第一篇：微生物實驗

微生物區(qū)系分析方法

分別在茯茶“發(fā)花”不同階段取樣，采用稀釋涂布平板法，對樣品中的微生物進行分離、純化和計數(shù)。

1.1 分離培養(yǎng)基

細菌分離：

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂20g、蒸餾水lO00mL。將上述成分溶解定容，調(diào)pH7.2～7.4，分裝，12l℃滅菌20min。倒平板前按50μg/ml的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放線菌酮（起抑制霉菌的作用）。酵母菌分離: 采用YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml、pH自然，113℃滅菌30min。霉菌分離：

采用PDA培養(yǎng)基：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000mL煮沸半個小時，紗布過濾，定容至1000mL，添加20g葡萄糖和17-20g瓊脂并定容至1000mL，121℃滅菌20min。等降溫至55℃左右時，加入氨芐青霉素（或鏈霉素）50μg/ml(真菌分離計數(shù)時用以抑制細菌的生長)。或者加入氯霉素或慶大霉素滅菌之前加入。放線菌分離：

采用高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g、氯化鈉0.5g、硝酸鉀lg、磷酸氫二鉀 0.5g、硫酸鎂0.5g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂18～20g、蒸餾水1000ml、pH7.2～7.4，121℃滅菌20min。可在盛無菌水的三角瓶中加10滴100g/l的石炭酸（苯酚）溶液和50μg/ml的制霉菌素以抑制細菌和霉菌的生長。

察氏培養(yǎng)基(1L)：葡萄糖30g；MgSO4·7H2O 0.5g；NaNO3 3.0g；KCl 0.5g；FeSO4·7H2O 0.01g；K2HPO4 1.0g；瓊脂20g(觀察霉菌形態(tài)用)，如要分離用需要滅菌后加30U/mL鏈霉素)。

其他鑒定用培養(yǎng)基成分及配方參照周德慶《微生物學實驗手冊》 1.2 計數(shù)方法

計數(shù)方法參照GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》的測定方法 1.3 取樣：每隔2天取一次樣，每個樣至少做1次重復，總共取7次樣，為了減少誤差，盡量取同一批樣。盡量保證茯磚茶中微生物種類和數(shù)量不發(fā)生較大變化，樣品取回后立即進行微生物分離計數(shù)。在取樣時要測定發(fā)花環(huán)境（烘房）里的溫度、濕度，取回樣品后，要測定茶樣的含水量和pH值。其余不做微生物分析的茶樣應立即放在-20℃的冰箱里低溫保存。

pH值的測定：準確稱取2.00g茶樣，加50ml蒸餾水，置于150ml三角瓶中，在振蕩器上振蕩浸提20分鐘，過濾，濾液置于100毫升燒杯中，然后用通過標準pH溶液校正后的Backman電子酸度計，測定浸提液的pH值，每個試樣重復兩次。

1.4 分離、純化茯磚茶中的微生物

菌種分離：以無菌操作分別稱取試樣25克，投入盛有玻璃珠及225ml滅菌生理鹽水的500ml三角瓶內(nèi)，振蕩20min，用無菌移液管吸取1ml菌懸液，加到9ml的無菌水中，然后依次制成10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8等7個濃度梯度的菌懸液，用無菌移液管吸取1ml緩緩注入平板培養(yǎng)基內(nèi), 稀釋涂布平板培養(yǎng)微生物, 密封置于28 ℃條件下培養(yǎng), 4～5 d 后菌落長滿整個平板。

菌種純化：根據(jù)初分菌落的形態(tài)特征, 用接種針挑取各菌落的少量菌絲體, 接種在事先準備好的PDA 瓊脂培養(yǎng)基上(每平板內(nèi)接種3個菌落),進行劃線平板培養(yǎng)，菌絲體生長1周后, 根據(jù)長出的各菌落特點進行篩選和純化, 如此反復, 直至菌落的生長狀態(tài)和形態(tài)特征均表現(xiàn)一致時視為單一菌種的菌落。

1.5 鑒定微生物的種類

借助菌落結構和顯微鏡觀察初步判斷微生物的種類，如要進一步鑒定，可通過微生物的生理生化反應和分子生物學深入鑒定。微生物的分類檢索鑒定方法

2.1 細菌鑒定

細菌鑒定參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)、《一般細菌常用鑒定方法》、《常用細菌鑒定手冊》作形態(tài)觀察和相關的生理生化試驗。(1)形態(tài)觀察：

個體形態(tài)觀察：在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、大小；

菌落形態(tài)觀察：觀察菌落形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度及培養(yǎng)基的顏色等。，(2)染色：革蘭氏染色法、芽孢染色法等。(3)生理生化及生態(tài)特征鑒定；

過氧化氫酶的測定、氧化酶的測定、好氧性測定、糖或醇類發(fā)酵試驗、葡萄糖酸鹽的氧化試驗、V.P試驗(乙酰甲基甲醇試驗)、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、硝酸鹽還原試驗、產(chǎn)生吲哚試驗、H2S產(chǎn)生試驗、石蕊牛奶試驗、酪氨酸水解試驗、精氨酸利用實驗、檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用試驗、pH生長試驗、生長溫度的測定以及耐鹽性試驗等。2.2 酵母菌鑒定

酵母菌鑒定參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》和《微生物學實驗手冊》對分離得到的酵母菌進行形態(tài)觀察和相關的生理生化試驗。(1)形態(tài)觀察：

個體形態(tài)觀察：無絲營養(yǎng)細胞的顯微鏡觀察、擲孢子的形成和形態(tài)觀察、子囊孢子的顯微鏡觀察。菌落形態(tài)觀察。

（2）染色：美蘭染色法。

（3）生理生化及生態(tài)特征鑒定：碳源同化試驗、氮源同化試驗、糖類發(fā)酵試驗、產(chǎn)生類淀粉化合物的測定、在60﹪(w/w)葡萄糖-酵母膏中生長測試、在37℃下做生長溫度的測定、脲酶試驗等。2.3 霉菌鑒定

參照《真菌的形態(tài)與分類》和《真菌鑒定手冊》等相關文獻，做相關的生理生化試驗和形態(tài)觀察。形態(tài)觀察包括：

（1）菌落形態(tài)觀察：顏色、大小、表明特征、質(zhì)地等。（2）個體形態(tài)觀察：菌絲、子實體、孢子的形態(tài)等。2.3 放線菌鑒定

參照《放線菌鑒定手冊》等相關文獻，做相關的生理生化試驗和形態(tài)觀察。參考文獻

[1]（美）杰伊(James M．Jay)．現(xiàn)代食品微生物學(第五版)[M]．北京：中國輕工業(yè)出版社，2001：178-155 [2]

賈英民主編．食品微生物學[M]．北京：中國輕工業(yè)出版社，200l：346，364 [3] 周德慶．微生物學實驗手冊[M]。上海：上海科學技術出版社，1986，12 [4] 中華人民共和國國家標準GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗驗菌落總數(shù)測定》 [5] 布坎南等．伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)[M]。北京：科學出版社，1984，12 [6] 中國科學院微生物研究所細菌分類組．一般細菌常用鑒定方法[M]．北京：科學出舨社，1978 [7] 東秀珠，蔡妙英。《常用細菌鑒定手冊》。北京；科學出版社，2001 [8](英)J．A．巴尼特等．酵母菌的特征與鑒定手冊[M]．青島：青島海洋大學出版社，1992 [9] 戴芳瀾．真菌的形態(tài)和分類[M]．北京：科學出版社，1987，3 [10] 魏景超．真菌鑒定手冊[M]．上海：上海科學技術出版社，1979 [11] 閻遜初．放線菌的分類和鑒定[M]．北京：科學出版社，1992

第二篇：微生物,真菌實驗（范文模版）

青 島 農(nóng) 業(yè) 大 學

獸醫(yī)微生物學課程論文

題 目：姓 名：學 院：專 業(yè)：班 級：學 號：指導教師：

病原真菌的分離鑒定

動物科技學院 動物醫(yī)學

2014年月 13 日

病原真菌的分離鑒定

動醫(yī)1205

李春成20121450 摘要：制作固體培養(yǎng)基，將A、B、D三種真菌接種到培養(yǎng)基和蓋玻片上進行3-5d的培養(yǎng)（溫度為28℃，觀察真菌在固體培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)，在顯微鏡下觀察小培養(yǎng)中的真菌形態(tài)，用美藍染色液染酵母菌，進一步觀察其形態(tài)。關鍵詞：真菌；分離；形態(tài)；接種 引言：

真菌在自然界分布廣、數(shù)量大、種類多。有些真菌可引起人和畜禽疾病，有些霉菌還產(chǎn)生毒素，直接或間接的危害人類和動物健康。了解真菌的培養(yǎng)方法，認識其形態(tài)十分重要。

真菌中的酵母菌是單細胞微生物，細胞核和細胞質(zhì)有明顯的分化，個體直徑比真菌大10倍左右，多為圓形或卵圓形。酵母菌無性繁殖主要是出芽生殖，在特殊的情況下能形成假菌絲，有性繁殖是通過結合產(chǎn)生子囊孢子。用美藍染色液制成水浸片，不僅可以觀察其外形，還可以區(qū)分死活細胞。

霉菌的營養(yǎng)體是分支的絲狀體，分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲又分化出繁殖菌絲，不同霉菌的繁殖菌絲可以形成不同的孢子。

霉菌的菌絲較大，細胞易收縮變形，且孢子容易飛散，所以指標本是常用乳酸石炭酸棉藍染色液。此染色液制成霉菌標本片的特點是：細胞不變形，具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長的時間，溶液本身呈藍色，有一定的染色效果。

利用培養(yǎng)在玻璃紙上的霉菌作為觀察材料，可以得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)。

制作霉菌封閉標本，一般用石炭酸棉染色液封片，其中含有甘油，不易干燥，石炭酸有防腐作用，棉藍有一定的染色作用，便于觀察。1材料和方法 1.1材料

待鑒定的三種真菌A、B、D

1.1.1培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基 1.1.2儀器

懸液、載玻片、蓋玻片、無菌培養(yǎng)皿、濕盒，1mL無菌注射器、生理鹽水、酒精燈等 1.2方法

1.2.1劃線分離：將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌冷卻后，取待測的真菌，按照細菌的平板劃線分離法進行平板劃線，即用接種環(huán)從待測培養(yǎng)基上蘸取菌種在平板上劃1/5-1/4，劃畢灼燒滅菌接種環(huán)，待冷卻后，于第二段處再做劃線，且從第一段處引線，劃畢，灼燒滅菌接種環(huán)。冷卻后，于第三段再做劃線，且從第二段處引線，劃畢，灼燒滅菌接種環(huán)。冷卻后，于第四段再做劃線，且從第三段處引線，劃畢，灼燒滅菌接種環(huán)。

1.2.2小培養(yǎng)：用注射器吸取液體培養(yǎng)基于載玻片上，將接種環(huán)在火焰下滅菌，挑取待檢菌放于液體培養(yǎng)基上，待液體培養(yǎng)基將要凝固，但仍有部分呈液體狀時，蓋上蓋玻片，標記好菌種。

1.2.3酵母菌水浸片的制備：先取干凈的載玻片滴上生理鹽水1-2滴，將接種環(huán)在火焰下滅菌，挑取酵母菌少許，均勻涂在液滴中，再將美藍染色液滴于載玻片上，染色2-3min后加蓋玻片。（注意切勿產(chǎn)生氣泡）然后低倍鏡和高倍鏡觀察其細胞形態(tài)、芽殖方式。2.結果與分析 2.1觀察三個培養(yǎng)基：A菌在固體培養(yǎng)基上菌落呈油脂狀，表面光滑、濕潤、粘稠，顏色呈黃色。B菌在固體培養(yǎng)基上菌落為氈狀，顏色是綠色，具有典型的放射狀皺紋。D菌在固體培養(yǎng)基上菌落密集，最初呈白色，孢子呈黑色。

2.2實驗現(xiàn)象

2.2.1小培養(yǎng)形態(tài)鑒定現(xiàn)象

前三圖均在40X下觀察）

A菌體呈圓形、卵形或橢圓形，內(nèi)有細胞核、液泡和顆粒體物質(zhì)。光鏡下可見細胞質(zhì)所在范圍及細胞壁的影子，高倍鏡中可現(xiàn)細胞核。B菌菌絲呈無色，有分隔，其分生孢子梗經(jīng)過多次分支，產(chǎn)生幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，稱為掃帚體。D菌菌絲無隔，有匍匐菌絲和假根，假根著生處有直立向上孢子囊梗，其頂端彭大成孢子囊，孢子囊底部有半球形囊軸。

2.2.2美蘭染色現(xiàn)象

顯微鏡下看到的是單細胞, 不形成菌落的真菌，無色細胞為活酵母菌細胞，藍色細胞為已死的酵母菌細胞。

3.討論

本次試驗做的還可以，試驗結果都能看到，現(xiàn)象比較明顯，不過，顯微鏡聚焦不是很好，看的不是很清楚，現(xiàn)象也不太明顯，在做小培養(yǎng)時充分發(fā)揮了團隊合作精神，使得試驗做的很快（因為做小培養(yǎng)時，液體培養(yǎng)基溫度不那么高了，凝固時間很快），做美蘭染色時，也很注意沒有弄進氣泡，不影響觀察。4.結果

經(jīng)以上試驗可得出，A為酵母菌；B為青霉菌；D為根霉菌。

4.參考文獻

獸醫(yī)微生物實驗教程

胡貴學

2006

第三篇：微生物實驗教案

《微生物學》實驗教學教案[實驗項目] 實驗一 微生物學試驗常用玻璃儀器洗滌及干熱滅菌 [教學時數(shù)]

3學時 [實驗目的與要求]

1．認識微生物實驗所需要的各種器皿，了解常用工具和儀器的名稱、用途。2．掌握對玻璃器皿的清洗、包扎方法與干熱滅菌的操作過程。[實驗原理]

微生物學實驗要求較高的無菌狀態(tài)，因此，實驗所用的器皿，大多數(shù)要進行消毒、滅菌從而用以培養(yǎng)微生物，所以對其質(zhì)量、規(guī)格、洗滌和包扎方法均有一定要求。

清潔的玻璃器皿是實驗得到正確結果的先決條件，包扎方法要能保證防止污染雜菌。

干熱滅菌的原理，空的玻璃器皿一般用干熱滅菌。干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160～170℃），時間要長（1～2h），但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。[實驗材料與設備]

1．培養(yǎng)皿、大試管、三角瓶6只、燒杯（500ml）2只、燒杯（1000ml）1只、小試管6只、吸管（0.2ml 2支，0.5ml 2支，1ml 2支，5ml 2支）共8支。2．去污粉、肥皂、清洗劑、毛刷。3．棉花、扎繩、包扎紙。[實驗步驟]

（一）學習下列常用儀器的種類、規(guī)格和應用范圍 1.培養(yǎng)皿

由一底一蓋組成一套，常用的培養(yǎng)皿皿底直徑90 mm，高15mm,皿底皿蓋均為玻璃制成。制成平板，可用于分離、純化、鑒定菌種、活菌計數(shù)以及測定抗生素、噬菌體的效價等。2.試管

(1)大試管(約18mm×180mm): 可裝倒平板用的培養(yǎng)基，可作制備斜面用（需要大量菌體時用），裝液體培養(yǎng)基用于微生物的振蕩培養(yǎng)。

(2)中試管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 裝液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌或做斜面用，用于細菌、霉菌、病毒等的稀釋和血清學試驗。

(3)小試管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖發(fā)酵或血清學試驗，和其它需要節(jié)省材料的試驗。3.三角瓶 規(guī)格有100mL、250mL、500mL和1000 mL用來裝無菌水、培養(yǎng)基和振蕩培養(yǎng)微生物等。4.燒杯

規(guī)格有50mL、100mL、250mL、500mL和1000mL 用來配制培養(yǎng)基與各種溶液等。5.吸管 規(guī)格有0.1mL、1mL、2mL、5mL、10mL用來量取轉(zhuǎn)移各種溶液等。6.量筒 規(guī)格有50mL、100mL、250mL、500mL。

（二）學習玻璃器皿的洗滌方法 1.新玻璃器皿的洗滌

在2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時，用自來水沖洗干凈。2.舊玻璃器皿的洗滌

（1）試管、培養(yǎng)皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自來水沖洗 A 裝有固體培養(yǎng)基：刮掉，洗滌

B 帶菌的器皿：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時或煮沸0.5小時，然后洗滌 C 帶病原菌培養(yǎng)物的器皿：先高壓蒸汽滅菌，倒去培養(yǎng)物（2）玻璃吸管：吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，反復沖洗

A 吸過血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自來水的容器中浸泡，實驗后集中沖洗。B 塞有棉花的吸管：用水將棉花沖出，然后沖洗

C 吸過含有微生物培養(yǎng)物的吸管：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時然后洗 D 吸管內(nèi)壁有油垢：洗滌液中浸泡數(shù)小時，再沖洗

(三)學習各種器皿的包扎

1.培養(yǎng)皿的包扎：牛皮紙或舊報紙包緊，一般以5～8套培養(yǎng)皿包成1包 2.吸管的包扎：

在上端約0.5cm處，塞入一小段1.5 cm長的棉花（勿用脫脂棉），目的是避免將外界或嘴中雜菌吹入管內(nèi)，或不慎將菌液吸出管外。用4～5 cm寬的長紙條卷起來3.試管和三角瓶等的包扎：用橡皮塞和牛皮紙。(四)干熱滅菌 1．裝入待滅菌物品

將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、吸管等）放入電烘箱內(nèi)，關好箱門。物品不要擺太擠，以免妨礙空氣流通；不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。

2．升溫 接通電源，撥動開關，打開電烘箱排氣孔，讓溫度逐漸上升。當溫度升至100℃時，關閉排氣孔。3．恒溫 當溫度升達到160～170℃時，恒溫調(diào)節(jié)器會自動控制調(diào)節(jié)溫度，保持此溫度2h。干熱火菌過程。嚴防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。

4．降溫 切斷電源、自然降溫。

5．開箱取物 待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃以下后，打開箱門，取出滅菌物品。[指導與訓練方案]

1.通過本次實驗你認識了微生物學實驗常用的哪些器皿？ 2.簡述玻璃器皿洗滌的基本要求。3.簡述干熱滅菌的操作步驟。[實驗項目]

實驗二 培養(yǎng)基的制備與滅菌 [教學時數(shù)]

4學時[實驗目的與要求]1．了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2．了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。[實驗原理]

培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實驗目的不同，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制 方法。

從培養(yǎng)基的組成成分可分為: 1.合成培養(yǎng)基：由各種純化學物質(zhì)按一定比例配制而成。

2.半合成培養(yǎng)基：一部分純化學物質(zhì)和一部分天然物質(zhì)配制而成。3.天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成。

從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為: 1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。2.固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀

態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。3.半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2—0.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基。察氏一號培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的霉菌培養(yǎng)基。

高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達到殺死微生物的效果。當蒸汽壓達到1.055kg/cm2時，鍋內(nèi)溫度可達到121℃，一般維持20min,即可殺死一切微生物的營養(yǎng)體或芽孢，而達到滅菌目的。[實驗材料與設備]

1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。2.試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂 [實驗步驟] 1.稱量→溶化→調(diào)pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查 2.干熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開箱取物

3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查 4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌 關鍵步驟及注意事項1.要嚴格按配方配制。2.調(diào)pH不要過頭。

3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70oC以下放物、取物。4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。

5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。[指導與訓練方案]

1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的? 2.在配制培養(yǎng)基的操作過程中應注意些什么問題?為什么? 3.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應具備哪些條件?為什么? 4.培養(yǎng)基的配制原則是什么? [實驗項目]

實驗三 環(huán)境和人體微生物的檢測及無菌操作技術[教學時數(shù)]3學時 [實驗目的與要求]

1.通過檢測環(huán)境和人體中微生物的存在，體會微生物分布的廣泛性。

2.學習無菌操作的技術，掌握利用稀釋涂布平板法從土壤中分離微生物的方法。[實驗原理] 自然環(huán)境中和人及動物的體表、體內(nèi)都存在大量的微生物，它們一遇到適合的條件就會大量繁殖。當把取自不同來源的含菌樣品接種于含有生長發(fā)育需要的各種營養(yǎng)成分的固體培養(yǎng)基時，就會形成肉眼可見的微生物集體群落-菌落。每種微生物菌落都有其獨有的特點，如大小、顏色、表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑、邊緣整齊或不整齊等。因此，可以通過平板培養(yǎng)來檢測不同環(huán)境下微生物的數(shù)量、種類和特點。[實驗材料與設備] 1.恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、移液槍

2.培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、察氏一號培養(yǎng)基；地面以下5-10cm的土壤； 3.酒精燈、無菌棉棒、無菌生理鹽水、涂布棒、記號筆、培養(yǎng)皿、吸管、試管、三角瓶 [實驗步驟] 1.無菌操作技術 在酒精燈火焰旁操作，將融化并冷卻至不燙手的滅菌固體培養(yǎng)基倒入無菌的培養(yǎng)皿，倒量為容積的1/3~1/2或者覆蓋皿底5毫米左右，然后平放到桌面待其凝固即為無菌平板。

2.土樣的稀釋分離

制備土樣懸濁液：稱取土樣1g，迅速倒入盛有99ml無菌水和玻璃球的三角瓶中，置入磁力棒，攪拌10-15min，使土樣充分打散，即成10-2的土壤懸濁液。稀釋：用無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL，放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液，如此重復，可依次制成10-3～10-6的稀釋液。(注意：操作時每一個稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。)3.環(huán)境及人體各部位取菌樣 4.標記、培養(yǎng)

標記： A-Ⅰ-1-10-5姓名

按培養(yǎng)基類別：細菌培養(yǎng)基--A，霉菌培養(yǎng)基--B 按3個大組：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、按4個中組：1-4 按樣品類別：10-

5、10-

6、口腔--a、鼻腔--b、頭發(fā)--c、空氣--d按個人標記：姓名

培養(yǎng)：將接種的平板分別放入細菌和霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。霉菌保持25-27℃，3-5天；細菌35-37℃，1-2天。

[指導與訓練方案]

1、無菌倒平板時注意的事項有哪些？

2、平板接種后為什么要倒置培養(yǎng)？

3、通過本次試驗你學到了什么？有什么體會？ [實驗項目]

實驗六 細菌的單染色與革蘭氏染色 [教學時數(shù)] 3學時

[實驗目的與要求]

1.學習對細菌的涂片、染色和無菌操作技術。

2.了解染色原理、學習并掌握單染色和革蘭氏染色技術。[實驗原理] 細菌的細胞小而透明，在普通的光學顯微鏡下不易識別，染色后，菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結構。

微生物學中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。染色部位分芽孢、鞭毛、莢膜染色

其機理主要是由于兩類細菌的細胞壁成分和結構不同。G+菌，肽聚糖多，脂質(zhì)少，酒精不易進入； G-菌，肽聚糖少，脂質(zhì)多，酒精易進入 [實驗材料與設備] 1.菌種：E.coli（大腸桿菌）、B.subtilis（枯草芽孢桿菌）、玉米細菌等

2.試劑：石炭酸復紅染色液、革蘭氏染色液(草酸銨結晶紫、碘液、95%乙醇、沙黃染色液）3.其他：顯微鏡、載玻片、生理鹽水、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、擦鏡紙等 [實驗步驟]

一、單染色法： 滴無菌水→ 涂片→自然干燥→ 固定→染色→水洗→干燥→鏡檢（高倍鏡、油鏡）

二、革蘭氏（Gram）染色法

1.涂片

2.初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1-1.5分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面14.脫色：除去殘水后，滴加

95%酒精進行脫色約

分鐘，后水洗。

秒，后立即用流水沖洗。

5.復染：滴加番紅染色液，染1-1.5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.鏡檢：觀察染色結果并繪圖。[指導與訓練方案]

1.革蘭氏染色過程中大腸桿菌、枯草桿菌、玉米細菌、金黃葡萄球菌等分別被染成什么色，分別為革蘭氏反應的什么菌 ？

2.涂片用的玻璃片為什么不得有油污？為什么涂片要求菌膜要均勻、薄？ 3.革蘭氏染色的原理 4.染色注意事項有哪些？ [實驗項目]

實驗七 微生物的顯微鏡計數(shù)、大小測量和酵母菌的死活鑒別 [教學時數(shù)] 5學時

[實驗目的與要求]

1.學習并掌握利用顯微鏡直接計數(shù)的基本方法。2.了解并掌握酵母菌的死活鑒別染色的原理和技術 [實驗原理] 1.兩種常用計數(shù)方法，即直接計數(shù)法（血球計數(shù)板計數(shù)法）和間接計數(shù)法（平板菌落計數(shù)法）。本實驗是利用血球計數(shù)板進行直接計數(shù)。

2.利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下進行計數(shù)，由于計數(shù)室的容積是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。3.美蘭（氧化型呈藍色，還原型呈無色），活的酵母菌具有將氧化型美蘭還原成還原型的能力，故染色后是透明的，而死的酵母菌則被染成了藍色。

計數(shù)方法：計數(shù)時，通常數(shù)五個（或四個）中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。設被選作計數(shù)的中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個）如果是16個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/4×16×104×B=40000A·B（個）[實驗材料與設備] 酵母菌懸液（市售的干酵母粉）血球計數(shù)板、蓋玻片、吸水紙顯微鏡、接種環(huán)、分類計數(shù)器 0.1%的美藍染色液 [實驗步驟] 1 制備菌懸液、染色 用吸管吸取菌懸液（1滴）加入試管，用生理鹽水（8滴）進行稀釋，滴加（1滴）美蘭染色液。加菌懸液樣品 將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用毛細滴管將搖勻的菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，用吸水紙吸去多余水液（注意一定不要有溢出和產(chǎn)生氣泡）。3 顯微鏡計數(shù) 加樣后靜止1 min，先用低倍鏡然后換成高倍鏡，計數(shù)時，對位于線上酵母菌，一般只數(shù)上方和左邊線上的，當酵母菌芽體達到母細胞大小的二分之一時，可記作兩個細胞。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。清洗血球計數(shù)板 計數(shù)完畢，將計數(shù)板在水龍頭下沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用電吹風吹干。5.計算 ：利用相應公式進行計算（見前面公式或者課本公式），并將實驗結果填入作業(yè)中的表格內(nèi)。實驗注意事項

1.要正確使用顯微鏡，光線亮度要調(diào)的合適。

2.菌液制備要精準，稀釋倍數(shù)要合適。如果濃度過大就再稀釋，如果過小再重做。3.計上不計下，計左不計右。出芽計一半

4.濃度稀釋標準：以每小方格內(nèi)含有5-10個酵母細胞為宜，一般稀釋10倍即可。5.計數(shù)室內(nèi)一定不要有溢出和產(chǎn)生氣泡。

6.其他微生物孢子技術與酵母菌類似，基本操作一樣。7.確保血球計數(shù)板清洗干凈。[指導與訓練方案] 1.使用血球計數(shù)板計數(shù)時，應注意什么？ 2.將計數(shù)結果填入表格中。

3.簡單說明酵母菌死活染色的原理。[實驗項目]

實驗八 微生物細胞大小的測定 [教學時數(shù)] 3學時

[實驗目的與要求]

1.了解測微尺的構造和使用，學習并掌握測定微生物細胞大小的方法。[實驗原理] 微生物細胞的大小的測量是在顯微鏡下用目鏡測微尺來進行的，但由于測量的是放大后的圖像，故目鏡測微尺在不同放大倍率下每格實際代表的長度也隨之變化，因此，需用物鏡測微尺來校正在不同放大倍率下目鏡測微尺每格所代表的實際長度。

物鏡測微尺是中央刻有精確刻度的載玻片，一般是將1 mm等分為100格，每格長0．01mm，即10 um，它不直接用于測量細胞大小，而是用于校正目鏡測微尺的每格的相對長度。

[實驗材料與設備] 酵母菌懸液（市售的干酵母粉）或者制作的霉菌裝片

目鏡測微尺，物鏡測微尺、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸水紙、0.1%的美藍染色液 [實驗步驟]（—）裝目鏡測微尺

（二）校正目鏡測微尺

1.將物鏡測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上

2.先用低倍鏡觀察，將目鏡測微尺刻度與物鏡測微尺的刻度平行。使兩尺的第一條刻度線相重合，再尋找兩尺的另 10 一條重合的刻度線，分別記錄兩重合線之間物鏡測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)，由公式計算出目鏡測微尺每格所代表的長度。

3.用同樣的方法換成高倍鏡進行校正，記錄并計算在每種倍率下目鏡測微尺每一格所代表的長度。

（三）酵母細胞大小的測定

制備菌懸液、染色： 用吸管吸取菌懸液（1滴）加入試管，用生理鹽水（8滴）進行稀釋，滴加（1滴）美蘭染色液。

制片： 用吸管吸取1滴上述菌懸液滴加到干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片（注意一定不要有溢出和產(chǎn)生氣泡），將多余菌液用吸水紙吸干。

顯微鏡下觀察、測量：在不同倍率下測量菌體的長度和寬度，記錄測定值，并計算出酵母的長、寬值。[指導與訓練方案] 1.為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正? 2.如何校正目鏡測微尺？ ３．如何測定細菌的大小？

[實驗項目1]實驗1 常用玻璃儀器包扎及干熱滅菌；培養(yǎng)基的制備（口述）與高壓蒸汽滅菌（操作-必做）1.1 培養(yǎng)皿、試管、吸管的洗滌包扎及干熱滅菌（操作-必做）1.2 培養(yǎng)基分裝到三角瓶和試管與高壓蒸汽滅菌（操作）[實驗項目2 實驗2 無菌操作技術，倒平板和接種（操作-必做）1.倒平板，以清水代替；試管接試管；試管接培養(yǎng)皿 [實驗項目3] 實驗3 細菌的革蘭氏染色（操作-必做）1.枯草桿菌 [實驗項目4] 實驗4 微生物的顯微鏡計數(shù)（操作-必做）

酵母菌[實驗項目5]實驗5 微生物細胞大小的測定（操作）會校正和測量酵母菌或真菌菌絲

第四篇：微生物實驗總結

微生物實驗總結

姓名:趙葉鋒班級：食品科學113學號：2011013522

大三的第二學期塊結束了，這個學期操作了四個微生物實驗，以及一個自主設計性實驗。通過前階段對四個實驗的操作和認知的基礎上，展開第五個實驗的自主設計。實驗分別是菌落總數(shù)測定，霉菌和酵母的檢查和計數(shù)，乳酸菌的檢驗，微生物藥敏試驗以及探討環(huán)境因素對微生物生長的影響。

這學期的微生物實驗是在上學期微生物實驗的基礎上的累積和擴展延伸：以培養(yǎng)基的制備與滅菌，玻璃器皿的洗滌、包扎和滅菌，微生物接種技術和細菌的革蘭氏染色為技術基礎進行的，以加強學生基礎理論知識和基本技能的培養(yǎng)為目的。

下面我來談談我在實驗中的心得體會。

第一個實驗是菌落總數(shù)測定。讓我重新認識了一下這個名詞：菌落形成單位，我現(xiàn)在的理解就是：1ml或者1g待測樣品中菌落的個數(shù)，一定要注意的是單位是CFU/ml或CFU/g。還有就是要掌握好對高壓蒸汽滅菌鍋的操作。實驗之前要充分做好預習工作，以便實驗的進行。由于是測定微生物實驗，就要尤其小心其他雜菌的混入影響實驗結果。因此要做好實驗儀器和各種試劑的滅菌，有培養(yǎng)皿，試管，移液槍頭（裝在盒子中），按要求配置好的瓊脂培養(yǎng)基和生理鹽水，按各自要求用紗布和報紙包扎好，送入高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌。玻璃儀器在包扎前要進行清洗，并烘干，以免水分沾濕報紙。滅完菌后取出物品進入超凈工作臺，超近工作臺的紫外燈在進入20分鐘前開啟，并在進入時關閉，以免影響人體。要對臺面進行消毒處理，用酒精擦拭。可以在等待瓊脂培養(yǎng)基冷卻到50攝氏度左右前對待測樣品進行10倍系列稀釋至需要的濃度。要注意的是一定要標記好濃度或者按順序排列在試管架上以免弄混，同一個試管里吸取樣品才能用同一個槍頭進行移液。再進行平板接種。待瓊脂培養(yǎng)基冷卻好后，用右手打開紗布并將錐形瓶拿住，將瓶口靠近酒精燈再進行滅菌，左手拿培養(yǎng)皿用大拇指和食指稍微打開培養(yǎng)皿蓋，將瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中心內(nèi)，不用倒很多，使瓊脂培養(yǎng)基沒過培養(yǎng)皿表面即可。培養(yǎng)皿一定是平拿在手上的，倒好后輕輕蓋上培養(yǎng)皿蓋，緩慢地平方在超凈工作臺臺面邊緣處，再推至中間。再用移液槍取1ml樣品快速打入培養(yǎng)皿中央，蓋上培養(yǎng)皿蓋，然后用手輕輕搖晃，千外不要太大力。然后貼上標簽記號，靜置。如此依次操作下去。靜置一段時間待培養(yǎng)基凝固后倒置放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時間再取出進行觀察計數(shù)。

我們組的實驗結果不甚理想，培養(yǎng)皿中的微生物都是連成一片的，或者是培養(yǎng)皿壁上也都長著，主要是由于待測樣品打入培養(yǎng)皿后，搖晃不均勻或者太大力了，以至于菌液沒分散開來或是跑到培養(yǎng)皿壁上去了。

第五個實驗是自主設計實驗環(huán)境因素對微生物生長的影響。選取3個環(huán)境因素物理、化學和生物因素均可進行設計。根據(jù)前四個實驗的基礎，通過小組探討和交流設計出實驗方案。并加以驗證。通過自主設計實驗可以結合小組的智慧，加強團隊協(xié)作精神和創(chuàng)新思維，通過實驗可以驗證理論，增加感性認識，培養(yǎng)獨立工作能力和思考能力，并使具有過硬的專業(yè)技術水平。

通過這次的實驗，我明白了任何事情丟不是一蹴而就的，而是一個慢慢積累的過程。雖然實驗結果不是很理想，但是我參與了過程，通過小組討論我們也分析了失敗的原因，找到了解決的方法，避免了下一次失誤。并且從中理解了團隊討論和合作的重要性。以上即是我的全部感想。

第五篇：微生物實驗心得體會

微生物實驗心得

姓名：關琦琦

學號：09070401048 班級：生物科學09-2班

指導老師：吾爾恩 微生物實驗心得

本學期已臨近尾聲，我們即將告別微生物實驗這門課程，在這一學期，八個微生物實驗中，我們學到了許多知識，這些知識將會陪伴我們一生，下面我們就來通過一些實驗來回顧一下本學期的微生物實驗。

我選取的實驗是《環(huán)境因素對微生物的影響》，之所以選擇這則實驗是因為這則實驗比較簡單，而且涉及面非常多。首先我們來分析一下這則實驗所涉及到的知識面。環(huán)境對微生物生長影響主要分以下幾種

溫度：通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結構與功能以及細胞結構入細胞膜的流動性及完整性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。微生物群體生長、繁殖最快的溫度為其最適生長溫度。

PH: H+影響菌體細胞質(zhì)膜上電荷性質(zhì)，微生物吸收物質(zhì)變化，影響代謝，高濃度H+或引起菌體表而蛋白質(zhì)和核酸水解以及影響酶和活性.滲透壓：微生物在等滲溶液中可正常生長繁殖；在高滲溶液中細胞失水，生長受到抑制；在低滲溶液中，細胞吸水膨脹，因為大多數(shù)微生物具有較為堅韌的細胞壁，細胞一般不會裂解，可以正常生長，但低滲溶液中溶質(zhì)含量低，在某些情況下也會影響微生物的生長。

抗生素：在自然界中普遍存在微生物間的拮抗作用，許多微生物可以產(chǎn)生抗生素，能選擇性的抑制或殺死其他微生物。

微生物的實驗其實簡單來說步驟幾乎相同：制作培養(yǎng)基、倒平板、接種微生物、培養(yǎng)、觀察菌種生長情況從而得出結論。本次實驗也是這樣首先制作培養(yǎng)基，在進行倒平板步驟時，對平板環(huán)境進行區(qū)分，然后進行接種。

在進行倒平板的時候，要注意在無菌條件下進行倒置，同時也要保持平板的厚度均勻。

在進行菌種接種的時候，選擇合適的劃線方式，一般是選擇Z字形劃線法，注意不要把平板弄破，等到平板凝固后才可以進行接種。接種時也要注意在無菌條件下接種。經(jīng)過培養(yǎng)后，再觀察最后得出結論。

通過一學期的實驗，我越發(fā)的明白實驗操作對于結果的重要性。實的基礎。實驗操作可以說是實驗成 功與否的關鍵部分，可是馬虎不得。對于需要團隊合作的實驗，個人 認為要有強勢的人員搭檔，不說是精通實驗操作規(guī)程，最少也得知道實驗的基本操作，掌握要做實驗的操作方法，這對于后續(xù)的實驗無疑 是與決定性作用的。對于個人的實驗能力，關鍵還是要看平時的積累，有些實驗操作繁瑣復雜，需要極大的耐心，這些都應該是逐漸培養(yǎng)起 來的。最后，簡單談一下自己在微生物實驗室做實驗的心得體會。剛開始的時候，最令我頭痛的就是培養(yǎng)基的配制、消毒滅菌，培養(yǎng)基的配制和消毒與滅菌兩個實驗可以說是微生物實驗的最近本課程，內(nèi)容有配制培養(yǎng)基、分裝培養(yǎng)基、為下次試驗準備菌種及無菌器材等，內(nèi)容顯得非常繁多緊湊，需要準備的器材、藥品及用具較多、較雜、較細。最后只能是提前參照微生物實驗教材，將實驗過程中所涉及到的藥品、器材及儀器等統(tǒng)統(tǒng)羅列出來，計算出實驗時大小材料需用的數(shù)量，這樣，一方面可以有效避免在實驗準備時遺忘相關物品，另一方面也可為以后同一實驗的準備工作提供依據(jù)，使實驗準備工作逐步趨于程序化，從而在有效低實驗準備工作量的同時，最大限度地提高準備效率。還有一點很重要，在科研型實驗室里就不能不說導師和師兄師姐，其實他們才是最具價值的“活文獻”，他們就是實驗室里的參考文獻，活參考書。生物就是一門實驗的科學，其中科研經(jīng)驗的積累就是一個非常重要的組成部分，導師和師兄師姐的一句話往往可以事半功倍，大幅提高實驗的成功率和效率。總之，為了保證實驗過程高質(zhì)高量完成，除了實驗準備及實驗過 程外，還要求實驗技術人員必須具備相應的素質(zhì)，實驗操作人員必須 具備較扎實的專業(yè)基礎、熟練的實驗技能及高度的責任心，在工作中要善于總結，同時還要和理論課老師積極溝通，這樣才能夠真正的學好微生物實驗這門課程。