達、純化、鑒定。

1材料和方法

1.1pcv-581重組質粒的構建

1.1.1PCR擴增去除NLS基因的pcv-581

1.1.1.1引物的設計與合成: 根據本實驗室保存毒株的測序結果, 用Oligo6.0設計刪除核定位信號特異引物(由大連寶生物工程公司合成), 并引入限制性內切酶BamHI、HindIII(加下劃線表示)。上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;產物長度581bp。

1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接種PCV2病毒的PK-15細胞懸液500uL, 常規方法提取, 最后加20uL滅菌去離子水溶解,-20度保存。

1.1.1.3PCR擴增: PCR的反應體系總體積25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去離

子水補到25LL。反應參數為: 95e , 5min;94e, 45

s;55.9e, 45s;72e, 45s;30個循環;72e , 7min。

取5LLPCR產物進行電泳分析(見圖1)。

1.1.1.4PCR擴增產物的酶切、回收: 醇沉淀PCR

擴增產物、酶切、回收。具體操作方法如下: PCR

產物補到100LL, 加入等體積異丙醇, 置-20e 靜

止過夜, 13 000r/ min離心15min棄上清, 加入

600LL75%乙醇, 7000r/min離心5min, 倒掉上清,晾干, 加入10LL滅菌去離子水溶解。將醇沉產物

進行BamHI酶切, 體系為20LL: 10@buffer K2LL,BamHI 1LL(15U/ LL , TaKaRa), 醇沉產物10LL,H2O7LL, 37e 酶切1h。將酶切產物繼續醇沉淀

(方法步驟同上)后進行HindIII(15U/ LL, TaKaRa)

單酶切, 酶切體系同上, 回收目的片段。

1.2pQE-pcv581重組質粒的構建和鑒定: 將載

體pQE-32(QIAGEN)質粒用BamHI 和HindIII雙

酶切, 做100LL 酶切體系: 10@ buffer K10LL,BamHI2LL, HindIII 2LL, pQE-32質粒70LL, H2O

16LL。37e 酶切2h15min, 用膠回收試劑盒回收

(TIANGEN, 操作按照說明書進行), 目的片段和載

體常規方法連接、轉化M15、篩選陽性重組質粒

pQE-pcv581。酶切鑒定(見圖2)。

1.3重組蛋白的誘導表達及純化

從含有氨芐抗性的瓊脂平板上挑取單個陽性

菌落接種到5mL氨芐抗性(100Lg/ mL)的LB液體 培養基中, 37e 過夜振蕩培養、活化, 取過夜活化 的培養物按照的比例接種到5mL含氨芐抗性的液 體LB培養基, 37e 振蕩培養, 培養至OD600nm達 0.4-0.6, 然后加入IPTG(TaKaRa)至終濃度為0.2mmol/ L、0.4mmol/ L、0.6mmol/ L、0.8mmol/ L、1.0mmol/L、1.2mmol/L繼續培養, 分別在誘導前、誘 導1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取樣, 取1mL菌液離心