第一篇：學習做切片

形態學方法 免疫組織化學

實驗對象：冰凍切片

步驟

1、室溫下復溫30min，0.01MPBS清洗5min×3；

2、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MPBS 100ml）30min，以增加細胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3； 3、5%小牛血清封閉1h0.01MPBS清洗5min×3；

3、加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白 1.00g＋0.01MPBS 100ml)稀釋的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗體，0.01MPBS洗5min×3；

4、加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%過氧化氫）30min，以消除內源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3；

5、加入0.01MPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；

6、加入ABC復合物之類的抗體，室溫孵育2h，0.01MPBS洗5min×3；蒸餾水迅速沖三次；

7、加入顯色液，進行免疫組織化學顯色，時間一般不超過30min，可不時在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速沖三次后加入0.01MKPBS終止反應；

8、梯度酒精脫水之后，封片，拍照。

細節將消除內源性過氧化物酶這一步放在后面，能避免雙氧水對目的蛋白的影響

1）實驗技術大類： 形態學

（2）具體實驗技術名稱： 冰凍切片

（3）實驗對象： 腦組織

（4）簡要實驗步驟

1.經心臟生理鹽水灌注取腦，對半切開，4%多聚甲醛浸泡固定（4℃）2.20％、30％蔗糖/0.1M PB溶液梯度脫水、直至標本在標本瓶中沉底。3.標本在30％蔗糖/0.1 mol/L PB溶液脫水至沉底后取出，濾紙吸干表面水分。4.標本經OCT包埋劑包埋，連續冠狀位切片（5）我的經驗或者心得體會：

1.腦組織相對于其它器官含水量尤其豐富，冰凍切片時冷凍的速度要快，凍結的速度越慢，冰晶形成越多。

2.切片時的溫度很重要，對于一般的組織切片，切頭最適宜的溫度在-22℃左右，但腦組織不宜太低，溫度設置為：切頭溫度-19℃，機身溫度為-21℃。

3.包埋的時候要在冰凍切片機內操作。先預冷切片的底座，然后再將標本放在底座上預冷，由于標本表面含有水分，自然就會與底座粘緊。預冷至標本表面長白霜，所需時間長短不一，1cm3大小的標本，約需5min。

4.包埋時，由下到上，盡量均勻涂抹，不要留空隙，特別是底部，螺旋狀向上盤旋。標本周圍包埋劑的厚度在1-2mm之間，底部3-4mm為宜。

5.OCT包埋劑不能包的太多或太少。太多，切出來的腦組織切片容易卷曲；太少，容易卷曲之外，標本底部的包埋劑過少，會導致固定不穩，標本容易與底座分離 1）實驗技術大類： 形態學

（2）具體實驗技術名稱： 冰凍切片裱片方法（3）實驗對象： 組織切片

（4）簡要實驗步驟

將組織切片標本貼附于載玻片上

我的經驗或者心得體會： 裱片常用有兩種方法：

1.漂浮法。切出來的腦標本先轉移到0.01mol/L的PBS中，然后在裱到載玻片上，此法需要的時間精力太多，標本容易在裱的過程中損壞。如果切片平面太多，則無法一一辨認清楚，更難以按切片的順序連續裱片。

2.直接裱片法。一般的同學切下組織后，直接就拿載玻片往標本上面粘，結果很多都是皺巴巴的，不平整，根本無法進行后面的實驗。我的經驗是先在載玻片上要裱片的部位預先涂上0.01mol/L的PBS，掀起冰凍切片機中壓片的擋板，迅速將沾有PBS的區域直接去貼切下的標本。可以觀察到，切片像是受到一股吸引力一樣，自動貼在載玻片上并且自然展開，遇到有小皺折的地方，可以用小毛筆，蘸少許PBS溶液，涂抹在標本上，由于上下均有一層PBS液，可以自由的移動到你想要調整的切片部位和形態。調整好后，掃掉多余的PBS液，晾干切片備用。

（1）實驗技術大類： 形態學

（2）具體實驗技術名稱： 組織切片封片

（3）實驗對象： 組織切片

（4）簡要實驗步驟

免疫組織化學或者免疫熒光染色后的切片最后的封片

我的經驗或者心得體會：

無論是經脫水透明還是直接干燥的切片，最后都需要用中性樹膠或者甘油封片。在封片時，為了避免組織被顆粒污染，盡量用新的或干凈的棉簽棒/玻璃棒，這樣可以避免將桌上的粉塵帶入到中性樹膠或者甘油中，并最后帶入切片中。另外在封片前盡量不要搖晃封片劑產生小的氣泡。封片時可以將封片劑沿著蓋玻片的邊緣遞成一條線，然后將切片先垂直靠近載波片滴有封片劑的一邊，慢慢傾斜45度左右，可發現載波片與蓋波片慢慢的合在一起，最后輕輕的復位至垂直即可。

1）實驗技術大類： 形態學

（2）具體實驗技術名稱： 冰凍切片保存（3）實驗對象： 腦組織（4）簡要 實驗步驟

1.0.01MPBS及4%多聚甲醛經心灌注取腦，4%多聚甲醛4℃后固定過夜 2.30％蔗糖脫水兩次、直至標本在標本瓶中沉底。3.OCT包埋切片

（5）我的經驗或者心得體會：

1.第一次脫水時可以用30%的蔗糖，當組織沉底后，換第二次30%的蔗糖時，不要丟棄第一次的蔗糖，由于已經有組織內的水進入到蔗糖中去了，所以實際上蔗糖的濃度一定低于30%，可以將這部分糖收集起來作為下次沉糖的第一次脫水用糖，這樣可以減少糖的耗費，對組織沒喲任何影響。

2.為了減少冰晶的存在，在冰凍組織時，可以將經OCT包埋劑包埋好的標本放在一個小的塑料平皿中，倒入事先放置在-80度保存的2 甲基丁烷（不要蔓進組織就行），讓組織速凍，可以減少冰晶，同時也可以保持直接接觸底座的組織底部平整，并減少修組織時的切片浪費。3.為了避免傷害切片機用的刀片，從-80度冰箱取出的組織需要先放置在冰凍切片機中復溫半小時，以避免組織及包埋劑太硬而傷害刀片。

（1）實驗技術大類： 形態學

（2）具體實驗技術名稱： 冰凍超薄切片裱片方法（3）實驗對象： 組織切片

（4）簡要實驗步驟

將超薄的組織冰凍切片標本貼附于載玻片上

我的經驗或者心得體會：

對于沒有confocal的實驗室，要想做出很漂亮的熒光雙標圖片，可以考慮將切片切得非常薄，最薄可以達到6-8微米，當然這也對貼片技術提出了挑戰。

首先組織必須固定好，固定好的組織切成薄片不會散開，而固定不好的組織薄片很快就散開。建議對這種薄片，采取漂浮法來貼片，直接裱片容易不平整。切出的標本放入0.01mol/L的PBS中（注意不要有triton x-100）。陳放的器皿直徑也最好要大一些。切片進入到PBS時要盡量的輕，盡量讓組織薄片漂浮在水面，切不可將組織薄片插入到水面以下，甚至還攪幾下，也就是說盡量得讓組織薄片顯示為展開的狀態而不是折疊得很厲害的狀態。貼片時，小心的用一個頭上是彎勾樣的玻璃棒挑出組織，手要輕，再小心的讓組織漂在不含triton x-100 的0.01mol/L PBS中，盡可能的保持當時在陳放器皿中的狀態，如果組織直接是展開的狀態是最好貼的。如果組織有部分皺褶在上，可以先將沒有皺褶的部分貼在玻片上，調整玻片的方向，利用玻片在提起來時產生的水流來幫助折疊的切片順著水流方向鋪平，當然如果折疊的部分是向下的，則可以在貼片的過程中輕輕的撥動玻片產生小幅度的水流，結合細尖的毛筆來幫助向下折疊的組織與原來接觸組織脫離并隨著水流鋪平。

形態學方法 免疫組織化學

實驗對象：石蠟切片

步驟：

①石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS沖洗3次，每次5 min。②組織抗原修復，修復完自然放置至室溫。

③每張切片加1滴或50 μl過氧化酶阻斷劑(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次5 min。④除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl正常非免疫動物血清(試劑，室溫下孵育10 min。

⑤每張切片加1滴或50 μl 0.1%的Triton X-100破膜，室溫下孵育10 min。

⑥除去血清，每張切片加1滴或50 μl的一抗體(稀釋濃度為1：100)，4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5 min。

⑦除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次5 min。

⑧除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次5 min。

⑨除去PBS液，用PBST溶液漂洗切片3次，每次10 min。

⑩除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1～3 min。?自來水沖洗，蘇木素復染，PBS或自來水沖洗返藍。?梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明。?中性樹膠封固。?數碼相機拍照保存。

一方面有人認為：5）我的竅門或者心得體會：以上我寫的是常規的免疫組化的步驟，但其實我試過在蘇木素復燃，氨水返藍后不用再繁瑣的進行梯度酒精脫水以及二甲苯透明的這些步驟，直接將玻片放在晾片板上自然晾干即可封片拍照觀察，而且效果也很好，因為梯度酒精的作用就是脫水，跟你自然晾干作用一樣；中性樹膠里面本身就有二甲苯，因為在某種程度上可以起到透明的作用。這樣一來，整個免疫組化每次就可以節省一個小時的時間了。大家可以試試看。有人提出了對上一位的看法：對這位兄弟的心得體會有點疑問，理論上來說你的竅門也不是不可行，但我覺得還是不嚴謹，我們做免疫組化脫水透明這些步驟加在一起也就20-30分鐘，所以也不存在節省一個小時的問題。省掉脫水透明的步驟其實不利于片子的長期保存，如果僅僅是做實驗留個照片的話也無所謂了，但如果是在醫院的話也就不行了。晾得時間長了片子不好看，短了水分殘留與二甲苯不相溶，整個片子就模糊了。中性樹膠是用二甲苯溶的是沒錯，但每個實驗室加的量是隨意的，加的少的話透明不徹底，時間長了片子就不能看了。這個我是有教訓的。所以個人覺得還是老老實實脫水透明吧，并不浪費時間，即使多花個幾分鐘那也是有好處的。呵呵，一家之言，歡迎討論。

5）過程中需要注意的事項或技巧：

1.在進行第一步的脫蠟至水，其實最好先進行空白片的烘烤，把空白片放在58度左右的烤箱中進行烘烤，大概4~6小時，這樣有兩個目的：第一，可使玻片上的組織與玻片貼的更緊；第二，可以盡可能的除去玻片上的石蠟，這樣就可減少后續染色過程中的非特異背景染色。

2.過程中的“用PBS沖洗3次，每次5 min”我見過有同學是用那種塑料的免疫組化盒子，然后把玻片放進架子上，用手拿著架子在免疫組化盒中進行不停得上下提拉，以達到充分漂洗的目的，這樣效果會很不錯，但太累人了，每一次都要不停得提拉15分鐘。我的做法是，把放有玻片的架子放進免疫組化盒中后，再把免疫組化盒放在做WESTERN BLOT 的搖床上，調整適當的速度，這樣放在架子上的玻片就會隨著搖床的搖擺而來回搖擺，達到漂洗的目的。3.每次滴加試劑時盡可能的超出標本的邊緣稍許，以防止邊緣沒有液體覆蓋增加非特異染色；另外除去液體，繼續滴加下一種液體時動作一定要快，不然也是會干片，增加非特異染色。4.抗原修復首選高壓修復，效果最好。其次是微波修復。EDTA修復液效果最好，檸檬酸效果其次。

5.第四步中你可以看到，沒有“PBS沖洗3次，每次5 min。”這樣的說明，對了，這一步是達到用非免疫動物血清封閉非特異抗原的目的，如果你沖洗了，則整個實驗就白做了，這一步切忌。6.如果抗原時表達在包膜的，則破膜與否不是太重要；但如果抗原是表達在胞漿的，則最好破膜。7.一抗孵育最好選擇4度過夜，抗原抗體反應比較溫和；

8.DAB染色時間把握，可以采取鏡控。滴完DAB后迅速在顯微鏡下觀察，最佳的時間點是，你要觀察部位的胞漿出現了橙黃色，而其他背景還沒有開始變黃。9.還是不用梯度酒精和二甲苯作用，直接晾干，封片，觀察拍照。也有人認為：這位兄臺說的大部分我都認同。有幾點與你共同討論

1..關于脫水透明的問題，在主題的其他貼里我表達了自己的觀點，這里不累述。關于抗原修復的問題，有點不同看法。抗原修復不存在哪種方法最好，哪種方法其次的問題。每一張抗原都有不同的修復方法，有的高壓修復做出來是陰性，但用胰酶消化就是陽性了。理論上即使兩種抗原修復方法相同，例如都是微波修復，但作用的時間和方式可能也不一定一樣。有點直接煮15分鐘好，有點20分鐘好，有的可能要每次煮5分鐘，稍冷卻再煮5分鐘，重復好幾次。具體的原理我也不是很明白，是實踐經驗的總結。關于破膜與否的問題，免疫組化切片一般就4各微米，細胞都已經被切開了，還用破膜嗎？相反，如果你破膜時間和濃度掌握不好，可能還會造成染色定位不準。該膜陽性的弄成膜和漿都陽性了。如果你認為出現陰性是沒破膜的話，個人感覺還是從其他方面找原因。當然，如果你做的是細胞爬片的免疫組化，那就需要破膜了。

形態學方法

載玻片處理（免疫組化用）實驗對象：載玻片

（一）我們大學多個實驗室用的載玻片處理方法：

1.普通的載玻片（例如： 帆船牌），將其排列在玻片架上，置于熱水中，加洗衣粉，煮沸30分鐘

2.傾去洗衣粉水，自來水沖洗2遍，把洗衣粉沖干凈 3.超聲清洗（65w，10min）4.酸缸內浸泡過夜

5.自酸缸內取出，自來水沖洗 6.超聲清洗（65w，10min）7.雙蒸水沖洗，烘干 8.75%酒精浸泡過夜 9.雙蒸水沖洗，烘干 10.過明膠（3次）

（二）我改良的載玻片處理方法： 1.購買潔凈度高的載玻片（例如：世泰）2.置架排列后，75%酒精中浸泡過夜 3.取出后，雙蒸水洗滌，烘干 4.過明膠（3次）

我的竅門或心得體會：

1.經改良后的步驟簡單快捷，節省大量時間。舊方法最起碼要4天時間，新方法2天就完成了。當處理少量載玻片可能不覺得有多大差異，但如果你主要研究形態學的話，處理幾百張載玻片的時候，就可以體驗到這兩種方法的差別。

2.很多人用多聚賴氨酸處理載玻片，個人覺得還是明膠可靠，很少掉片，比較過自己用多聚賴氨酸處理的載玻片或者是直接從公司購買的多聚賴氨酸處理的載玻片，都有不同程度的掉片現象，做石蠟切片的可能相對還好一些，但是冰凍切片，個人感覺明膠處理的的載玻片明顯優于多聚賴氨酸處理的載玻片。并且，明膠經濟實惠，非常便宜，而多聚賴氨酸很貴；過明膠可以用個大燒杯批量處理，過多聚賴氨酸的時候那可是細活。

（1）實驗技術大類：分子生物學

（2）具體實驗技術名稱：western blot（3）實驗對象：動物心肌組織/細胞蛋白（4）簡要步驟：凝膠配置及蛋白樣品前處理

（5）心得體會：

1．配膠: 該部分較為重要的是配制凝膠時要充分混勻，此外應保證試劑的新鮮。常出現的問題有：A.凝膠出現花紋：此時應檢查原料中過硫酸銨（AP）粉末是否受潮

B.凝膠聚合時間較長：聚合時間由AP以及TEMED決定，通常在30min左右，AP不新鮮會導致聚合變慢：此外還需注意環境的溫度也很重要，氣溫較低時膠是會凝得慢一些，必要時可適當增加AP以及TEMED的量，但通常不會超過1h，若超過1h甚至更長仍未聚合，應檢查配制的操作有無錯誤。

2．處理蛋白樣品：該部分蛋白樣品本身很關鍵，若蛋白提取過程存在問題或蛋白發生降解則很難進行好之后的實驗，也就很難做出好的結果了；除此之外loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時將樣品與loading buffer混合均勻也應注意。詳722926

見

：http://protein.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15722926&sty=1&tpg=1&ppg=1&age=0#15

（1）實驗技術大類： 免疫測定與診斷技術

（2）具體實驗技術名稱： ELISA（3）實驗對象： 腫瘤病人血清標本

（4）簡要步驟:① 包被：用包被緩沖液將MBP/OY-TES-1稀釋至1.0μg/ml，取100μl/孔包被酶標板，4℃濕盒過夜。1×PBS-T洗板3次（室溫靜止30sec/次），甩去液體，用紙吸干； ② 封閉：5%脫脂奶（200μl/孔）37℃封閉30min，1×PBS-T洗板4次，甩去液體，用紙吸干； ③ 上血清：加入待檢稀釋血清（1:400）、陽性對照和空白對照各100μl/孔，37℃濕盒孵育1h，1×PBS-T洗板4次，甩去液體，用紙吸干；

④ 上二抗：加入Biotin-綿羊抗人IgG單克隆抗體（1:1000），37℃濕盒溫育1h，1×PBS-T洗板4次，甩去液體，用紙吸干；

⑤ 上標記物：加入Avidin-HRP（1:1000），37℃濕盒溫育30min，1×PBS-T洗板4次，甩去液體，用紙吸干；

⑥ 顯色：TMB避光顯色15min，加1N H2SO4終止反應； ⑦ 酶標儀OD450與OD630雙波長讀數。

（5）我的竅門或者心得體會：1.我沒用試劑盒做（尚未有商業化試劑盒開發），所以一切數據都要自己計算，包括包被蛋白濃度，一抗濃度，二抗濃度，計算時務必不能出錯，要不就會功虧一簣。

2.用任何試劑前都要把試劑混勻，因為蛋白是很容易沉淀的。3.用固定的幾把移液器，這樣可以盡可能的較少誤差。

4.濕盒孵育前要先把濕盒放在37°進行溫度平衡，這樣可以減少達到平衡的時間，而且也可以避免符合試驗溫度的孵育時間不夠。

5.等板底的水珠揮發以后再讀數，要不會出現負值。

6.實驗時盡量少開口說話（因為大部分做的是蛋白的測定，口水避免不了會使所測蛋白降解的啊，呵呵）

第二篇：課程切片

課程切片

05:00管理類綜合能力測試邏輯推理課程 考察能力理解、分析、綜合 判斷、推理、論證

并不是對于邏輯專業知識的考察，也不是對試題中可能涉及的自然科學、認為科學等方面專業知識的考察

同學們都有拿到教材了，那教材很厚，但是內容很容易，抓住概念理解透了，這部分的目標是不丟分，這是我們的一個理想狀態，分為三個篇幅

基礎篇有概念、判斷、推理、論證

對于概念這部分，有同學問了啥是概念那? 概念就是詞，就是你認識一個對象你需要了解的兩個層次的含義：第一個層次：你要知道所指對象的概念的特征和內涵；第二個層次：你要知道這個對象的范圍。內涵和外延這部分內涵是啥外延是啥都說清楚 二者啥關系同時加入一個生動的例子。15:00概念種類、概念之間的關系

種類包括正概念負概念、單獨概念普遍概念、集合概念非集合概念

正概念負概念是相對來說的，不能死教條的去理解他，比如不好的也可能是正概念，如果讓你說出他的負概念你要知道按照原命題否命題的方式，去理解，單獨概念普遍概念就看是反映一個事物還是反映的兩個以上的事物，這里重點講解下集合概念和非集合概念，從定義上就能夠區分這兩個概念，二者區分標準就是這兩個概念是否為一個不可分割的集合體，能分割就是非集合概念，不能分割就是集合概念，其實用常識就很容易理解，集合你就想象是密不可分的集體當然不能夠去分割他，分割的化就是意思會發生變化，這里講解幾道習題 年輕人積極向上，這里年輕人這個概念反映的對象是集合還是非集合，我們就在年輕人前面加入每一個三個字，加入之后每一個年輕人都應該積極向上，意思并沒有發生變化，那么這里年輕人的概念就是非集合概念，那如果我說人民，只有人民才是創造歷史的真正動力，這里如果在人民前面加上每一個之后，人民作為整體才能夠發揮創造歷史的作用，但是人民前面加上每一個之后，每一個人民是能夠創造歷史的動力，這樣的說法顯然是不對的，所以我們掌握這個加入每一個這仨字的方法就能夠成功的區分集合概念和非集合概念。這里我們講過了概念相關的一些知識點，那這里重點給大家介紹一下之后我們考試中可能經常會考到的一些容易犯的邏輯錯我，那我們剛說的這個內涵和外延來說，兩個概念如果相等必須要內涵和外延都相等才能夠兩個概念是一致的，那么有這樣一個例子，說某些學校缺乏體育鍛煉方面的經費，學生缺乏體育鍛煉，某些領導說，沒有關系，學生上課做做操就行，還要什么體育鍛煉，在家里做家務也是鍛煉。這里犯了一個什么邏輯錯誤呢，我們來看同樣是鍛煉，體育鍛煉和在家里做家務鍛煉，字面意思是一樣的，可是鍛煉前面的限定條件不同，這就使得兩種鍛煉的內涵是不同的，體育鍛煉內涵是通過體育運動使得身體強壯，培養同學勇敢、機智和團隊合作等方面的品德和精神，而在家干活也是鍛煉則是混淆了體育鍛煉和在家里做家務，犯了偷換概念的錯誤，這里，要想判斷是否出現偷換概念的邏輯錯誤，主要考察字面相同的兩個概念在不同的語境中所反映對象的外延是否發生變化，如果你列出項下子元素二者出現不同，那么這里就是混淆了兩種概念。

20:00關于概念之間的關系我們在學習的時候要配合歐拉圖，學一種關系我們就按照把符合這種關系的歐拉圖畫出來，這樣我們之后在做題的時候就可以幫助我們做題，那么概念之間的關系有同一關系、交叉關系、包含關系、矛盾關系、反對關系。首先我們來看，啥是同一關系，兩個或者多個關系之間外延相同，具有同一關系的概念就叫同一概念，比如我們小時候可能媽媽爸爸可能會給起小名，上學的時候有可能被人起外號，那我們說的小名外號，這些反映的對象都是指的我們自己對吧，所以這里小名啊 外號啊就是同一概念，這里面還是，容易出現的邏輯謬誤就是不當同一替代，就像我們知道魯迅 原名周樹人，有同學說老師他不浙江人嗎，我們需要有點文學常識好吧，那有的人可能不知道不知道魯迅原名周樹人，知道狂人日記是魯迅寫的，那說周樹人寫了狂人日記可能不知道，再來舉一個例子，巴金就是李堯棠，那我們都知道巴金是作家，但很少有人知道李堯棠是作家，這個時候就出現了一個什么問題呢，就是出現邏輯上的描述不一致，那怎么解釋這個問題呢，所有人都知道巴金是作家，但是很少有人知道李堯棠是作家，那巴金和李堯棠是同一概念，有些人存在二者認識的差異，只知其一，那么就很好的解釋了這種描述不一致的問題。

那接下來包含關系很容易理解了，比如碩士研究生，和研究生，研究生還有博士研究生，所以這里，研究生的概念外延更大一些，包含著碩士研究生，而碩士研究生包含于研究生。交叉關系，意思就是二者存在交集，我們講的以上三種關系都是屬于相容關系。接下來要講的矛盾關系和反對關系。這兩個我們不僅要講啥事矛盾關系啥事反對關系，還會給大家對這兩種概念進行區分，兩個概念他們互相排斥，但他們加起來又等于一個整體，反對關系呢說的是兩個概念他們是排斥的，但是加到一起呢有是屬于一個整體，但是整體出來這兩個概念有會存在其他的，就是說整體排除了這兩個概念之后不是空集。所以總結一句話就是矛盾概念兩個概念的外延和等于屬概念的外延，而反對關系兩個概念的外延和小于屬概念的外延，這里容易出現什么樣的邏輯謬誤呢，就是非黑即白的錯誤，就是本來是反對關系但是當成矛盾關系處理。

30:00這里有一個習題需要給大家講一下，教材翻到39頁這里習題九，講的是除非像機動車一樣，你闖了紅燈給你開罰單，否則對于騎行者來說禁止闖紅燈這項交通法規是沒意義的，為什么呢，這里說了他的論證過程，因為一項交通法規要想有意義必須要能夠有效的制止他所禁止的行為，而對于騎行者來說，經常闖紅燈的你不開罰單的話你這項交通法規是無意義的，那對于遵守交通法規的人來說，你又不需要，所以材料中下了結論，禁止騎自行車闖紅燈是沒意義的，這里面出現了什么樣的邏輯漏洞呢，我們來看，這段材料有一個特殊句式，就是除非什么什么否則什么什么，那我們怎么把他換一種更好理解的說法呢，就是如果不像給機動車一樣開罰單的話，那么禁止闖紅燈的交通法規對于騎自行車的人來說是無意義的，分析這段材料我們揪出他所涉及的對象，有闖紅燈的有機動車的，那之后論述的時候出現了經常闖紅燈的，以及遵守交通法規禁止闖紅燈這項要求的不闖紅燈的，我們一分析，戲更多的是騎行者這一塊，那我們就來分析一下，騎行者，他在交通系統中可能出現幾種情況，經常闖紅燈的，以及偶爾闖紅燈的，還有不闖紅燈的，那論證中對于經常闖紅燈的他說你不開罰單是交通法規是無意義的，而遵守的你不需要，然后他下定義交通法規是無意義，他論證的缺陷在哪，就是對于可能出現偶爾闖紅燈的人，沒有做出判斷，而交通法規禁止闖紅燈的意義有可能就是針對這部分人的。35:0我們講了矛盾關系講了反對關系，我們來總結一下二者區別，你就記住矛盾關系非真即假，而反對關系呢有可能同真同假，也可能一真一假，那集合來說，矛盾關系是屬于A集合那一定不屬于B集合，而反對關系是屬于A集合一定不屬于B集合，而不屬于A集合，就不一定屬于B集合，從肯定否定上來說呢，矛盾關系肯定A就一定否定B，反對關系是肯定比否定，否定不一定。進入下一個知識點 定義

定義說的是對概念內涵進行界定的邏輯方式，包含著被定義項、定義項、定義聯項。我們回憶一下學習生涯學過很多定義，有沒有全部還給老師，商品的定義、自然數的定義等等，那我們對于商品是怎么進行定義的呢，商品是用來交換的勞動產品，這里商品是被定義項，勞動產品是定義項，而是這里是定義聯項，這里有一個需要非常注意的地方是定義項和被定義項一定要外延相等，否則容易出現什么問題呢，就是定義過窄或是過寬的問題，比如說剛剛的商品的定義，商品是用來交換的勞動產品，這里了我如果給用來交換前面加個限定詞，商品是用貨幣來交換的勞動產品，此時定義項的外延范圍縮小了，那這個就不能稱之為定義了，我們分析一下商品是用貨幣來交換的勞動產品，我們說在貨幣產生之前我們還有物物交換呢，那物物交換的話商品就不是商品了嗎，所以定義項外延縮小就不能稱之為定義，再給大家舉個例子商品是勞動產品，這類我們把用來交換的限定詞去掉了，此時是否定義成立呢，商品確實是勞動產品，但是勞動產品如果不是用來交換的話也不能稱之為商品，這個就是犯了什么錯誤呢就是定義過寬的錯誤，那除了我們剛剛給大家講的定義過寬和定義過窄的問題，還會出現同語反復和語序重復的問題，這兩種情況就是，舉個例子有人問你學什么的，啊 我是學區域經濟學的，那給我介紹哦一下，區域經濟學就是研究區域內的經濟學，這里就是出現了定義項包含被定義項，那我們是不是沒有說清楚概念的內涵，我有解釋清楚這個區域經濟學是啥嗎，沒有，什么樣的是對這個區域經濟學概念正規的解釋呢，比如說范圍是區域空間，通過研究比較不同區域空間經濟發展差異，經濟發展問題，來進行一定的區域經濟發展政策的研究，那定義項包含被定義項就是犯了同語反復的毛病，下一個語序重復呢就有點像是繞口令了，問什么是戰爭，……

還有容易出現在這個知識點這的邏輯錯誤是定義中不能出現負概念，以及比喻，這個都是很容易發現，接下來我們來看幾道習題

進入下一個知識點劃分，劃分是針對某一概念對他外延進行揭示，他所列出的項下子元素，既不能多出也不能少，什么意思呢，說讓你羅列出直系親屬都包括哪些，父母子女愛人，兄弟，姐妹，這里兄弟姐妹愛人都不是直系親屬，所以不能作為直系親屬列出……

劃分還有的常見的邏輯謬誤是其所劃分出的子項不能相容，就像人分為男人、女人、壞人、好人，那壞人好人中都有男有女，這里就是犯了子項相容的問題，同樣是這個例子，還犯了標準不統一的問題，劃分標準混淆，是按照性別啊 還是按照人的品質啊，最后是容易出現的問題是越級劃分，所列子項一定要是同一級別，

第三篇：“板書設計”教學切片

畫龍要點睛

——“板書設計”切片分析

濮陽縣第二中學 王桂玲 一節課，要上得精彩，高效，必須經過教師的精心設計，如果把一節精心設計的課比作畫成的一條龍，那么，板書，無疑是教學設計點睛的那一筆。那什么是板書呢？

板書是教學設計的一個重要組成部分，顧名思義，簡言之，就是教師在黑板上的書寫內容。我在這里，跟大家從兩個方面來進行解讀。從動態的角度理解，它是教師上課時在黑板上書寫的文字、符號以傳遞教學信息、教書育人的一種言語活動方式。從靜態的角度理解，它是教師在教學過程中，為幫助學生理解掌握知識，而利用黑板以凝練、簡潔的文字、符號、圖表等呈現的教學信息的總稱。這其中，學生也是可以參與板書的，其實，我們也鼓勵學生參與。

由板書的概念可以得知，板書的內容主要包括三點，一是本節課的教學內容的內在邏輯結構；再就是教學的重點和難點；另外還有教學內容的補充知識。

根據學生年齡的特點以及不同學科的特點，業內人員，通常把板書劃分成六類。提綱式板書，線索式板書，詞語式板書，分析綜合式板書，圖畫式板書。思維導圖式板書。

各種類型的板書都有有所側重，要結合學生的特點和教材內容的需要進行安排，比如低學段的文科板書要盡量采取圖畫式的，引起孩子的興趣，高學段的理科板書設計，盡量低要采用具有邏輯性強的板書設計。

這里，我要對思維導圖式板書多做些交流。這類板書在我國是近幾年比較流行的，我在教學過程中運用最多的就是這種板書，既美觀又具有比較強的邏輯性，最主要的是著這一過程中，吧對知識的學習變成了學生積 極參與的做事性學習。學生根據所學內容，結合自己的想法，能夠在老師的帶動下繪制創造性的思維導圖，對學生知識的梳理，系統化，網絡化大有幫助，而且能夠培養學生的發散思維。

總之，板書設計要有利于知識傳授，有利于學生智力開發、能力培養，有利于學生情操陶冶，有利于活躍課堂氣氛，有利于學生記憶知識。

但是，實際教學中，教師對板書設計的重視程度怎樣呢，情況并不理想。通常有以下幾種情況。

一部分教師，特別是剛入職的青年教師，沒有認識到板書的意義和價值，對板書沒有設計，講到哪里寫到哪里，講完了，寫完了，滿滿的一大板，橫的豎的，亂七八糟，看不出條理，看不出重點。甚至于一版寫不完，就唰唰唰擦掉，粉筆末四濺，再接著寫。隨意性很強，布局不合理，重點不突出不醒目，起不到板書應起的作用。

另一部分教師，板書是經過設計了，可是字體不美觀，書寫潦草，沒有規范意識，忘記了自己的角色，老師的示范作用，身教的教育作用要大于言傳，老師是學生模仿的對象，不理想的板書，對學生影響也不好。

最后一部分教師，可能是因為書寫基本功不太理想，根本不板書。另外，現在老師上課時基本上都用到課件，干脆就制作在課件上，一展示就行了，倒是便捷。但是筆者認為，這樣一來，板書教育的附加值，就會消失殆盡。

可見，課件板書設計并沒有真正引起執教教師的重視。大多數老師只是在公開課的時候才會用心設計板書，我多么希望板書設計成為教師課堂教學的常態化，落實到每一節課堂教學中。這也是今天我對做客教師出色的板書設計特別關注的原因之一。

今天，楊慶春老師這節課的板書設計激發了我莫大的興趣。板書最后形成了一部書的圖形，一頁是課題“背影”，另一頁是對父愛的定性評價： 2 關懷備至，體貼入微，真摯深切。書脊上書寫的是“父愛”。父親就是一本書，一本厚厚的書，父愛是書的內容，這愛，是關懷備至的，是體貼入微的，是真摯深切的，二這些，都凝聚在父親肥胖，佝僂的背影里。板書的這個創意，生動形象，直觀地再現了文本的主旨，不愧為課堂的點睛之筆。這使我想起了曾在百度上看到的《秋天的懷念》的板書設計，板書整體有兩個紅色的心交疊組成，疊合的部分寫著“愛“字，兩邊分別寫著愧疚、懷念和堅強、無私，不言而喻，這分別是母親和兒子的兩顆心。了了幾個關鍵詞，點出了文本的主旨。由此看來，這兩個板書設計有著異曲同工之妙。我又在網上搜集了大量獲獎的板書設計，如下圖：

.這些優秀的板書設計都具備了一些共性特點：

1.板書簡潔扼要，語言凝練，只板書核心詞，言簡而義豐

2.板書圖文結合，完備美觀，給人以美的享受，能激發審美體驗。3.板書有啟發性。邏輯性強，留下思維的空間。

結合楊老師的課例，我建議，板書完全形成之后，教師要把板書設計的意圖，用優美精煉的語言表述出來，有助于學生進一步理解教師的設計意圖，進一步深刻理解文本的核心內容。給整個一節課畫上一個圓滿的句 號。另外，板書和學習進度要保持同步。

因此，我們可以進一步提出，優秀板書設計要遵循的基本原則與操作要求：

（一）科學性原則。板書設計，是發端于文本，源自于學者，形成于黑板的，是課堂教學中很重要的一環。板書“要反映教材特點，突出教材重點，揭示教學內容的難點和關鍵。

（二）美觀性原則

板書設計還要合符審美的原則，圖文結合，激發學生的審美意識。

（三）實用性原則

板書設計，不論是教材內容，還是技法，都要字字露旨，從實用有效著眼。

（四）生成性原則

板書設計是一個動態生成的過程，板書構思，要契合教學程序，根據課堂的生成，及時調整，展現出一幅動態的教學流程，也是文本精髓的不斷生成。

總之，板書師教學設計中不可或缺的一部分，對一節課起到畫龍點睛的作用，也是大型的正規的教學競賽中重要的一部分內容，說課，微課等形式中，都對板書設計有所要求。作為任課教師一定要重視。

參考文獻：百度文庫 百度百科

2016-10-17 4

第四篇：組織切片技術

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 組織切片技術注意事項

程序步驟

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蠟切片：流水沖洗組織塊>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蠟2h>>包埋

冰凍切片：固定后的組織>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的組織>>轉入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>貼片>>干燥（37度過夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸餾水3min>>蘇木精染色30s—5min>>自來水涮洗>>蒸餾水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊紅染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性樹膠封片

6、免疫組化（ABC法）

（1）干燥后的石蠟或冰凍切片（冰凍切片需要緩慢復溫）脫蠟至水；

（2）雙氧水（1%濃度左右）封閉內源性過氧化物酶；

（3）PBS洗滌3×5min；

（4）5%BSA封閉非特異性結合位點，不洗；

（5）滴加適當稀釋度的一抗；4度孵育過夜或37度2h；（6）同上洗滌；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗滌；滴加ABC復合物，37度1h；（8）洗滌5遍，每次5min；

（9）配制顯色液（DAB顯色試劑盒），顯微鏡下觀察顯色；（10）切片浸泡于蒸餾水中終止顯色；（11）蘇木精復染，脫水，封片。

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

注意事項

取材

1.組織越新鮮越好，最好于動物處死后10~20min完成取材，時間過久后組織自溶和腐敗會影響組織形態。

2.取材組織塊不宜過大，一般為5nm以下，2~3nm為宜。如果試驗要求采取大塊組織，最好采樣前注射固定液預固定或采取灌流固定（比如取腦時需灌流固定）。

3.取材使動作輕柔，避免用力夾、捏和拉扯組織，盡可能保持組織原有形態。操作時可用鑷子夾取組織的一個邊角，避免主要組織損傷。

4.如果是大批量取材，取材時沒有時間對組織塊大小進行修正，可將組織（可稍大，但不宜過大）先放在固定液中固定，2~4h后進行修塊，即用鋒利的刀片（刮胡刀片）把組織切至適宜大小。注意不能用剪刀等進行鈍性分離。5.如果對不同處理或不同動物的組織進行比較研究，應對所有動物在同一解剖學位置取材（比如十二指腸距胃3cm處，或空腸距胃10cm處）。

6.取材時注意組織的不同斷面，可將組織的一面用刀片切平作為標示，以便包埋和切片時選取的斷面正確（比如肌肉組織，應區分好橫斷面和縱斷面）。7.一般情況下宰殺動物應放血干凈，取材時除去組織周圍的附屬物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的組織立即固定。冰凍切片組織可先固定后凍存，也可直接凍存，直接凍存一般采取液氮中速凍，然后轉入-20度保存，凍存組織應避免反復凍融，且盡快進行切片或用OCT包埋（包埋后可放置較長時間）。未包埋的組織在-20度長期保存的組織會逐漸脫水（比如肌肉），影響形態學觀察。

9.理論上免疫組化的組織采取冰凍切片，一般運用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋凍存。但對于抗原表達量大且較易檢測的免疫組化，可以采取石蠟切片，但固定時間不能過長，控制在1周以內，長時間固定會引起抗原表位的醛基化和抗原表位構象變化，導致免疫組化檢測靈敏度降低。

固定與包埋

1.選擇合適的固定液，原則是在良好固定組織并保持形態的前提下盡可能的減小對組織的影響。常用固定液為福爾馬林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后兩者最為常用，效果也較好。

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鮮配制，新配的固定液固定效果較好。3.固定液體積理論上應為組織體積的20倍以上。

4.一般組織理論固定時間為4~24h，即以固定液完全滲透進入組織的最短時間為宜，實際操作中可延長至數天，但一般控制在1周以內。

5.如果是冰凍切片，固定后的組織最好及時用OCT包埋，能更好的維持組織形態，包埋后的組織可于-20度保存數月。固定后的組織可用蔗糖溶液脫水，方法為直接將組織置于30%蔗糖溶液中，每天換新鮮蔗糖溶液，2-3天組織在蔗糖中沉底即可。一般來說，先固定，然后脫水，再用OCT包埋效果比較理想。6.冰凍切片可以采取后固定的方法。即采得的組織經液氮速凍后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰凍切片后用丙酮等對切片上的組織進行固定。但丙酮固定較為強烈，容易發生掉片。

7.石蠟切片時，固定后的組織包埋前一般對組織進行洗滌，通常用自來水沖洗，洗掉組織中的固定液，因為殘留在組織中的固定液可能對染色產生影響。洗滌為可選步驟，我們實驗室通常不洗滌，將固定后的組織直接包埋，并不影響HE染色效果。

8.二甲苯透明時間是影響包埋效果的最關鍵因素，需根據組織種類、組織大小、室溫以及二甲苯的新舊程度綜合考量，必要的時候需要設置時間梯度進行摸索。此外，組織是否脫水完全、是否浸蠟完全也直接影響包埋效果，原則上在能夠完全脫水和浸蠟的前提下，組織在各溶劑中的浸泡時間越短越好。

切片

1.切片成功與否很大程度上取決于組織固定和包埋的好壞。

2.切片厚度：HE等組織學染色一般4~5微米（4微米差不多是石蠟切片的極限），如果切片困難，可適當增加切片厚度（20微米以內越厚越好切），但切片厚度的增加會使得細胞層數增多，影響觀察和美觀。免疫組化中石蠟切片一般切片5~10微米，冰凍切片大約8~14微米，特別是在檢測表達量較少的抗原時，較厚的切片可以增加陽性物質的出現概率。

3.較好的石蠟切片呈均勻連續狀，沒有空洞和破損，組織完整不碎裂。4.切片角度和刀片新舊程度對切片效果的影響較大，切片角度視切片機型號而異；新刀片容易切出完好的切片。刀片應從一段開始使用，發現刀痕時逐漸移動，以最大限度使用刀片。

5.冰凍切片的主要影響因素有：切片機箱體溫度（一般為-25度左右），防卷器位置（太往前切不動，太往后起不到防卷效果）。

6.對免疫組化切片而言，需對玻片進行包被（一般為使其帶正電荷，組織帶負

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 電荷，通過靜電吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太淺起不到粘附效果，包被太深會導致免疫組化非特異性染色。

展片和貼片（撈片）：

1.燒杯中裝蒸餾水，置于水浴鍋中，溫度一般40~45度，溫度太低片子展不開，溫度太高石蠟會融化。

2.冰凍切片不需要展片，直接將玻片輕靠在組織上，組織便會自動吸附到玻片上。

3.撈片時選取完全展平的片子撈起，寧缺毋濫。一張玻片上可以貼多個組織，最后選染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被過的玻片可重復使用，包被過的玻片貼片后組織很難掉下，不可重復使用。

干燥：

1.干燥可以讓組織貼的更結實。石蠟切片37度干燥過夜，或者45~60度干燥數小時。冰凍切片室溫晾干（夏天一般5~10min），但不可涼太干，太干也容易掉片，判定標準為組織表面沒有明顯的液體為宜，如果組織變白說明干燥時間過長。

2.干燥后的石蠟切片可放切片盒中室溫保存，如果天氣炎熱可以放置4度保存；冰凍切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期內試驗可以放4度保存。

染色（以HE染色為例）：

1.液體置換要徹底，特別是脫蠟和脫水步驟。

2.伊紅一般用醇溶性配方，蘇木精配方有很多種，如果用氧化汞方法配制使用前要過濾，因為液體表面容易聚集一層金屬離子薄膜，對染色產生影響。3.新鮮配制的伊紅染色時間1秒即可，存放時間長的染液可以適當增加染色時間。

4.封片時中性樹膠的量要適度。根據組織的大小選擇大小合適的蓋玻片，蓋玻片以能覆蓋住組織為前提，越小越好，太大的蓋玻片溶液不平整，顯微鏡觀察時組織可能不在一個平面，需要反復調整焦距。

5.蘇木精和伊紅染色時，最好摸索染色時間，以尋求最合適和漂亮的顏色搭配，不同的組織染色能力有所差異，比如淋巴組織內淋巴細胞較多，細胞核比較大，染出來可能藍色居多，肌肉組織中肌顯微和細胞質比例高，染出來紅色

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 居多。

6.總體原則是染色寧愿偏淺不要偏深，偏深的染色難以判別細胞形態和結構。

免疫組化注意事項：

1.免疫組化一般以冰凍切片為主，但石蠟切片也可以做免疫組化。

2.冰凍切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰凍包埋）。3.免疫組化步驟繁瑣，時間較長，因此用包被過的切片來防止掉片。常用的包埋劑有APES，多聚賴氨酸和明膠等。包被過程相對簡單，可購公司的商品包被試劑盒，按照說明書操作。

4.石蠟切片的免疫組化有時需要抗原修復。原因：固定液會對組織的抗原性產生影響，示抗原表位發生構象變化，可以通過化學處理和熱處理來還原組織的抗原性。常用的修復液為枸櫞酸鈉緩沖液，一般采取熱修復，即把切片放置在緩沖液中然后加熱至沸騰。

5.免疫組化切片厚度一般為8~12微米。6.選擇合適的抗體（單抗、多抗）。

7.預實驗確定合適的H2O2、封閉液和抗體作用濃度和時間。8.選用包被過的玻片，動作輕柔，防止掉片。9.設置陽性、陰性和空白對照。

10.顯微鏡下控制顯色，放置顯色過淺或過深。

11.復染時蘇木精濃度可稀釋，時間縮短，避免染色過深。

12.遇到問題逐項排除，尋找原因。詳細的問題解決和相關技術貼可參照丁香園論壇或生物秀論壇，搜素“免疫組化”可以找到相關資料。

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，邊加入邊加熱攪拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促進粉末溶解，完全溶解后HCl調PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 飽和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混勻。

染液

伊紅染液：1%醇溶性伊紅配方為1g伊紅加入到100ml 80%酒精中，溶解。

蘇木精染液：

1.哈里新（Harris）蘇木紫液：甲液：蘇木紫Ig，無水乙醇10ml。乙液：硫酸鋁鉀（或銨）20g，蒸餾水200ml，加溫溶解。甲、乙二液分別溶解后混合，加熱煮佛，沸后去火，待溶液不翻騰時即加入氧化汞0.5g（此時有大量氣泡生成，故容器宜大，以免液體溢出）。然后染液迅速冷卻，冷卻后過濾，即可位應用。用時每100ml加冰醋酸4ml；

2.邁爾（Mayer）蘇木紫液：將蘇木柴0.1g放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜，即可應用。染色時間約10~20min；

3.歐立區（Ehrlich）蘇木紫：將蘇木紫2g溶于無水乙醇100ml中；將硫酸鋁鉀15g溶于蒸餾水100ml中，加入甘油100ml，將二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混勻后，盛于無色小口瓶內，暴露于日光下，使其自然成熟，約需3個月。染色時間約5~20min。此液貯存愈久，染色力愈強。若在其中加入碘酸鈉300mg，使人工成熟，配成后即可應用；

4.卡拉茲（Carrazzi）蘇木紫：將蘇木紫0.5g溶解于甘油100ml中，將硫酸鋁鉀25g溶解于蒸餾水350ml中溶解后將二液慢慢混合，并充分搖勻。將碘化鉀0.1g放于蒸餾水50ml中，加微溫溶解，然后加入蘇木紫液中，充分搖勻，翌日可用。

南京農大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

免疫組化

0.3%~1%雙氧水：

商品化30%雙氧水溶甲醇稀釋到適當濃度。

1~5%BSA（羊血清、脫脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混勻。

第五篇：組織切片必看

1.組織的取材

取材時要注意及時快速固定，避免剪刀鑷子損傷組織，組織要取全。全盤考慮進行病理切片的組織類型，病變可能累及的部位，組織包埋需要的剖面。2.組織的固定

在組織病理學中，不管是組織切片乃至電鏡還是大體標本的保存，都必須進行及時的適當的和有效的固定。組織只有經過固定，才能完成隨后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

固定的作用：從組織學的角度其簡單的定義是，保持細胞、組織的固有形態和結構，使之盡量保持細胞、組織的固有形態和結構，而從免疫組化技術的角度，固定的作用不僅是使細胞內蛋白質凝固，盡量減少或終止外源性酶和內源性酶的反應；防止細胞的自溶，以免使抗原擴散至組織間質；以保持組織的固有形態和結構；更重要的是保持組織或細胞的抗原性，不但要使抗原不導致失活，而且不使抗原發生彌散的現象，才能在免疫組化染色時，不產生過深的背景，影響對陽性物的判斷。

固定的目的

①能防止細菌的腐蝕和組織的自溶。細菌無處不存在，它們隨時都可污染腐蝕未經處理的組織。固定液可以固定任何蛋白質，凡有生命的東西，都由蛋白質組成，蛋白質被固定，生命就停止，細菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人們常可碰到這樣的問題，一塊肉不經處理放了幾天后就會變質，這是為什么呢？除了細菌參與外，其本身也是很重要的。因為組織離體后，供應這此組織的血液隨之消失，細胞缺氧，細胞內溶酶體膜的結構受到破壞，破壞后釋放出溶酶體酶，日常生活中常碰到的肉變質，就是細菌污染加組織自溶的結果。

②保存細胞固有的物質，能凝固或沉淀細胞內或組織液，糖元等，使細胞或組織基本上保持與生活時的物質一樣。細胞的固有物質，即細胞核、內質網、線粒體、高爾基器、溶酶體、過氧體，細胞骨架，組織液，抗原、糖元等。這些物質，如果不將其及時固定，是很容易喪失的，尤其是溶酶體，很容易受到破壞，因此應特別小心。

③使組織硬化，便于切塊。剛離體的組織，除了胃組織以外，都是柔軟的組織，尤其是胃腸道的組織，如果在沒有固定時就取材，效果就很差，不是取材不規整，就是厚薄不均，粘膜和肌層很容易分開，因此，要取得規整標致的材料，就必須將組織徹底固定，再行取材。

④對某些具有傳染性的標本，能防止疾病的擴散。病理標本、種類繁多，成份復雜，各種病例都有，具有傳染性的病種也不少，如結核、肝炎、麻風、性病等等。對于此類標本，應進行徹底的固定后，再行取材，如結核球，固定時間應在3-5天。

⑤可增強染色的作用。組織經過及時的固定，最終可見到切片有鮮艷的染色，而些時如果有一批未經及時固定的組織，將看到最終的結果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得結論，固定可以增強染色的作用。

固定的注意事項：

①組織固定越新鮮越好。組織一經離體，就能及時地固定，這是最好的。根據實驗，如果要獲得某些酶的染色，固定最好在組織離體后30秒至1分鐘。對于其它達不到些要求是越快越好。原則上動物死亡后半個小時內取完并及時固定組織。

②組織固定，組織塊不宜過大。凡是需要固定的組織，都不應該太大太厚，這是因為所有的固定液穿透力不夠強，浸透度不夠快的緣故。如果較大厚的組織，不經處理就進行固定，那么待固定液進入至中間對可能這些組織早就發生自溶了。因此，對于較大的組織，必須先進行處理，切成制片材料再行固定，這是最佳的處理方法，如遇到胃腸的器官，則應將其剪開，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因這類組織、粘膜和肌層容易分開，沒固定時，難以取得最佳制片材料，對于產酶類的器官如肝、腎、脾等，更要處理好，否則更容易出現自溶現象。

③對不同類型的組織應適當合理地選擇固定液。固定劑的種類繁多，成份復雜，對組織的作用不盡相同。在我們的日常工作科研中，對于組織的固定，應有針對性的選擇，方能獲得滿意的效果。對于腎，睪丸等泌尿系統和新生仔鼠應選擇Bouin氏固定液。免疫組化可以選擇多聚甲醛和中性緩沖甲醛；我病理室一般選擇中性緩沖甲醛，它可以兼顧常規染色和免疫組織化學。

④組織固定，時間不宜太短，也不宜太長。固定時間應根據取材大小、性質以及類型有關，視具體情況而定；時間太短，就不能很多的固定組織，因為不管組織大小，固定液浸入組織之中，都需要有一定的時間，時間太短，就會影響組織固定的效果，對以后一系列關系的處理都有影響，切片質量難以保證，固定時間太長，也不好。組織長時間的固定，福爾馬林會產生一種酸，影響核的染色。對于固定很長時間的陳列性標本制片后切片染色不鮮艷，顯得非常陳舊。另外，長時間的固定往往會出現福爾馬林色素，尤其是造血器官的標本，更應注意。固定時間過長，可降低抗原的活性。一般小鼠組織固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足夠與否決定著組織固定的成敗。一般固定液和組織體積比為10：1~20：1之間。

⑥特殊病例或特殊物質應選擇特殊的固定液。一般的病例標本，如沒特殊的要求，都可以應用甲醛配成的各種固定液來固定。但是，如果要顯示狂犬病毒的包含體時，應用上述的的固定液就不行了，必須采用丙酮來固定，顯示糖元，可選擇無水酒精或丙酮來固定組織。

3.常規石蠟切片制片過程

組織經系列酒精的脫水，經透明劑的作用，經熔化的石蠟的浸漬，包埋后所切成的切片稱為石蠟切片。制片過程的每一步每一環節處理不好都會影響切片質量。

組織脫水：

把含于組織內或細胞內的水份用脫水劑把其置換出來的過程稱組織脫水。不管是正常的組織，還是有病變的組織，都含有不同程度量的水分。據測定，人體的物質組成約含水55~67%，蛋白質15~18%，脂類10~15%，無機鹽3~4%及糖類1~2%[14]。如果不把這些水分脫去，石蠟切片將無法進行，因為石蠟和水不能混合在一起，所以除去組織中的水分成為制片中的關鍵，至今為止，國內常用的都是酒精。因它不管在什么樣比例的情況下都能和水混合，所以它可以慢慢地將水從組織中置換出來。酒精脫水力強，對組織又有硬化和易脆的不良影響。在使用時，通常是從低濃度至高濃度，濃度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，組織經過這一系列處理后，基本可達到脫水的目的。

每一步的組織脫水都需要控制好脫水時間，一般根據組織塊大小和組織類型而定。短了脫水不干凈，長了會使組織切片時易脆。組織的透明：

組織脫水后，要經過一個浸蠟前的中間溶劑透明過程；才能進行浸蠟。透明的目的：組織經脫水后、浸蠟前必須經過某些既能與脫水劑相混合又能溶解石蠟的中間溶劑處理。組織在中間溶劑時，組織間隙內存留的脫水劑完全為中間溶劑所取代時，組織就呈現透明狀態，此時即可進行浸蠟。透明液多采用二甲苯，組織經無水乙醇脫水后轉入二甲苯透明，組織的大小、厚薄不同，透明時間也不同。透明時間短了，透明不完全，導致切不了片，透明時間長了，透明過度，導致切片易粉易碎。組織浸蠟：

用于浸蠟的石蠟最好是熔點稍低（56～58℃），低溫浸蠟對保存組織細胞內的抗原免疫活性，避免組織收縮和變硬變脆有幫助，以盡量清除二甲苯蠟滲透到組織中起支撐作用，切片時才能把完整的組織和蠟一起完整切下來。不同大小和厚薄的組織浸蠟時間有所不同，一般為1～3小時。浸蠟溫度過高，浸蠟時間過長或不夠均可導致組織收縮，變硬變脆，難以切出理想切片。組織包埋：

組織經浸蠟后即可進行包埋。包埋時，包埋石蠟的溫度要比組織高（約3~5℃），否則包埋冷凝后組織與包埋石蠟分離，特別是在冷天包埋時，動作更要迅速，否則容易導致組織與石蠟融合不好，影響切片。包埋時把組織最大最平切面或所需的病灶切面向下，對皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應包含有各層組織。組織包埋要選擇所需要的組織切面。組織切片：

組織切片厚薄要適宜，薄的切片細胞不會重疊，易于觀察。切片的厚度應為3～4μ，組織蠟塊過硬，切片刀或蠟塊沒固定好，會出現跳刀、切片成一截厚一截薄的現象。優質的組織切片要求切片較薄，平整，無刀痕，皺褶。切片太厚或呈波浪狀厚薄不勻。貼片烤片：

烤片時間短，會造成染色時切片從載玻片上脫落或脫蠟不凈，染的切片會著色淺、不上色或灰染；烤片時間長，會造成對組織的損傷。染色：

染色染色的程度包括脫蠟、浸水、染色、分化、促藍、脫水、透明等過程。切片經過脫蠟至水，HE染色后，要徹底脫水透明，才能用中性樹膠封蓋。如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下觀察模糊不清，且容易褪色。要求組織結構清晰，色彩鮮艷，細胞核/細胞質對比分明。

組織病理切片質量的影響因素

2009-08-19 編輯： 【打印】 【關閉】