第一篇：實驗四：細菌的接種、培養和分離技術

實驗四：細菌的接種、培養和分離技術

一、實驗目的與要求：

（1）掌握從環境（土壤、水體、活性污泥等）中分離培養細菌的方法，從而獲得若干種細菌純培養技能

（2）掌握細菌純種分離的方法：稀釋平板分離法和平板劃線法。

（3）掌握幾種接種技術：斜面接種技術、穿刺接種、稀釋平板涂布法等。

二、實驗原理

在土壤、水、空氣或人及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數都是混雜生活在一起，當我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養，這種獲得純培養的方法稱為微生物的分離與純化。

為了獲得某種微生物的純培養。一般是根據該微生物對營養、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。

三、實驗器材

1、牛肉膏蛋白胨培養基

2、盛9ml無菌水的試管，盛90m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，1ml和5ml無菌 吸管，無菌培養皿；

3、接種環，土樣，酒精燈等。

四、操作步驟

1、倒平板 將加熱融化的牛肉膏蛋白胨培養基倒平板，并標明培養基的名稱。

2、貼標簽 接種前在試管上貼上標簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口徑2-3厘米的位置。

3、點燃酒精燈。

4、接種

取接種環 右手拿接種環(如握鋼筆一樣)、在火焰上將環端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分，均用火燒過滅菌。

環冷卻 將灼燒過的接種環伸入菌種管，先使環接觸邊壁，使其冷卻。

取菌種 待環冷卻后輕輕沾取經稀釋10倍的土壤懸液-環，然后將接種環移出菌種管，注意不要使環的部分碰到管壁，取出后不可使環通過火焰。

接種 在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使形成單個菌落。常用的劃線方法有下列二種：

⑴用接種環以無菌操作挑取土壤懸液一環，先在平板培養基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉動培養皿約70°角，并將接種環上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線(圖A)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養。

⑵將挑取有樣品的接種環在平板培養基上作連續劃線(圖B)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養。

環滅菌 將接種環燒紅滅菌。

5、挑菌 將培養后長出的單個菌落分別挑取接種到上述三種培養基的斜面上，分別置25℃和28℃溫室中培養，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。

四、注意事項

1、實驗操作過程中無菌操作。

第二篇：細菌分離鑒定

細菌分離鑒定

目的要求：

熟悉臨床標本中常見的病原性細菌的分離鑒定方法，細菌分離鑒定。

實驗內容：

一、膿汁、咽拭子等標本中病原性細菌的分離與鑒定

(一)標本采集

1.膿拭子：用無菌棉簽蘸取患處深部膿液或分泌物少許，置入無菌空試管內，送檢。

2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用無菌棉簽挑取膿稠痰塊，置入無菌空試管內，送檢。

3.咽拭子：囑病人把口張大，用壓舌板壓住舌根，用無菌棉簽迅速蘸取咽部分泌物，置入無菌空試管內，送檢。

4.血標本：疑為敗血癥患者，在嚴格無菌操作下，靜脈采血，床旁直接加入含50ml的肉湯瓶內，立即搖勻后送培養。

5.腦脊液：對疑似流腦患者，作腰椎穿刺取腦脊液，立即行直接床旁接種(送檢過程中應注意保溫)。

6.尿道、陰-道分泌物：對可疑淋病患者，男性可從尿道取材，取材時導尿管應進入尿道1cm～2cm，如為剛排尿，應等待1h左右;女性則可以從宮頸口取分泌物，當內窺器插入宮頸口后應稍等片刻，再旋轉取出，取材應立即送檢，不可放置冰箱。

(二)分離鑒定程序

待檢標本可直接做涂片染色檢查鑒定，必要時可做分離培養、生化反應及致病性鑒定。常見的致病性球菌檢查程序如下。

直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態、排列、染色性)

膿、痰、咽拭子

分泌物、腦脊液 觀察菌落性狀、溶血性、色素

血瓊脂平板→ 涂片、染色、鏡檢

↑ 挑取可疑菌落 生化反應

血液、穿刺液 →肉湯培養基 純分離 致病性測定

↓ 藥敏試驗

如培養液混濁時可涂片、染色、鏡檢

(三)常見臨床標本的檢查方法

1．膿拭子

在膿汁中除了球菌外，也有桿菌存在，例如革蘭陽性的有炭疽桿菌、白喉桿菌、結核桿菌、枯草桿菌等，革蘭陰性的有大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，此外尚可有真菌、放線菌、螺旋體等。

材料

(1)標本：膿拭子

(2)培養基：血瓊脂平板

(3)兔血漿、白色濾紙片、無菌生理鹽水、載玻片

方法 膿汁 → 革蘭染色 → 鏡檢

↓ ↑

血瓊脂平板 →觀察菌落形態及溶血情況

↓

致病力試驗

(1)將膿拭子作革蘭染色，鏡檢(先作培養再涂片以免污染)，鑒定材料《細菌分離鑒定》。標本放置4℃冰箱保存，待報告發出后再丟棄。

(2)將膿汁涂布于血瓊脂平板上，再以滅菌接種環作劃線分離。置培養37℃培養18h～24h。

(3)經培養后據菌落特點及涂片檢查結果進行初步識別，根據需要再作進一步鑒定。若菌落較大、溶血透明、產生金黃色色素、涂片為革蘭陽性球菌并成堆排列時可能系葡萄球菌，應確定其為何種葡萄球菌;必要時再作血漿凝固酶試驗及甘露醇發酵試驗，確定其致病力。

2.咽拭子

咽喉中存在的細菌較多，可以有厭氧及需氧性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四聯球菌、腦膜炎球菌、卡他球菌、喉桿菌、結核桿菌枯草桿菌、百日咳桿菌肺炎桿菌及綠膿桿菌等。此外也可有白色念珠菌奮森螺旋體等。本實驗以咽拭子作為標本，重點檢查病原性球菌。

材料

(1)標本:咽拭子。

(2)培養基:血瓊脂平板。

方法

咽拭子

↓

血瓊脂平板

↓

觀察菌落形態及溶血性

↓

革蘭染色，鏡檢

取標本涂布于血瓊脂平板，再以滅菌接種環劃線分離，置37℃培養18h～24h培養。標本放置4℃冰箱保存，待報告發出后再丟棄。

可根據下述特點進行鑒別：

(1)在菌落周圍產生2mm～4mm寬、界線分明、完全透明的溶血環、涂片為革蘭陽性球菌并呈鏈狀排列，可能是乙型溶血性鏈球菌。

(2)菌落細孝半透明、有草綠色溶血環、涂片為革蘭陽性球菌呈鏈狀排列，可能為甲型溶血性鏈球菌。需要進一步與肺炎球菌區別時，可做膽汁溶菌試驗及菊糖發酵反應。

菌落細小半透明、不溶血、涂片為革蘭陽性鏈狀排列的球菌時，為丙型鏈球菌。

(4)菌落扁平邊緣隆起、中央稍凹、半透明、呈草綠色溶血、革蘭染色為陽性雙球菌、呈矛頭狀排列時為肺炎球菌，應以膽汁溶菌及菊糖發酵反應與甲型溶血性鏈球菌區分。

(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革蘭染色為陰性雙球菌，呈腎形排列時，可能為腦膜炎球菌，需要進一步作氧化酶試驗及糖發酵試驗(接種于含血清之葡、麥、蔗糖發酵管中)。

二、糞便標本中腸道桿菌的分離與鑒定

(一)標本收集

取患者的糞便或肛-門拭子。

(二)鑒定程序

腸道桿菌為一大群革蘭陰性桿菌，從形態及染色性上無法鑒別為何種菌，只能依靠生化反應和血清學反應進行鑒定。

患者糞便(粘液、膿血)→腸道選擇、鑒別培養基(如ss、中國藍、伊紅美蘭)

↓

挑取可疑菌落(據大孝顏色、透明度而定)

↓

雙糖鐵及其他鑒別培養基

↓

據結果分析鑒定

↓

玻片凝集(做出特異性診斷)

葡萄糖乳糖動力H2S尿素

⊕⊕±--艾希菌屬非致病菌

⊕+---克雷伯菌屬

⊕±+++變形桿菌

⊕-++-乙型副傷寒致病菌

⊕-+±-甲型副傷寒

+-++-傷寒桿菌

+----痢疾桿菌

第三篇：污水處理細菌培養規程(無接種污泥1)

污水處理好氧細菌培養規程

（無接種污泥）

一、培養前的準備工作

1、各構筑物建成，并經清池清除建筑垃圾，靜壓試驗證明無滲漏，無下沉位移，最后按有關規程驗收合格。

2、電器、機械、管路等全部設備建成并經單機試車、聯動試車正常。最后按有關規程驗收合格。

3、根據日后運行管理需要，有條件的污水處理廠（站）需進行最基本的常規化驗測試，如pH、水溫、COD、DO、生物相等，用以指導活性污泥的培養過程和日常運行。

4、基礎數據的調查摸底，包括污水流量晝夜變化情況，水質（pH、水溫、COD、BOD5/CODCr、含氮、含磷、有毒物質等）及其變化情況，各種設施和設備的技術參數。

5、根據處理水質狀況備足必需的營養物(碳源：大糞及淀粉、氮源：尿素、磷源：普鈣Ca（H2PO4)2)，以備缺什么補什么。

6、操作人員應熟悉整個系統的管道布置和公用工程方面的情況，了解污泥培養的基本過程和控制要求。

7、人員到位，自培養和馴化后一般應使系統連續運行，不能脫人。

8、編制必要的化驗和運轉的原始記錄報表以及初步的建章立制。從培菌伊始，逐步建立較規范的組織和管理模式，確保啟動與正式運行的有序進行。

二、培菌

1.向好氧池注入清水（同時引入生活污水）至一定水位，并注意水溫 2.按風機操作規程啟動風機，鼓風。

3.向好氧池投加經過濾的濃糞便水（當糞便水不充足時，可用化糞池和排水溝內的污泥補充。），使得污泥濃度不小于1000mg/L，BOD達到一定數值。

4.有條件時可投加活性污泥的菌種，加快培養速度。

5.按照活性污泥培養運行工藝對反應池進行曝氣、攪拌、沉降、排水。水氣體積控制在1：（5~10）。曝氣時間采取6h充氧，4h停機的方式進行，排水參見7。

6.通過鏡檢及測定沉降比、污泥濃度，注意觀察活性污泥的增長情況。并注意觀察在線PH值、DO的數值變化，及時對工藝進行調整。

7.測定初期水質及排水階段上清液的水質，根據進出水NH3-N、BOD、COD、NO3-、NO2-等濃度數值的變化，判斷出活性污泥的活性及優勢菌種的情況，并由此調節進水量、置換量、糞水、碳源、氮源、磷源的投加量及周期內時間分布情況

8.注意觀察活性污泥增長情況，當通過鏡檢觀察到菌膠團大量密實出現，并能觀察到原生動物（如鐘蟲），且數量由少迅速增多時，說明污泥培養成熟，可以進生產廢水，進行馴化。

三、活性污泥的馴化（調試）步驟

1.通過分析確認來水各項指標在允許范圍內，準備進水。

2.開始進入少量生產廢水，進入量不超過馴化前處理能力的20％。同時補充新鮮水、糞便水及氮源。

3.達到較好處理后，可增加生產廢水投加量，每次增加不超過10～20％，同時減少氮源投加量。且待微生物適應鞏固后再繼續增生產廢水，直至完全停加氮源。同步監測出水CODcr濃度等指標,并觀察混合液污泥性狀。在污泥馴化期還要適時排放代謝產物,即泥水分離后上清液。

4.繼續增加生產廢水投加量，直至滿負荷。滿負荷運行階段,由于池中已培養和保持了高濃度、高活性的足夠數量的活性污泥,池中曝氣后混合液的MLSS達到5000mg/1,此過程同步監測溶解氧,控制曝氣機的運行,并進行污泥的生物相鏡檢。

四、調試期間的監測和控制

在調試及運行過程有許多影響處理效果的因素,主要有進水CODcr濃度、pH值、溫度、溶解氧等,所以對整個系統通過感官判斷和化學分析方法進行監測是必不可少的。根據監測分析的結果對影響因素進行調整，使處理達到最佳效果。

1、溫度 溫度是影響整個工藝處理的主要環境因素,各種微生物都在特定范圍的溫度內生長。生化處理的溫度范圍在10～40℃,最佳溫度在20～30℃。任何微生物只能在一定溫度范圍內生存，在適宜的溫度范圍內可大量生長繁殖。在污泥培養時，要將它們置于最適宜溫度條件下，使微生物以最快的生長速率生長，過低或過高的溫度會使代謝速率緩慢、生長速率也緩慢，過高的溫度對微生物有致死作用。

2、pH值

微生物的生命活動、物質代謝與pH值密切相關。大多數細菌、原生動物的最適pH值為6.5～7.5，在此環境中生長繁殖最好，它們對pH值的適應范圍在4～10。而活性污泥法處理廢水的曝氣系統中，作為活性污泥的主體，菌膠團細菌在7～8.5的pH值條件下可產生較多粘性物質，形成良好的絮狀物。

3、營養物質

廢水中的微生物要不斷地攝取營養物質，經過分解代謝(異化作用)使復雜的高分子物質或高能化合物降解為簡單的低分子物質或低能化合物，并釋放出能量；通過合成代謝(同化作用)利用分解代謝所提供的能量和物質，轉化成自身的細胞物質；同時將產生的代謝廢物排泄到體外。

水、碳源、氮源、無機鹽及生長因素為微生物生長的條件。廢水中應按BOD5∶N∶P=100∶4∶1的比例補充氮源、含磷無機鹽，為活性污泥的培養創造良好的營養條件。

4、懸浮物質SS 污水中含有大量的懸浮物,通過預處理懸浮物已大部分去除,但也有部分不能降解,曝氣時會形成浮渣層,但不影響系統對污水的處理。

5、溶解氧量DO 好養的生化細菌屬于好氧性的。氧對好氧微生物有兩個作用：①在呼吸作用中氧作為最終電子受體；②在醇類和不飽和脂肪酸的生物合成中需要氧。且只有溶于水的氧(稱溶解氧)微生物才能利用。

在活性污泥的培養中，DO的供給量要根據活性污泥的結構狀況、濃度及廢水的濃度綜合考慮。具體說來，也就是通過觀察顯微鏡下活性污泥的結構即成熟程度，測量曝氣池混合液的濃度、監測曝氣池上清液中CODCr的變化來確定。根據經驗，在培養初期DO控制在1～2mg/l，這是因為菌膠團此時尚未形成絮狀結構，氧供應過多，使微生物代謝活動增強，營養供應不上而使污泥自身產生氧化，促使污泥老化。在污泥培養成熟期，要將DO提高到3～4mg/l左右，這樣可使污泥絮體內部微生物也能得到充足的DO，具有良好的沉降性能。在整個培養過程中要根據污泥培養情況逐步提高DO。

特別注意DO不能過低，DO不足，好氧微生物得不到足夠的氧，正常的生長規律將受到影響，新陳代謝能力降低，而同時對DO要求較低的微生物將應運而生，這樣正常的生化細菌培養過程將被破壞。

6、混合液MLSS濃度

微生物是生物污泥中有活性的部分,也是有機物代謝的主體,在生物處理工藝中起主要作用,而混合液污泥MLSS的數值即大概能表示活性部分的多少。對高濃度有機污水的生物處理一般均需保持較高的污泥濃度,本工程調試運行期間MLSS范圍在:4.4～5.6g/l之間,最佳值為4.8g/l左右。

7、進水CODcr濃度，進水中有機物濃度對處理影響很大。

8、污泥的生物相鏡檢

活性污泥處于不同的生長階段,各類微生物也呈現出不同的比例。細菌承擔著分解有機物的基本和基礎的代謝作用,而原生動物〈也包括后生動物〉則吞食游離細菌。污水調試運行期間出現的微生物種類繁多,有細菌、綠藻等藻類、原生動物和后生動物,原生動物有太陽蟲、蓋纖蟲、累校蟲等,后生動物出現了線蟲。調試運行后期混合液中固著型纖毛蟲,如累校蟲的大量存在,說明處理系統有良好的出水水質。

9、污泥指數SVI,正常運行時污泥指數在800/mg左右。

第四篇：稠油四組分分離學生實驗講義

實驗一

（二）柱層析法分離稠油中的四組份

實驗目的：

1、了解復雜物質的柱層析分離分析方法；

2、掌握柱層析分離稠油四組分的操作；

3、復習過濾、旋轉蒸發等操作步驟。實驗意義：

稠油是一種成分復雜的非常規烴類資源，按照極性可分為飽和烴、芳香烴、膠質和瀝青質四個組分。對稠油的研究首先要將其分成上述四個組分，再通過各種檢測手段（IR、EL、GCMS、HNMR等）進行分析。

柱層析技術又稱柱色譜技術，是根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同，經多次反復分配平衡后，最終將組分分離的方法。

本實驗通過稠油四組分柱層析方法分離，使學生掌握使用柱層析分離稠油四組分的實驗方法和操作。實驗儀器與試劑：

儀器：旋轉蒸發儀、循環水式真空泵、索氏提取器、冷凝管、電熱套、超聲波清洗器、分析天平、25mL小燒杯、250mL平底燒瓶、滴管、玻璃棒、分離柱、洗耳球、長頸漏斗、11cm定性濾紙

試劑：中性三氧化二鋁（100~200目）、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇（以上均為AR）、石英砂

實驗步驟：

一、分離前準備

1、活化氧化鋁

取中性氧化鋁（100-200目）若干于瓷坩堝中，置于馬弗爐，400-450℃煅燒6h；取出后放至干燥器中泠卻至室溫，加入1%（按氧化鋁質量計）的蒸餾水，劇烈搖晃10min至混合均勻，干燥器中過夜備用。

2、溶解油樣

取0.5g-0.6g油樣于250mL平底燒瓶中，用80mL正己烷溶解，蓋好蓋子超聲15min，靜置十分鐘。

3、準備四個250ml平底燒瓶貼上標簽稱重備用。

二、過濾與抽提

1、過濾油樣

將濾紙折為菊花狀，過濾之前準備好的油樣。

2、抽提組分

將濾紙放入索氏抽提器，濾液中加入正己烷至液面高于電熱套加熱邊緣；打開電熱套至沸騰，抽提至抽提器中液體澄清為止，得到三組分溶液；取一燒瓶加入氯仿90ml，打開電熱套至沸騰，抽提至抽提器中液體澄清為止，得到瀝青質溶液。

三、柱層析分離三組分

1、填裝柱子

層析柱中填充約20cm高活化好的氧化鋁，敲打柱子5min至填充的氧化鋁變實，鋪上一層石英砂防止被沖開。

2、柱層析分離三組分

先倒入少量正己烷排出柱子中空氣；至液面余約1cm時，緩慢倒入三組分溶液，并用少量正己烷將燒瓶中殘留溶液洗凈；少量多次倒入總量70mL正己烷，淋洗得飽和烴；接著少量多次倒入正己烷+二氯甲烷（30+30）混合液60mL，淋洗得芳香烴；最后少量多次倒入甲醇+二氯甲烷（30+30）混合液60mL，淋洗得膠質。

四、旋轉蒸發，揮干稱重

1、旋轉蒸發

對分出的四組分溶液進行減壓旋轉蒸發，溫度為40-45℃，蒸發至燒瓶中無液體為止。

2、稱重

旋蒸后的重量減去燒瓶重量，計算出四組份的粗重及各組分所占百分比。數據處理：

某一組分% =（某一組分質量/四組份總質量）X 100% 問題思考：

1、稠油四組分的極性大小如何排列，依據是什么？

2、如柱子填充不實，對分離效果有何影響？

3、淋洗時為何每次加液要待液面余約1cm時？

4、實驗過程中還有哪些操作會影響分離效果？

第五篇：土壤微生物的分離培養技術實驗報告

重慶大學研究生專業實驗教學

實驗報告書

實驗課程名稱： 實驗指導教師： 學

院： 專業及類別： 學

號： 姓

名： 實驗日期： 成績：

重慶大學研究生院制

一、實驗目的

1、了解分離與純化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培養基的方法與平板劃線分離的基本操作技術；；

3、學習習近平板菌落計數的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步觀察來自土壤中的幾類微生物的菌落形態特征，并能判斷菌的類型。

二、實驗原理

1、培養基的種類

培養基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質，用以培養、分離、鑒別、保存各種微生物或積累代謝產物。一般的培養基應包含適合微生物生長的6大營養素即水分、碳源、氮源、能源、無機鹽和生長因子。培養基的種類很多，根據培養成分的不同可分為天然培養基、合成培養基與半合成培養基；根據物理狀態的不同又可分為液體培養基和固體培養基。微生物的分離、純化、記數等方面的研究常常使用的就是固體培養基。本實驗就是使用的固體培養基。

已配制好的培養基必須立即滅菌，如來不及滅菌，應暫存冰箱，以防止其中微生物生長繁殖而消耗養分和改變培養基酸堿度所帶來不利影響。

培養基的原材料來源十分廣泛，本實驗采用的原材料為土豆。

2、接種方法與無菌接種

將微生物的培養物或含有微生物的樣品移植到培養基上的操作技術稱之為接種。接種是微生物實驗及科學研究中的一項最基本的操作技術。接種的關鍵是要嚴格的進行無菌操作。微生物的接種方法很多，劃線接種、三點接種、穿刺接種、混澆接種與涂布接種是幾種常用的接種方法。

劃線接種是最常用的接種方法，即在固體培養基表面作來回直線形的移動，就可以達到接種的目的。常用的接種工具為接種環、針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。三點接種是把少量的微生物接種在平板表面，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察研究它們的形態。研究霉菌形態時就常用此法。

穿刺接種是用針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺。該法常用于厭氧菌種的保藏或微生物的動力研究。

混澆接種是先將待接的微生物放入培養皿中再倒入冷卻至45℃左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就被稀釋了。待平板凝固后，置于適宜溫度下培養，就可以長出單個菌落的微生物。

涂布接種是將菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可以長出單個菌落的微生物。

本實驗采用的是劃線接種。為了防止接種時引入其它微生物，整個操作過程均需在無菌操作臺上進行，還需對操作員的雙手進行酒精消毒，每次劃線前都需灼燒接種環，接種時才打開培養皿且不能全部打開，接種完馬上關上。

三、實驗器材

1、儀器

培養皿、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、酒精燈、玻璃棒、接種環、15ml離心管、試管架、鑷子、電磁爐、鍋、恒溫培養箱、高溫滅菌鍋、無菌操作臺、酒精燈、天平、濾紙等。

2、材料

土豆、瓊脂、蒸餾水、酒精、土壤樣品

四、實驗步驟

1、土壤稀釋液的配制

① 在菜地用九點取樣法取適量土壤樣品，具體操作為：在菜地選取九個取樣點，在每個取樣點取相同量的表層土壤（10cm左右），然后將其混合均勻；

② 稱取1g土壤樣品與99ml蒸餾水，將其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸餾水于15ml離心管中，再用移液槍取1ml前一步已配制的土壤溶液于離心管中，搖勻，即為10-3的土壤溶液；

④ 重復前一步，將土壤溶液稀釋為10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀釋液。

2、土豆培養基的制備

① 用天平稱取200g土豆，清洗干凈后去皮切丁；

② 用量筒量取1000ml蒸餾水與電磁爐鍋中，再加入已準備好的土豆，將其煮爛；

③ 從鍋中取出已煮爛的土豆，用紗布過濾，濾液待用； ④ 稱取20g瓊脂與濾液中，再用蒸餾水定容至1000ml；

⑤ 在制備好的濾液中加入0.1ml菌液，然后放入高溫滅菌鍋中，在121℃下滅菌20min；

⑥ 取出已滅菌的土豆培養基，待其熔化后冷卻至60℃，倒入每付平板約15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接種與分離

① 將接種需要的所有器材均放置于無菌操作臺上；

② 用浸泡在酒精里棉花給雙手滅菌，點燃酒精燈，右手拿接種環，左手拿培養基；

③ 將接種環放在火焰上燒灼，待其冷卻后在10-6土壤稀釋液中蘸取少量液體，打開培養基的一部分，采用劃線接種，使之形成單菌落，一共劃線3-4次，每劃線一次就需在火焰上燒灼一次；

④ 重復上步，接種10-

7、10-8的土壤稀釋液的微生物；

⑤ 接種完的培養基放在恒溫培養箱中倒置培養48h，取出觀察。

五、結果與思考

1、實驗結果

圖1 實驗結果如圖1所示。由圖1可知，采用劃線接種土壤微生物的培養皿里有單菌落出現，這說明劃線接種能達到分離培養的目的。

學習過微生物這門課程的同學都知道，真菌的菌落較大且疏松，菌絲細長，呈絨毛狀、蜘蛛網狀、棉絮狀，無固定大小，多有光澤，不易挑，孢子會呈現紅色、褐色、綠色、黑色、黃色等不同的顏色；細菌的菌落較小，形狀表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多為白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有細菌。

2、思考題

⑴在平板劃線法中，為什么每次都需要將接種環上的剩余物燒掉？

答：這么做的主要目的是殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，以使下次劃線的菌種直接來自于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少，從而達到分離菌株的目的。

⑵為什么要把培養皿倒置培養？

答：①操作時培養皿蓋上可能粘有水珠或者細菌，倒著培養可以避免培養皿蓋上的水珠或者微生物落在培養皿上；

②培養過程中，細菌在代謝繁殖過程中會產生一些有害于細菌生長繁殖的代謝物，釋放熱量及有水排出，如果不倒著培養會有水珠滴落到培養基中，影響菌落的生長;③如果培養目標是收集細菌代謝物，而且代謝物易溶于水，倒著培養可能會方便收集。

六、實驗總結 我本科所學專業是材料科學與工程，本次實驗是我高中后第一次接觸微生物方面的知識。在本次實驗課里，段老師先給我們詳細講解了微生物分離培養方面的許多理論知識，然后才進入了理論環節。在實驗操作過程中段老師一直在我們旁邊觀察我們的實驗操作過程，一旦出現錯誤，會立即指出并耐心的給我們講解應該怎么做，我擔心自己從來沒做過微生物培養方面的實驗會做不好，段老師還一直在旁邊鼓勵我，并給我講解了許多微生物分離培養方面的知識，最后我獨立完成了本次實驗。此次實驗課，我真的是受益匪淺，學到了許多微生物分離培養方面的知識，十分感謝段老師。

圖2 如圖2所示，本次微生物分離培養實驗中，有些培養皿里菌落很少，只有一個，有的甚至沒有。我認為出現這種情況原因可能是：劃線接種時，未等接種環冷卻就開始接種，微生物可能被高溫殺死；在接種時，酒精燈火焰太大，進行接種操作的全過程又離酒精燈火焰很近，這也可能將微生物殺死。