第一篇：病原菌分離培養(yǎng)總結

病原菌的分離培養(yǎng)方法

一、基本原理

植物病原菌的分離培養(yǎng)，是植物病理實驗室工作中的基本技能。為了獲得某微生物的純培養(yǎng)，一般是根據該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧氣等條件要求不同，而供給它們適宜的生活條件，即讓病原菌生活在適宜的培養(yǎng)基上，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而得到純菌株。

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產生大量孢子的病原真菌的分離。

為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。

二． 病原真菌的分離培養(yǎng)（花生褐斑病為例）

1.分離的準備工作

（1）分離材料準備：花生褐斑病葉片：病斑圓形或近圓形暗褐色、黑褐色，淡黃色暈圈。背面有許多黑色小點，呈同心輪紋狀排列。

（2）培養(yǎng)基的準備: PDA培養(yǎng)基,加熱熔化，紫外滅菌后倒板； ?（3）分離工作儀器與用品：超鏡工作臺、培養(yǎng)箱、無菌培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、70％酒精、0．1％升汞、酒精燈、火機、記號筆、橡皮筋套、可調式電爐等。（升汞是劇毒藥物，在操作時應特別小心）。

2.組織分離法

（1）工作前用肥皂洗手，無菌操作前還要用70％酒精擦拭雙手；在使用無菌操作間時，呼吸要輕，不要說話。

（2）酒精燈放入中間合適位置，點燃后不要在移動，保證火焰周圍無菌環(huán)境；

（3）取花生褐斑病的癥狀典型病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處)切取小塊病組織數塊。（選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機會。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點病害應在臨近健全組織的部分分離。）（4）表面消毒：用菌培養(yǎng)皿一次準備流程（75%酒精—0.1%升汞—無菌水—無菌水—無菌水），將病組織放人70％酒精中浸3—5s后，按無菌操作法將病組織移人0．1％升汞液中分別表面消毒1 min左右（如植物組織柔嫩，則表面消毒時間宜短；反之則可長些），然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

（5）用無菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內放3-5塊。（在將病組織小塊移放到平板表面之前，應將其在無菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現細菌污染）。

（6）將培養(yǎng)皿倒置放人25 ℃左右恒溫箱內培養(yǎng)。一般3—4d后觀察待分離菌生長結果；若病組織小塊上均長出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。

（7）除根據菌落的一致性初步確定長出的菌落是否目標菌外，還要在顯微鏡下檢查，并且根據保濕培養(yǎng)的結果進一步確定；

（8）在無菌條件下，用打孔菌落邊緣挑取小塊移入培養(yǎng)基上，在25℃左右恒溫箱內培養(yǎng)，數日后，觀察菌落生長情況，如無雜菌生長，即得該分離病菌純菌種，便可保存。

三． 病原細菌的分離培養(yǎng)（蘿卜黑腐病為例）

1.分離的準備工作

（1）分離材料準備：蘿卜黑腐病俗稱黑心、爛心，該病是由細菌引起的病害。主要危害葉和根。幼苗期發(fā)病子葉呈水浸狀，根髓變黑腐爛。葉片發(fā)病，葉緣多處產生黃色斑，后變“V”字形向內發(fā)展，葉脈變黑呈網紋狀，逐漸整葉變黃干枯。病菌沿葉脈和維管束向短縮莖和根部發(fā)展，最后使全株葉片變黃枯死。蘿卜肉質根受浸染后，透過日光可看到暗灰色病變；橫切蘿卜可看到維管束呈放射線狀、黑褐色；重者呈干縮空洞，維管束溢出菌膿，這一點與缺硼引起的生理性變黑不同。

（2）培養(yǎng)基的準備:PDA，后劃線純化NB；

（3）分離工作儀器與用品：超鏡工作臺、培養(yǎng)箱、無菌培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、70％酒精、酒精燈、火機、記號筆、橡皮筋套、可調式電爐等。

2.黑腐病菌分離（1）工作前用肥皂洗手，無菌操作前還要用70％酒精擦拭雙手；在使用無菌操作間時，呼吸要輕，不要說話。

（2）酒精燈放入中間合適位置，點燃后不要在移動，保證火焰周圍無菌環(huán)境；

（3）取蘿卜黑腐病塊莖，用75 %酒精進行表面消毒；用滅菌解剖刀切去表面，并向內切取病組織，切成長條小塊（2mm*3mm），用無菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內放3-5塊。（在將病組織小塊移放到平板表面之前，應將其在無菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現細菌污染）。

（4）將培養(yǎng)皿倒置放人28 ℃左右恒溫箱內培養(yǎng)。一般3—4d后觀察待分離菌生長結果；若病組織小塊上均長出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。

（5）根據菌落的一致性初步確定長出的菌落，選擇長出的三種菌落（黃、紅、生防），分別在無菌條件下在NB培養(yǎng)基進行劃線；在28℃左右恒溫箱內培養(yǎng)，數經培養(yǎng)后出現的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時，即表明已獲得純培養(yǎng)；最好要經過連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。（6）觀察到的菌落特征：蘿卜黑腐病菌，圓形，同心環(huán)狀，內環(huán)呈金黃色，外圍白色菌膿，濕潤，隨環(huán)隆起、凹陷，半透明，邊緣不整齊。

四．資料查詢其他分離培養(yǎng)方法

1.病原真菌 稀釋分離法

(1)取滅菌培養(yǎng)皿三個，平放在濕紗布上，編號，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0．5～1．0ml。

(3)用移植環(huán)蘸一滴孢子懸浮液，與第一個培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再從第一個培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個培養(yǎng)皿中。

(4)將熔化開冷卻到45～50C的培養(yǎng)基，分別倒在三個培養(yǎng)皿中(為防止細菌污染，也可以向每個培養(yǎng)皿中事先加入1-2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。

提示：倒平板時的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，而成為起伏不平的表面，不利于分離。為大體估計培養(yǎng)基溫度，可將盛培養(yǎng)基的器皿靠在人手背上，如果手背感到燙但尚可以忍耐，則大體為45~50C。

(5)將培養(yǎng)皿翻轉后置恒溫箱(25℃)中培養(yǎng)，數日后觀察菌落生長情況。

(6)挑菌。將培養(yǎng)后長出較為整齊一致的單個菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，置25℃左右培養(yǎng)。待菌長出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進行分離純化，直到獲得純株培養(yǎng)。

2.病原細菌

病原細菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進行分離之前，首先應對病組織材料進行細菌學初步診斷，即經過鏡檢確認有噴菌現象以后，才對該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經典的標準分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：

(1)預先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉放在30C恒溫箱中2—4h，使表面無水滴凝結。也可凝成平板后直接使用。

(2)將病組織先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min，再用無菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20—60min，讓細菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺(接種環(huán))蘸取浸泡液在干燥的培養(yǎng)基平板表面劃線，盡量不要把平板表面劃破。劃過第一批線后的接種環(huán)應放在火焰上燒灼．冷卻后直接在第一批劃線的末端向另一方向劃線。滅菌后再劃第三次線。

提示：劃過第一批線后接種鉺放在火焰上燒過這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線和第二批線上的細菌數量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉培養(yǎng)皿，放在26～28C恒溫箱中培養(yǎng)。1—3d后觀察有無細菌生長，在哪些地方有單菌落生長出來?其中的優(yōu)勢單菌落應為待分離菌形成的。

(5)仔細挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養(yǎng)基上。同時，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線分離，經培養(yǎng)后出現的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時，即表明已獲得純培養(yǎng)。最好要經過連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。

五． 常用的幾種典型的病原菌分離方法

1．斑點病原菌的分離。從病斑部分切取每邊3—5mm的小塊組織，在70％酒精中浸數秒鐘后，移人0．1％的升汞水溶液中處理3—5rain，以滅菌水沖洗3次，移置培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)。

2．維管束組織內病原菌的分離。從根莖維管束組織分離病菌，可先將寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，將表皮組織用滅菌的解剖刀削去，然后切取其中小塊變色的維管束組織，用升汞或漂白粉液消毒后，用滅菌水沖洗幾次，移置培養(yǎng)基面上。

3．根腐病病原菌的分離。根腐或基腐病的分離，由材料的大小決定。材料小的可仿照斑點病的分離法，材料大的則可以用維管束組織內病原的分離法。

4．肉質組織中病原菌的分離。多肉的根、莖及果實等，可以采用維管束組織內病菌分離法除去表面組織，切取小塊病組織分離。如有雜菌感染可采用“直接接種”法，待出現癥狀后，用此法再行分離。

5．種子內病原菌分離。將整個種子或者種子的一部分進行表面消毒(升汞或漂白粉)，用滅菌水洗滌后，移置培養(yǎng)基上。

6．孢子分離法。能產生大量孢子的病菌如青霉素、鏈格孢等，則可配制成孢子懸浮液以稀釋法或劃線法分離之。

7．土壤帶菌分離法。為了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，從有病的土壤中分離它們是必要的。分離方法是將土壤取出少許，配制成懸浮液，然后用稀釋法或劃線法分離。

第二篇：藻類的分離和培養(yǎng)

藻類的分離和培養(yǎng)

微型藻類的分離和培養(yǎng)方法基本上與菌類的方法相似，但還需加上光照條件，并以液體培養(yǎng)為主。在大量培養(yǎng)時，可不必考慮無菌條件。

一、目的

學習藻類的分離和培養(yǎng)方法

二、藥品、材料和用具

水生生物培養(yǎng)槽，玻璃片（面積稍大于培養(yǎng)槽），橡皮管，顯微鏡，三角燒瓶，試管，篩絹，棉塞，微吸管，凹玻片，滅菌鍋，載玻片，吸管，培養(yǎng)皿，人工光源，木盆（或小型實驗池），充二氧化碳氣鋼瓶，抽氣泵，離心機。

土壤抽出液，青霉素，鏈霉素，瓊脂，硝酸鈣，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，過磷酸鈣，硫酸鎂，氯化鉀，碳酸鈉，三氯化鐵，硅酸鈉，葡萄糖，蛋白胨，硫酸銨，硝酸銨，氯化鈣，碳酸氫鈉，鉬酸，氯化鈉，檸檬酸鐵，硫酸錳，人尿，海泥抽出液，食鹽。

三、操作

生長在靜水或水流緩慢河流中的藻類，培養(yǎng)比較容易。取到實驗室后，要立刻從材料瓶中移到寬大的水生生物培養(yǎng)槽內。為了培養(yǎng)大的絲狀藻，要利用寬的、不高的容器。這些容器要用玻片蓋住，以防止培養(yǎng)物受灰塵沾污。倒入容器的水要達到容器高度的一半，或稍多些，使水面上還有充分空氣。在容器邊緣，要用一小塊縱切橡皮管墊住，可使玻片不致緊貼容器，空氣才能進入容器中。細微的藻類如團藻目、硅藻門能很好地生活于培養(yǎng)皿中。很多藻類如顫藻屬、水綿屬的若干種、輪藻屬等可在實驗室中保存很多年。

在迅速流動水中生長的藻如絲藻屬、毛枝藻屬等比較難于培養(yǎng)，因為它們要求經常輸入氧氣。在水層較高水中，在高容器中，這些藻類迅速地死亡。為了把這些藻類保存到實驗時，應當把它們分成一些小部分，放在水層較薄的、寬的容器內，并須常常換水，把空氣吹入水中。還可以用橡皮管把水生生物培養(yǎng)槽和水龍頭連結起來，建立有流水的水生生物培養(yǎng)槽。

在水生生物培養(yǎng)槽中培養(yǎng)藻類時，應盡可能創(chuàng)造和保持藻類天然生存條件。把藻類培養(yǎng)在從采集藻類那一水域取來的水中，或其他天然水（尤其不能用自來水，因其中含很多氯氣，必要的話，也須置較長時間，或加以煮開），或在水中加入混合養(yǎng)料，這些養(yǎng)料是由制造有機物質所必需的礦質鹽構成。

在夏季，不要把藻類培養(yǎng)物放在直射太陽光下，而要放在涼爽的場所，例如向北窗臺上。在秋、冬季節(jié)，如希望藻類保持積極生活活動狀態(tài)，就要把培養(yǎng)物移到有人工光照處。

以上是一般藻類粗放的培養(yǎng)、保存方法。如要作較深入實驗，需注意以下問題：

1．藻種的分離

藻類培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個體分離出來，而獲純種培養(yǎng)。這種方法稱為藻種分離和純化，又稱純培養(yǎng)法。

真正的“純種培養(yǎng)”是指在排除包括細菌在內的一切生物的條件下進行的培養(yǎng)。這是進行科學研究不可缺少的技術，而在生產性培養(yǎng)中不排除細菌的稱之為“單種培養(yǎng)”。

（1）采樣和預備培養(yǎng)：首先要采集有需要分離藻類的水樣，采回后在顯微鏡下檢查。如發(fā)現需要分離的藻類數量較多時，可立即分離。若數量很少，最好先進行預備培養(yǎng)，待其增多后，再分離。

用作預備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各種藻類是不同的，對一些難以培養(yǎng)的藻類一般加入土壤抽出液較好。預備培養(yǎng)液營養(yǎng)成分濃度應小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水樣中藻類種類較多，就應使用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來。

可用三角燒瓶或試管作培養(yǎng)容器，加入容量1/4～1/3培養(yǎng)液。然后把經篩絹過濾除去大型浮游生物的水樣接種進去，放在合適溫度下或室內靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時，容器可靜止不動；而培養(yǎng)浮游藻類時，應該每天搖動一次。

有的藻類在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時需改變培養(yǎng)液濃度，加入葡萄糖、蛋白胨等有機物，補充微量元素和輔助生長物質，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。

土壤抽出液制作方法：先在試管底部，加入高約1cm土壤（采用腐殖化的農田和庭院土）。再加入水使達5cm，塞上棉塞，采用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時，連續(xù)二天。由于氣泡上升，棉塞可能弄臟。因此，最好先在水中煮一段時間，使氣泡跑掉后，再加棉塞進行滅菌。

（2）分離方法：常用下列四種。

1）微吸管（毛細管）分離 選直徑較細（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時，快速拉成口徑極細的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認真仔細地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達到純分離的目的。如不成功，應反復幾次，直至達到分離目的為止。然后移入經滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個培養(yǎng)皿中接20～30個個體。從分離出少量細胞擴大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長時期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（1000～5000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純藻種。

此法操作技術要求高，要細心。往往吸取一個細胞，要反復幾次才能成功，且適于分離個體較大藻類。

2）水滴分離法 用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過載片上，水滴盡可能滴小些，要求在低倍鏡視野中能看到水滴全部或大部分。一個載片上滴2～4滴，間隔一定距離，作直線排列。如一滴水中只有幾個所需同種藻類個體，無其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液，把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反復重做，直到達到目的。

此法簡便易行，尤其適宜于分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢種類。分離受少量生物污染培養(yǎng)液中的藻類多用此法。操作時同樣要求細致、認真，使用工具及培養(yǎng)液經嚴格消毒。

3）稀釋分離法 把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過稀釋到適宜程度的方法，達到把原混雜生物單個分離培養(yǎng)的目的。

首先把水樣稀釋到每一滴含有一個左右的生物細胞（也可能一個都沒有，也可能有兩個），在稀釋過程中配合顯微鏡檢查，調節(jié)稀釋度，然后準備裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進行培養(yǎng)。待藻類生長繁殖達一定濃度時，再檢查是否達到分離目的，若未達到，再重復做。

此法操作簡單易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分離法效果好。

4）平板分離法 這個方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。

接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經過十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類群落，通過顯微鏡檢查，尋找需要的純藻群落，然后用消毒過的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經過滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進行培養(yǎng)。

此法較繁，但難度不大，而且可看到是否污染雜菌，對于分離已污染雜菌培養(yǎng)液的藻類更合適。

5）底棲藻的分離 在顯微鏡或放大鏡下挑取個體，一般可接種在固體培養(yǎng)基平板上，反復挑選、培養(yǎng)。

6）分離浮游藍藻 可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分離硅藻則可利用其易沉淀的特性。

用以上各種方法分離到藻種，需放在適宜光照條件下（靠南或北窗口附近光線充足處，但嚴防陽光直射）培養(yǎng)，有條件的可控制溫度和利用人工光源。培養(yǎng)時，每天輕輕搖動1～2次，但需注意勿把培養(yǎng)液沾濕棉塞，避免雜菌污染。經一段時間后，培養(yǎng)物顏色逐漸變深。再經一次顯微鏡檢查，如無其他混雜生物，才達到單種培養(yǎng)目的。

2．藻種的培養(yǎng)

獲得單種培養(yǎng)后，一方面擴大培養(yǎng)，另一方面可把藻種作較長時間保存，需要時隨時取出使用。藻種培養(yǎng)要求比較嚴格，培養(yǎng)容器可用各種不同大小的三角燒瓶，容量有100、300、500、1000毫升，適于逐漸擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)容器和工具需經煮沸滅菌或使用化學藥品滅菌后，用煮沸水沖洗，培養(yǎng)液用加熱滅菌法滅菌。按種后瓶口用滅菌紙包扎，放在適宜光、溫條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖動二次。大約二周后進行一次移植。藻種在培養(yǎng)過程中必須定期用顯微鏡檢查，保持不受其他生物污染。

3．藻種的保藏

可接在固體培養(yǎng)基上，在常溫、弱光下保藏半年到一年；也可在低溫下（冰箱內）保藏，每天接受短時間（幾個小時）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏幾個月。保藏藻種所用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分濃度應比正常培養(yǎng)基高一些，一般可增加一倍，瓊脂量為1～1.5％。也可在固體培養(yǎng)基上，再加培養(yǎng)液，然后接種到培養(yǎng)液中，可以避免固體培養(yǎng)基干涸，保藏效果比單用固體好。

4．培養(yǎng)液和培養(yǎng)基的配方

配方極多，每種配方主要適用于一定藻種，這里介紹比較常用的幾種：

水生4號和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍藻可用朱氏10號或水生105號無氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍藻）；硅藻可用朱氏10號和水生硅1號培養(yǎng)基；另外還有海產綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基配方見表1。

以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內加入1.5％瓊脂。

從以上各種配方，可看到配制藻類培養(yǎng)液的幾條原則：

（1）要有適量氮源（除固氮藍藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機氮等。

（2）應包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等。

（3）要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調節(jié)pH。

（4）要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。

（5）要滿足某些藻類特殊需要，如藍藻需鉬，硅藻需硅。

（6）要添加適量生長物質如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。

5．大量培養(yǎng)過程

包拈接種、培養(yǎng)、采收等。

（1）接種：一般要求選取生活力強、生長旺盛藻種?？上葘饪s藻種用連續(xù)稀釋法，制備一定濃度的懸浮藻液，然后接入培養(yǎng)容器。接種時注意藻種和培養(yǎng)液比例要適當，使藻細胞在新培養(yǎng)液中達到一定數量。使一開始培養(yǎng)，藻類在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢，另一方面還可縮短培養(yǎng)周期，這是培養(yǎng)得到成功的經驗之一。在環(huán)境條件不很適合情況下，更需提高接種量。一般所用藻種濃度，根據藻類體積大小，每毫升30萬～300萬個，采用1∶2～1∶5的比例。還需注意接種時間，在自然光條件下，最好在上午8～10時，不宜在晚上。尤其是能運動種類，此時明顯向上浮游，接種時可把上浮優(yōu)質藻類吸出做藻種，起選種作用。

（2）培養(yǎng)管理：主要是使已接種培養(yǎng)物在相對穩(wěn)定適宜環(huán)境中大量繁殖生長。要注意以下因素：

1）二氧化碳濃度在開放式不通氣方法培養(yǎng)中，攪拌是十分必要的，可以增加水和空氣的接觸面，使空氣中二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，而且?guī)椭恋碓孱惣毎细～@得光照。在通氣培養(yǎng)中，培養(yǎng)液內應維持二氧化碳濃度在0.1～5％之間。

2）光照強度 利用太陽光源培養(yǎng)時，一般在室內培養(yǎng)可放在近窗口地方，防止強直射光照射?；蚶萌斯す庠矗?0～100瓦電燈或日光燈），需1500～3000勒克斯/厘米2。

3）溫度 適溫一般在10～30℃之間，最適溫常為20～25℃。若在室外培養(yǎng)，夏季中午高溫，冬季早晚低溫，常造成不利影響，需設法調節(jié)。

4）無機營養(yǎng) 應不斷添加新鮮培養(yǎng)液，及時補充被藻吸收后減少了的某些元素。

5）注意pH變化 如變動過大，可用酸、堿調節(jié)。

6）適當控制培養(yǎng)物中藻細胞濃度 過高會引起光照和無機營養(yǎng)不足，并導致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范圍內。

7）及時觀察和檢查藻類生長情況 可以通過培養(yǎng)物呈現的顏色、藻類細胞運動情況、是否有沉淀附壁、菌膜及敵害生物污染跡象等觀察而了解一般的生長情況。藻種和中繼培養(yǎng)每半月進行一次全面顯微鏡檢查。大量培養(yǎng)中發(fā)現有不正?，F象，應立即鏡檢，目的有兩個：了解藻細胞生長情況，并檢查有無敵害生物污染。

（3）采收：培養(yǎng)液中藻體的適時采收，既是培養(yǎng)的目的，也是繼續(xù)培養(yǎng)的手段。因為通過采收一部分藻體，可使藻細胞濃度保持恒定。通常在培養(yǎng)物細胞濃度達到干重0.4～0.5克/升時，即可采收培養(yǎng)總量1/3的藻體。

采收時，先攪拌培養(yǎng)物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明礬或6％飽和石灰水。約1～2小時，藻細胞即可完全沉淀，取出沉淀，離心、濃縮、烘干。在大型培養(yǎng)池中采收藻體，可另外設計適當的工藝流程。

第三篇：微生物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)在植物病害的研究中具有重要意義，分離、培養(yǎng)病原菌的方法是植物病理學研究工作中最常應用的實驗技術。一方面，在一個新的病害研究中，通過分離與培養(yǎng)獲得病原物的純培養(yǎng)，完成柯氏法則，以明確該病病原；研究病原物的生物學特性和病害循環(huán)（侵染、病程等等）。所謂病原物的分離，即把該病原菌從發(fā)病組織上與其他微生物分開；所謂病原物的培養(yǎng)，即將分離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長的營養(yǎng)基質即培養(yǎng)基上，從而獲得其純培養(yǎng)。病原物的分離與培養(yǎng)，需經以以幾個步驟: 1.有關器皿的滅菌和消毒； 2.制作培養(yǎng)基； 3.病原菌的分離 4.病原菌的培養(yǎng)。－、滅菌與消毒

滅菌與消毒是兩個不同的概念。滅菌則是指殺死一切微生物的營養(yǎng)體和孢子。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體，在植物病理學實驗中，需要進行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對所用器材、培養(yǎng)基和工作場所都要進行嚴格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、輻射和使用化學藥品等方法。

(一)熱力滅菌

熱力滅菌分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。

1．干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內的蛋白質疑固性與其本身的含水量有關。在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高(160～170℃)，時間長1～2 h。但干熱滅菌溫度不能超過180 ℃，否則包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的儀器是烘箱。

干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，無菌操作時酌試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后進行灼燒滅菌。通常所說的干熱滅菌是在烘箱內利用高溫干燥空氣(160～170℃)進行滅菌。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。

進行干熱滅菌要注意以下問題：物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通；滅菌物品不要接觸烘箱內壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火；在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內停止加溫；電烘箱內溫度未降到70℃以前，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。濕熱滅菌

(1)高壓蒸汽滅菌 此法是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內，0.1MPa，121℃保持15～30 min進行滅菌。時間的長短可根據滅菌物品種類和數量的不同而有所變化，以達到徹底滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的滅菌。

(2)常壓蒸汽滅菌 在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下：常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌法。對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行，也可用普通蒸籠進行滅菌。由于常壓，其溫度不超過100℃，僅能使大多數微生物被殺死，而芽孢細菌卻不能在短時間內殺死，因此可采用間歇滅菌以殺死芽孢細菌，達到徹底滅菌的目的。

常壓間歇滅菌是將滅菌培養(yǎng)基放人滅菌器內，每天加熱100℃，30 min，連續(xù)3 d，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物取出放室溫下18～24 h，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱100℃，30 min，發(fā)育的營養(yǎng)體又被殺死，但可能仍留有芽孢，故再重復一次，使徹底滅菌。

(二)過濾除菌

許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，—均會被熱破壞，因此采用過濾除菌的方法。應用最廣泛的過濾器有：

(1)蔡氏過濾器 該過濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個特制的金屬（銀或鋁）漏斗組成，分上、下兩節(jié)。過濾時，用螺旋把石棉板緊緊夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液臵于濾器中抽濾。每次過濾必須用一張新濾板。根據其孔徑大小，濾板分為3種型號：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來除去一般細菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過。使用時可根據需要選用。

(2)微孔濾膜過濾器 這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。微孔濾膜過濾器是由上下二個分別具有出口和入口連接裝臵的塑料蓋盒組成。出口處可連接針頭，入口處可連接針筒。使用時將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當溶液從針筒注入濾器時，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達到除菌的目的。根據待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點是可以不破壞溶液中各種物質的化學成分。但由于濾量有限，所以一般只適用于實驗室中小量溶液的過濾除菌。實驗室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜過濾除菌的主要操作步驟為：

① 組裝、滅菌 將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊。壓平，包裝滅菌后待用(0.1MPa、121.5℃滅菌：20 min)。連接。將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。

② 壓濾 將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠壓過濾到無菌試管中。濾畢，將針頭撥出。壓濾時，用力要適當，不可太猛太快，以免細菌被擠壓通過濾膜。

提示: 整個過程應在無菌條件下嚴格無菌操作以防污染，過濾時應避免各連接處出現滲透現象。

(三)輻射滅菌 紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200～300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機理主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA的交聯，從而抑制了DNA的復制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成過氧化氫(H2O2)。O3和H2O2有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以只適用于無菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。

注意事項: 紫外線對眼結膜及視神經有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。紫外線燈距照射物以不超過1.2 m為宜。

此外，采用60Co-γ射線滅菌，也已廣泛用于不能進行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫(yī)用生物敷料皮等的滅菌。γ射線滅菌的最大優(yōu)點是穿透力強，可在厚包裝完好條件下滅菌。

(四)化學藥品滅菌

化學藥品消毒滅菌法是應用能抑制或殺死微生物的化學制劑進行消毒滅菌的方法。能破壞細菌代謝機能并有致死作用的化學藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；只是阻抑細菌代謝機能，使細菌不能增殖的化學藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多數抗生素等?；瘜W藥品對微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學藥品濃度的高低、處理微生物的時間長短、微生物的種類以及微生物所處的環(huán)境等有關。

植物病理學實驗室中常用的化學藥品有2％煤酚皂溶液(來蘇爾)、0.25％新潔爾滅、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒與滅菌不僅是從事植物病理學和整個生命科學研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實用技術，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護、食品、生物制品等各方面均具有重要的應用價值。根據不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。

二、培養(yǎng)基的制作

1、目的要求

了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握培養(yǎng)基的制備方法。

2、基本原理

在植物病理學研究工作中經常要使用各種不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是按照生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質。其中含有碳源、氮源、無機鹽、維生素以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長繁殖還必須在最適pH范圍內才能生長得更好，因此，對不同種類的微生物應將培養(yǎng)基調節(jié)到一定的pH范圍。－般而言，真菌調節(jié)到微酸，細菌調節(jié)到微堿。

培養(yǎng)基的種類很多，不同的微生物所需要的培養(yǎng)基不同。依物理性狀可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.5 %～2 %的瓊脂，半固體培養(yǎng)基是加入0.2 %～0.5 %的瓊脂。瓊脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根據營養(yǎng)物質來源的不同，培養(yǎng)基可分為天然、半合成和合成培養(yǎng)基三類。天然培養(yǎng)基是以自然界原有的有機物為材料經滅菌后制成，如馬鈴薯、胡蘿卜、水果、大麥粒、高粱粒等。半合成培養(yǎng)基中既有一些天然的有機物質，又有一些成分簡單或明確的化合物。如常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、肉汁胨培養(yǎng)基(NA)等。合成培養(yǎng)基是由一些成分明確的化合物配制而成的，無任何成分不明確的物質，常用于研究微生物的生理生化性狀，如查氏(Czapek)培養(yǎng)基等。

根據培養(yǎng)基用途不同，可分為生長繁殖培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、貯存培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基等。在植物病理學研究中，最常用培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，主要用于分離培養(yǎng)病原真菌。

在培養(yǎng)基配制完之后，必須經過滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。

3、材料、試劑與儀器 材料 馬鈴薯。

試劑 葡萄糖、瓊脂等。

儀器與用品 高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(或酸度計)、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。

4、操作步驟

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000 ml，自然pH。

在PDA培養(yǎng)基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱為PSA培養(yǎng)基。(1)稱量 稱量去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g。提示：瓊脂加入的量取決于瓊脂的質量，質量好的15 g就夠了，質量差的應適當增加。另外，在夏天氣溫較高時，適當增加用量。

(2)將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘渣。

(3)將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。

提示：在瓊脂熔化的過程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入適量的水以補充加熱過程中損失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培養(yǎng)基的鍋內用紅藍鉛筆標記出不同體積的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容時直接將水加至已標記的刻度即可。

(5)分裝 根據不同的實驗目的，可將配制的培養(yǎng)基分裝于試管內或三角瓶內。分裝試管，其量為管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶容積之一半為宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脫脂的經彈松的棉花，棉塞可過濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，故在植物病理學研究工作中普遍使用。

正確的棉塞是形狀、劃、、松緊與管口或瓶口完全適合，過緊時妨礙空氣流通，操作不便；過松則達不到濾菌的目的，且棉塞過小往往容易掉進試管內。正確的棉塞頭較大，約有1／3在外，2／3在試管內。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾染在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，將試管用線繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道線繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、組別、制作人等。

(8)滅菌 將上述培養(yǎng)基以0.1MPa，121℃，高壓蒸氣滅菌20 min。

(9)擱臵斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基豎臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱臵的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。

培養(yǎng)基經滅菌后，必須放在37℃溫箱培養(yǎng)24h，無菌生長者方可使用。

PDA培養(yǎng)基一般不需要調pH。對于要調節(jié)pH的培養(yǎng)基，一般用pH試紙測定其pH。如果培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液進行調節(jié)。調節(jié)時應逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿破壞培養(yǎng)基成分。

三、病原菌的分離培養(yǎng)和純化

1、目的要求

(1)了解分離與純化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和組織分離、稀釋分離、平板劃線分離的基本操作技術。

(3)掌握在平板、斜面及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌及觀察其培養(yǎng)性狀的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產生大量孢子的病原真菌的分離。病原細菌的分離方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。

為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。

3、材料、儀器與用具 3.1 材料

(1)稻瘟?。ㄈ~、病節(jié)、病穗頸）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）。(3)黃瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。

(5)黃瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黃瓜細菌性角斑?。ㄈ~）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白葉枯?。ㄈ~）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜軟腐病（葉）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；肉膏蛋白脈培養(yǎng)基；加寄主組織煎汁的培養(yǎng)基等。

3.3．儀器與用品 超凈工作臺、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、接種環(huán)(鉺)、70％酒精、0.1％升汞、酒精燈、火柴、記號筆、橡皮筋套、可調式電爐、不銹鋼鍋等。

4、實驗操作

(一)病原真菌的分離

1．組織分離法 其步驟為：

(1)取滅菌培養(yǎng)皿一個，臵于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料和分離人的姓名。提示：無菌操作應注意下面幾點：工作前將所需的物品都放在超凈工作臺內；操作前用肥皂洗手，操作時還需用70 ％酒精擦拭雙手；無菌操作時，呼吸要輕，不要說話。

（2）用無菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25％乳酸1～2滴(可減少細菌污染)，然后將融化而冷至60℃左右的PDA培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿中，每皿倒10～15 ml，輕輕搖動使之成平面。凝固后即成平板培養(yǎng)基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可減少平板上出現污染細菌菌落。除乳酸外，在培養(yǎng)基中加入適當的抗菌素抑制細菌的生長，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 細菌生長；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-細菌生長；加鏈霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分細菌的生長。除了氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應在滅菌后并冷卻到45℃左右(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)時加入。倒平板過程中只要遵循“穩(wěn)、輕、快”要領，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處，)切取小塊(每邊長3～4 mm)病組織數塊。

提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機會。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點病害應在臨近健組織的部分分離。

（4）將病組織放入70％酒精中浸3～5s后，按無菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中分別表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒劑)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時間宜短；反之則可長些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時間較短(一般數秒至l min)升汞溶液消毒的時間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時間3～5 min。

(5)用無菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內放4～6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應將其在無菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現細菌污染。

(6)將培養(yǎng)皿倒臵放入25℃左右恒溫箱內培養(yǎng)。一般3～4 d后觀察待分離菌生長結果。

(7)若病組織小塊上均長出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25 ℃左右恒溫箱內培養(yǎng)，數日后，觀察菌落生長情況，如無雜菌生長即得該分離病菌純菌種，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根據菌落的一致性初步確定長出的菌落是否目標菌外，還要在顯微鏡下檢查，進一步確定。如果是對未知病原菌的組織分離，則要將長出的菌落分別轉出，通過進一步的接種實驗明確哪一種為其病原菌。

在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(如患灰霉病的番茄果實)，在分離過程中可直接挖取內部患病組織移入平板培養(yǎng)基上，完成分離工作。

2.稀釋分離法

(1)取滅菌培養(yǎng)皿三個，平放在濕紗布上，編號，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0.5～1.0 ml。(3)用移植環(huán)蘸一滴孢子懸浮液，與第一個培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再從第一個培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個培養(yǎng)皿中。

(4)將熔化并冷卻到45～50℃的培養(yǎng)基，分別倒在三個培養(yǎng)皿中(為防止細菌污染，也可以向每個培養(yǎng)皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。

提示： 倒平板時的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，不利于分離。

(5)將培養(yǎng)皿翻轉后臵恒溫箱(25℃)中培養(yǎng)，數日后觀察菌落生長情況。

(6)挑菌 將培養(yǎng)后長出較為整齊一致的單個菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，臵25℃左右培養(yǎng)。待菌長出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進行分離純化，直到獲得純培養(yǎng)。

(二)病原細菌的分離

病原細菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進行分離之前，首先應對病組織材料進行細菌學初步診斷，即經過鏡檢確認有噴菌現象以后，才對該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經典的標準分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：(1)預先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉放在30℃恒溫箱中2～4 h，使表面無水滴凝結。也可凝成平板后直接使用。(2)將病組織先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用無菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20～60 min，讓細菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺，(接種環(huán))；蘸取浸泡液在干燥的培養(yǎng)基平板表面劃線，盡量不要把平板表面劃破。劃過第一批線后的接種環(huán)應放在火焰上燒灼，冷卻后直接在第一批劃線的末端向另一方向劃線。滅菌后再劃第三次線。

提示：劃過第一批線后接種鉺放在火焰上燒過這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線和第二批線上的細菌數量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉培養(yǎng)皿，放在26～28℃恒溫箱中培養(yǎng)。1～3 d后觀察有無細菌生長，在哪些地方有單菌落生長出來?其中的優(yōu)勢單菌落應為待分離菌形成的。

(5)仔細挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養(yǎng)基上。同時，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線分離，經培養(yǎng)后出現的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時，即表明已獲得純培養(yǎng)。最好要經過連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。

(三)真菌、細菌培養(yǎng)性狀

1．真菌培養(yǎng)性狀觀察 取已分離，純化的某種真菌菌種；按前述稀釋分離法中(1)～(5)步驟進行，待某培養(yǎng)皿中形成單個菌落后觀察。記載以下內容：菌落顏色、菌叢密集及繁茂程度、是否有色素分泌出來而滲透到培養(yǎng)基中、菌落生長速度快慢等。同時要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

2．細菌培養(yǎng)性狀觀察

(1)仿照上述真菌菌落形成步驟，觀察記載以下內容：菌落顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面是光亮還是粗糙或有皺折、、菌落隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，菌落生長速度快慢，是否有特殊氣味形成等。同時要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(2)用接種鉺(環(huán))蘸細菌菌種后，通過無菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培養(yǎng)基表面從下向上劃一直線，過2～3 d后長出的細菌群體稱為菌苔，可仿照觀察記載細菌菌落的記載內容，記載菌苔顏色、邊緣形狀、表面是光亮還是粗糙有皺折、隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，是否有特殊氣味生成，生長速度快慢等。也要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(3)用接種鉺(環(huán))蘸取細菌菌種后，通過無菌操作，將其接種在某種液體培養(yǎng)基中，數日后觀察記載培養(yǎng)基中是否變混濁、是否有色素、氣體、沉淀生成，培養(yǎng)液表面是否可生成菌膜等。也要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

第四篇：土壤微生物的分離培養(yǎng)技術實驗報告

重慶大學研究生專業(yè)實驗教學

實驗報告書

實驗課程名稱： 實驗指導教師： 學

院： 專業(yè)及類別： 學

號： 姓

名： 實驗日期： 成績：

重慶大學研究生院制

一、實驗目的

1、了解分離與純化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培養(yǎng)基的方法與平板劃線分離的基本操作技術；；

3、學習習近平板菌落計數的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步觀察來自土壤中的幾類微生物的菌落形態(tài)特征，并能判斷菌的類型。

二、實驗原理

1、培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養(yǎng)基質，用以培養(yǎng)、分離、鑒別、保存各種微生物或積累代謝產物。一般的培養(yǎng)基應包含適合微生物生長的6大營養(yǎng)素即水分、碳源、氮源、能源、無機鹽和生長因子。培養(yǎng)基的種類很多，根據培養(yǎng)成分的不同可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基與半合成培養(yǎng)基；根據物理狀態(tài)的不同又可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。微生物的分離、純化、記數等方面的研究常常使用的就是固體培養(yǎng)基。本實驗就是使用的固體培養(yǎng)基。

已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如來不及滅菌，應暫存冰箱，以防止其中微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)基酸堿度所帶來不利影響。

培養(yǎng)基的原材料來源十分廣泛，本實驗采用的原材料為土豆。

2、接種方法與無菌接種

將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術稱之為接種。接種是微生物實驗及科學研究中的一項最基本的操作技術。接種的關鍵是要嚴格的進行無菌操作。微生物的接種方法很多，劃線接種、三點接種、穿刺接種、混澆接種與涂布接種是幾種常用的接種方法。

劃線接種是最常用的接種方法，即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可以達到接種的目的。常用的接種工具為接種環(huán)、針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。三點接種是把少量的微生物接種在平板表面，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察研究它們的形態(tài)。研究霉菌形態(tài)時就常用此法。

穿刺接種是用針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺。該法常用于厭氧菌種的保藏或微生物的動力研究。

混澆接種是先將待接的微生物放入培養(yǎng)皿中再倒入冷卻至45℃左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就被稀釋了。待平板凝固后，置于適宜溫度下培養(yǎng)，就可以長出單個菌落的微生物。

涂布接種是將菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可以長出單個菌落的微生物。

本實驗采用的是劃線接種。為了防止接種時引入其它微生物，整個操作過程均需在無菌操作臺上進行，還需對操作員的雙手進行酒精消毒，每次劃線前都需灼燒接種環(huán)，接種時才打開培養(yǎng)皿且不能全部打開，接種完馬上關上。

三、實驗器材

1、儀器

培養(yǎng)皿、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、酒精燈、玻璃棒、接種環(huán)、15ml離心管、試管架、鑷子、電磁爐、鍋、恒溫培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋、無菌操作臺、酒精燈、天平、濾紙等。

2、材料

土豆、瓊脂、蒸餾水、酒精、土壤樣品

四、實驗步驟

1、土壤稀釋液的配制

① 在菜地用九點取樣法取適量土壤樣品，具體操作為：在菜地選取九個取樣點，在每個取樣點取相同量的表層土壤（10cm左右），然后將其混合均勻；

② 稱取1g土壤樣品與99ml蒸餾水，將其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸餾水于15ml離心管中，再用移液槍取1ml前一步已配制的土壤溶液于離心管中，搖勻，即為10-3的土壤溶液；

④ 重復前一步，將土壤溶液稀釋為10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀釋液。

2、土豆培養(yǎng)基的制備

① 用天平稱取200g土豆，清洗干凈后去皮切?。?/p>

② 用量筒量取1000ml蒸餾水與電磁爐鍋中，再加入已準備好的土豆，將其煮爛；

③ 從鍋中取出已煮爛的土豆，用紗布過濾，濾液待用； ④ 稱取20g瓊脂與濾液中，再用蒸餾水定容至1000ml；

⑤ 在制備好的濾液中加入0.1ml菌液，然后放入高溫滅菌鍋中，在121℃下滅菌20min；

⑥ 取出已滅菌的土豆培養(yǎng)基，待其熔化后冷卻至60℃，倒入每付平板約15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接種與分離

① 將接種需要的所有器材均放置于無菌操作臺上；

② 用浸泡在酒精里棉花給雙手滅菌，點燃酒精燈，右手拿接種環(huán)，左手拿培養(yǎng)基；

③ 將接種環(huán)放在火焰上燒灼，待其冷卻后在10-6土壤稀釋液中蘸取少量液體，打開培養(yǎng)基的一部分，采用劃線接種，使之形成單菌落，一共劃線3-4次，每劃線一次就需在火焰上燒灼一次；

④ 重復上步，接種10-

7、10-8的土壤稀釋液的微生物；

⑤ 接種完的培養(yǎng)基放在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h，取出觀察。

五、結果與思考

1、實驗結果

圖1 實驗結果如圖1所示。由圖1可知，采用劃線接種土壤微生物的培養(yǎng)皿里有單菌落出現，這說明劃線接種能達到分離培養(yǎng)的目的。

學習過微生物這門課程的同學都知道，真菌的菌落較大且疏松，菌絲細長，呈絨毛狀、蜘蛛網狀、棉絮狀，無固定大小，多有光澤，不易挑，孢子會呈現紅色、褐色、綠色、黑色、黃色等不同的顏色；細菌的菌落較小，形狀表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多為白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有細菌。

2、思考題

⑴在平板劃線法中，為什么每次都需要將接種環(huán)上的剩余物燒掉？

答：這么做的主要目的是殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種，以使下次劃線的菌種直接來自于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少，從而達到分離菌株的目的。

⑵為什么要把培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？

答：①操作時培養(yǎng)皿蓋上可能粘有水珠或者細菌，倒著培養(yǎng)可以避免培養(yǎng)皿蓋上的水珠或者微生物落在培養(yǎng)皿上；

②培養(yǎng)過程中，細菌在代謝繁殖過程中會產生一些有害于細菌生長繁殖的代謝物，釋放熱量及有水排出，如果不倒著培養(yǎng)會有水珠滴落到培養(yǎng)基中，影響菌落的生長;③如果培養(yǎng)目標是收集細菌代謝物，而且代謝物易溶于水，倒著培養(yǎng)可能會方便收集。

六、實驗總結 我本科所學專業(yè)是材料科學與工程，本次實驗是我高中后第一次接觸微生物方面的知識。在本次實驗課里，段老師先給我們詳細講解了微生物分離培養(yǎng)方面的許多理論知識，然后才進入了理論環(huán)節(jié)。在實驗操作過程中段老師一直在我們旁邊觀察我們的實驗操作過程，一旦出現錯誤，會立即指出并耐心的給我們講解應該怎么做，我擔心自己從來沒做過微生物培養(yǎng)方面的實驗會做不好，段老師還一直在旁邊鼓勵我，并給我講解了許多微生物分離培養(yǎng)方面的知識，最后我獨立完成了本次實驗。此次實驗課，我真的是受益匪淺，學到了許多微生物分離培養(yǎng)方面的知識，十分感謝段老師。

圖2 如圖2所示，本次微生物分離培養(yǎng)實驗中，有些培養(yǎng)皿里菌落很少，只有一個，有的甚至沒有。我認為出現這種情況原因可能是：劃線接種時，未等接種環(huán)冷卻就開始接種，微生物可能被高溫殺死；在接種時，酒精燈火焰太大，進行接種操作的全過程又離酒精燈火焰很近，這也可能將微生物殺死。

第五篇：魔芋論文：嵐皋縣魔芋軟腐病和白絹病病原菌的分離鑒定和生物防控初探

魔芋論文：嵐皋縣魔芋軟腐病和白絹病病原菌的分離鑒定和生物防控初探

【中文摘要】本文主要是對陜西省安康市嵐皋縣藺河鄉(xiāng)光明村和立新村等不同自然村魔芋軟腐病與白絹病病原微生物的分離純化,致病性測試,生物學特性的研究,運用生理生化和分子生物學方法鑒定其病原微生物。通過室內特定條件對病原菌在不同溫度、不同酸堿度、不同抗生素與不同藥劑等條件下的生長狀況及生物學特性表現的差異性進行試驗,提出防控措施。對嵐皋縣分離得到的魔芋軟腐病病原菌的形態(tài)特征,生物學特性,致病性等進行了初步研究,結果表明導致魔芋致病的病原菌最適生長溫度25-30℃,40℃以上均不能生長;它可利用葡萄糖和乳糖,不能利用麥芽糖、蔗糖和淀粉。通過致病性試驗發(fā)現此病菌主要以土壤傳播和傷口感染為主。通過16S rDNA序列分析,初步確定該致病菌為Pectobacterium sp.,在系統發(fā)育地位上與胡蘿卜軟腐果膠菌胡蘿卜(Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora, p.c.c.)關系最近,相似性為98.64%。通過對種芋的處理以及溫度,酸堿度等室內條件下試驗,發(fā)現在種芋的處理上,對種芋處理的時間要把握好,最多不超過1小時。軟腐病原菌最適宜生長的酸堿度范圍為pH 5.0～8.0之間,其它范圍較不適宜,尤其以強酸區(qū)表現更為明顯。魔芋軟腐病原菌最適生長的溫度范圍為25℃～30℃之間,不適生長的溫度范圍為6℃以下和38℃以上區(qū)間,其中停止生長的上、下限溫度各為40℃和5℃。從安康市嵐皋縣魔芋中分離得到白

絹病病原菌,觀察其形態(tài)特征和生物學特性,考察其致病性特點,并測定其ITS序列。白絹病菌絲最適生長溫度為25-35℃,pH為6-9,可利用乳糖,半乳糖,葡萄糖,甘露醇,麥芽糖等為唯一碳源;利用甲硫氨酸、尿素、硝酸鉀、硫酸銨和蛋白胨為唯一氮源;由ITS序列鑒定分離自嵐皋縣魔芋白絹病的病原菌為半知菌亞門,絲孢綱,無孢目,小核菌屬的齊整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)。通過ITS鑒定技術,準確鑒定出引起魔芋白絹病的致病菌種類,并研究了該致病菌的生物學特性,為實際種植防治該病提供了理論依據。生物防控方法研究中,主要選用了10種抗生素做藥敏實驗,氨芐青霉素的效果最好,其次是青霉素,氯霉素,井岡霉素。在拮抗菌的篩選中,其中J-1的拮抗效果最明顯,拮抗機理需要再深入研究,為魔芋軟腐病害的生物防治提供理論。

【英文摘要】This paper is mainly for soft rot and southern blight of konjac purification of pathogens, pathogenicity tests, biological characteristics, the use of biochemical and physiological identified by molecular methods of pathogenic microorganisms in different villages such as Guangming and LixinVillage, Langao County, Ankang City, Shaanxi Province.Specific conditions of the laboratory pathogens at different temperatures, different pH, different agents such as antibiotics, and under different growth conditions and differences in biological characteristics to test the

performance of proposed control measures.The pathogenicity, morphological character and biological character of soft rot-causing bacteria, which isolated from Amorphalluskon jac growing in Langao county, Shaanxi province, were determined firstly.The results showed that the optimum temperature for these isolates were 25-30℃, but can’t grow beyond 40℃.They can utilize glucose and lactose, but not maltose or starch or maltose.The test of pathogenicity to Konjac reavealed that the pathway to widely spread was by soil and infection was through cutting of plants.16S rDNA sequence analysis of strains showed that they belonged to Pectobacterium sp.and were very closely related to Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora, p.c.c.with 98.64% sequence identity.From line treatment, by species and temperature, pH and other tests under laboratory conditions, found in the handling of species of taro, taro on the kinds of processing time to grasp, no more than 1 hour.The best optimum growth of soft rot bacteria’s pH range between pH5.0 ~ 8.0, other than the appropriate range of areas, particularly in the strong acid is more obvious.This bacteria of the original optimum growth temperature range between 25℃-30℃, the temperature range of above 38℃and below 6℃is not suitable, when the temperature below 5℃or above 40℃, the bacteria

stopped growing.The southern blight-causing bacteria were isolated from Amorphalluskon jac collected in Langao county.The becteria were identified by an almost complete ITS gene sequence analysis together with the morphological and biological properties..The results showed that the optimum temperature and pH for these isolates were 25 to 35℃and pH 4-7, respectively.They can utilize glucose, lactose, maltose, galactose and mannitol as solely carbon resource, and use methionine, unrea, potassium nitrate, ammonium sulfate and peptone as solely nitrogen.The test of pathogenicity to Konjac reavealed that the pathway to widely spread was by soil and infection was through cutting of plants.The analysis of ITS sequences of strains showed that they belonged to Sclerotium rolfsii Sacc., Agonomycetales, Hyphomycetes and Deuteromycotina.The pathogenic bacteria that cause sclerotium rolfsii disease have been determind by the ITS sequence analysis method.The results of this experiment will provide a theoretical basis for disease prevention.Prevention and control methods in biological research, mainly used to do 10 kinds of antibiotics susceptibility test, ampicillin was the best, followed by penicillin, chloramphenicol and Jinggangmycin.Screening of antagonistic bacteria in which the

antagonistic effect of J-1 the most significant antagonistic mechanism requires further in-depth research, to provide biological control of konjac soft rot damage theory.【關鍵詞】魔芋 軟腐病 白絹病 分離鑒定 生物防控

【英文關鍵詞】Konjac Soft rot Southern Blight Isolation and Identification Biological control 【目錄】嵐皋縣魔芋軟腐病和白絹病病原菌的分離鑒定和生物防控初探摘要5-6

ABSTRACT6-7

10-11

第一章 文獻綜述1.2 魔芋研究進展12-15

1.3.1 魔芋軟腐10-2011-121.1 引言1.3 魔芋病害研究進展

12-14病研究進展14-15

1.3.2 魔芋白絹病的研究進展

1.4 軟腐病1.3.3 魔芋其他病害的研究進展

15-1816-17和白絹病綜合防控措施的研究進展施措施15-1617-181.4.2 生物防控措施1.5 研究內容

1.4.1 農業(yè)防控措1.4.3 藥劑防控

1.6 立題依據及研究意義18-20究20-32第二章 魔芋軟腐病病原菌的分離鑒定與生物學特性研2.1 采樣地概況2.2.1 主要試劑2.3 方法

2.2 材料20-2120-2121-22

2.2.2 主要培養(yǎng)基2.3.1 樣品采集22

2.3.3 目的菌的形態(tài)

21-252.3.2 目的菌分離純化

22-23觀察與生物學特性的研究23

2.3.4 目的菌的致病性研究

23-25

2.4 結2.3.5 病原菌的16S rDNA 序列研究

果與分析25-2626-2825-302.4.1 分離株與致病性檢測結果2.4.2 病原菌形態(tài)觀察結果與生物學特性2.4.3 分子鑒定

28-30

2.5 討論

30-32第三章 魔芋白絹病病原菌的分離鑒定與生物學特性研究32-4132-34測定343.1 材料與方法3.1.2 病原菌的分離與純化

32-3634

3.1.1 采樣3.1.3 致病性的3.1.4 病原菌絲體的形態(tài)觀察及生物學特性測定3.1.5 病原菌的ITS 序列分析36-39

35-36

3.2 結果34-35與分析3636-39

3.2.1 病原菌分離與純化與致病性3.2.2 病原菌形態(tài)觀察與部分生物學特性3.3 討論

3.4 結論

41-464143-4543-44參考文獻致謝

39-41

第四章 魔芋軟腐病生物防控研究初探41-4341-434344-4550-51544.1.1 試驗材料4.2 結果與分析4.2.2 拮抗菌的抑菌率4.3 小結附錄

45-46

4.1 材料與方法4.1.2 試驗方法

4.2.1 分離菌4.2.3 藥敏性實驗46-50

縮略詞作者簡介

51-5353-54