第一篇：土壤中放線菌的采集、分離、培養、發酵及提取實驗報告

土壤中放線菌的采集、分離、培養、發酵及提取

實驗目的：

1、從土壤中分離產抗生素的放線菌

2、放線菌的培養

3、放線菌的發酵產生活性物質

4、放線菌產生的活性物質提取。實驗原理：

放線菌是一類呈菌絲狀生長，主要以孢子繁殖。放線菌與人類的生產和生活關系極為密切，目前廣泛應用的抗生素約80%是各種放線菌所產生的。

許多臨床應用的抗生素均由土壤中分離的放線菌產生。采用選擇培養基可分離土壤中的放線菌。產抗生素的放線菌經液體培養后，其分泌的抗生素存在于離心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌試驗進行檢測，從而篩選到所需的抗生素產生菌，并對其進一步培養，繁殖，發酵，最終提取我們所需的抗生素。實驗器材：

1、土壤

2、培養基：高氏一號培養基、種子培養基、發酵培養基

3、其他：重鉻酸鉀、培養皿、牛津杯、接種環、酒精燈，無菌涂棒、三角錐瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、試管、牛皮紙、線繩等。實驗步驟：

一、土壤放線菌株的采集

采集樣品：選定取樣點（最好是有機質含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數次，然后取2～10cm處的土壤。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。

樣品（土壤）處理：室溫風干

二、土壤中放線菌的分離、培養

1、配制淀粉培養基

淀粉瓊脂培養基（高氏培養基）

可溶性淀粉2g；硝酸鉀0.1g；磷酸氫二鉀0.05g；氯化鈉0.05g；硫酸鎂0.05g；硫酸亞鐵0.001g；瓊脂2g；水100ml.先把淀粉放在燒杯里，用5ml水調成糊狀后，倒入95ml水，攪勻后加入其他藥品，使它溶解。加熱到煮沸時加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補足失水。調整PH到7.2-7.4，分裝后滅菌，備用。

2、土壤懸液梯度稀釋

① 將5.0g土壤加入到50ml滅菌的生理鹽水中，震蕩10min制備土壤懸液。

② 用無菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml滅菌的生理鹽水中10倍稀釋。

③ 按1：:1稀釋至10-

3、10-

4、10-5，將3塊滅菌平板分別標記10-

3、10-

4、10-5，稀釋過程應在無菌條件下進行。

3、將高氏一號培養基加熱溶化，待冷至55-60℃時，加入3%的重鉻酸鉀數滴（大約100ml加0.3ml），混合均勻。分別吸取0.1ml稀釋液于滅菌平皿中，再加入10-15ml恒溫于55℃的含有重鉻酸鉀的淀粉瓊脂培養基中，輕輕旋轉混合均勻。

4、平皿倒置于培養箱28℃恒溫培養一周左右。

5、將平皿上的放線菌菌落跳去在淀粉瓊脂平皿上四區劃線進行分離純化，28℃恒溫培養一周左右，觀察放線菌菌落特征。

6、將純化好的菌落轉入到斜面，4℃條件下進行保存。

三、抗菌譜的測定

1、挑取一個放線菌的菌落接種到含有250ml淀粉液體培養基的三角瓶，28℃恒溫培養一周左右。

2、將2ml培養8h的大腸桿菌分別加到200ml滅菌的牛肉膏蛋白胨培養基中混合均勻，每培養皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培養皿中均勻放入4個牛津杯，每個牛津杯中加入1ml放線菌發酵培養液。培養皿放入37℃培養箱恒溫培養12h。

4、測量抑菌圈的大小。

四、發酵

1、配制種子培養基

蔗糖22.5g，黃豆粉12.5g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000ml，PH值7.2,121℃滅菌20min。

2、配制發酵培養基

蔗糖45g，黃豆粉25g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣3g，蒸餾水1000ml，PH7.2。121℃滅菌20min。

3、種子液的制備

將試管斜面菌種轉管活化，28℃培養7天后，以接種取一環孢子轉入裝有50ml種子培養基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-1 培養4天。

4、發酵培養

以6%的接種量將種子液轉接入裝有50ml初始發酵培養基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-

1培養4天。

5、活性檢測

發酵液經4000r/ min-1 離心15min，取上清，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、發酵液經4000r/ min-1 離心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例進行萃取。

2、活性檢測

將萃取液濃縮，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

第二篇：放線菌抗生素的發酵及目的產物的提取實驗報告

放線菌抗生素的發酵及目的產物的提取

一、實驗目的

1、熟悉掌握土壤中分離抗生素及培養方法

2、了解和掌握種子制備和搖瓶發酵技術和方法

3、了解抗生素發酵的一般規律和代謝調控理論

4、了解小型發酵罐的基本結構

5、熟悉掌握小型發酵罐的使用方法和保養

6.掌握抗生素生物效價測定的原理和方法；

7.掌握管碟法測定抗生素生物效價相關的操作方法。8.掌握放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯實驗的基

本原理和操作技術

二、實驗原理

①發酵罐是進行液體發酵的特殊設備。生產上使用的發酵罐容積大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供實驗室使用的小型發酵罐，其容積可從約lL至數百升或稍大些。一般來說，5L以下是用耐壓玻璃制作罐體，5L以上用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動地調控試驗所需要的培養條件，是微生物學、遺傳工程、醫藥工業等科學研究所必需的設備。

②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產物，能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質。現臨床常用的抗生素有轉基因工程菌 培養液液中提取物以及用化學方法合成或半合成的化合物。

③放線菌發酵結束后，次級代謝物可能與菌體結合，工業上常采用草酸或磷酸等酸化劑處理，釋放與菌體結合的次級代謝物，并采用加熱發酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性濾液，在經堿處理，進一步去除蛋白。

抗生素的效價常采用微生物學方法測定，它是利用抗生素對特定的微生物具有抗菌活性的原理來測定抗生素效價的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效價測定的國際通用方法，我國藥典也采用此法。管碟法是根據抗生素在瓊脂平板培養基中的擴散滲透作用，比較標準品和檢品兩者對試驗菌的抑菌圈大小來測定供試品的效價。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內徑6.0±0.l mm，外徑8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管內放人標準品和檢品的溶液，經16~18小時恒溫培養，當抗生素在菌層培養基中擴散時，會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當抗生素濃度達到或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現透明的無菌生長的區域，常呈圓形，稱為抑菌圈。根據擴散定律的推導，抗生素總量的對數值與抑菌圈直徑的平方成線性關系，比較抗生素標準品與檢品的抑菌圈大小，可計算出抗生素的效價。

常用的管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經列入藥典。二劑量法系將抗生素標準品和供試品各稀釋成一定濃度比例（2:1或4:1）的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根據抗生素濃度對數和抑菌圈直徑成直線關系的原理來計算供試品效價。取含菌層的雙層平板培養基，每個平板表面放置4個小鋼管，管內分別放入供試品高、低劑量和標準品高、低劑量溶液。先測量出四點的抑菌圈直徑，按下列公式計算出檢品的效價。

（1）求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式 2.10-2)式中：UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑； UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑； SH：標準品高劑量之抑菌圈直徑； SL：標準品低劑量之抑菌圈直徑；

（2）求出θ： θ=D·antilog（IV/W）(式 2.10-3)式中：θ：供試品和標準品的效價比；

D：標準品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1 I：高低劑量之比的對數，即log2或log4。⑶求出

Pr

：

Pr

=

Ar

×

θ

(式 2.10-4)式中：Pr：供試品實際單位數； Ar：供試品標示量或估計單位

④甲醛滴定法測定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸為兩性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。用甲醛處理氨基酸,甲醛與氨基結合,可形成羥甲基衍生物，使NH3+上的H+游離出來，這樣就可用堿滴定NH3+放出的H+，從而計算出氨基氮含量。如樣品中只含有某一種已知氨基酸，由甲醛滴定的結果即可算出氨基氮的含量。如果樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白質水解物），則滴定結果不能作為氨基酸的定量依據。甲醛滴定法常用于測定蛋白質的水解程度，隨著水解程度的增加，滴定值增加，當水解完全后，滴定值保持恒定。

甲基紅的變色范圍是PH4.4~6.2,意思是說: 1.其pH值在4.4~6.2區間時,呈橙色, 2.其pH值≦4.4時,呈紅色,因是靠近酸性強的一邊時的顏色,故又稱之為酸色。

3.其pH值≧6.2時,呈黃色，因是靠近堿性強的一邊時的顏色,故又稱之為堿色

二、儀器與材料

（一）培養基

高氏一號培養基：

可溶性淀粉 20.0g NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 蒸餾水 1000ml，PH 7.4，發酵瓶培養基：

?淀粉3%,葡萄糖2%, 黃豆餅粉2.5%, 蛋白胨0.5% ，酵母粉0.5%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%, KH2PO4, 0.03%，CaCO3 0.4%, PH 6.0。

?黃豆餅粉 4g, 淀粉10g, 酵母粉0.25 g , 蛋白胨1.5g，MgSO4 0.025 g, CaCO3 0.4g,(NH4)2SO4 0.3 g，α-淀粉酶（105u/ml）0.01ml.100ml PH7.4-7.6 ?可溶性淀粉 2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g，MgSO4.7H2O 0.05g，FeSO4.7H2O

0.001g，加蒸餾水至100ml，PH 7.4，牛肉膏蛋白胨

牛肉膏(5.0g），蛋白胨（10.0g），NaCl（5g），蒸餾水（1000mL），pH 7.2~7.4

發酵罐培養基(2L)：

黃豆餅粉 80g 淀粉 200g 酵母粉 5 g 蛋白胨 30g MgSO4 0.5 g CaCO3 8g(NH4)2SO4 6 g ?-淀粉酶（105u/ml）0.2ml（二)流加補料

碳源：葡萄糖（10%）300ml,控制1%；2000*1%=20g,200ml 氮源：硫酸銨（10%）250ml,控制16% 調PH值：0.1MHCl 0.1MNaOH（三)分析指標及方法所用試劑及溶液

?測殘糖-DNS法

1.3，5二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）：將6.3g的3，5二硝基水楊酸和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到1000ml

2.1.0mg/ml葡萄糖溶液：稱取1g葡萄糖，加蒸餾水定容到1L。

3.6mol/l氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉24g,加蒸餾水定容到100ml。

4.6mol/l的鹽酸：取濃鹽酸49.68ml,加蒸餾水定容到100ml。

?測殘氮的方法-甲醛法

1.甲基紅：0.1g甲基紅，用95%乙醇定容100ml。2.0.3mol/LHCL：取濃鹽酸2.48ml,加蒸餾水定容到100ml。3.0.02858mol/L NaOH：稱0.11432g,定容100ml。4.1%酚酞指示劑：稱取1g酚酞指示劑粉末。溶于100ml 95%乙醇溶液中。

5.95%乙醇：取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值100ml。

6.18%中性甲醛：取48ml 38%的甲醛加入小于100ml容量瓶，往溶液中加兩滴酚酞用氫氧化鈉滴定剛好變紅，定容到100ml。

（四）器材

玻璃試管、試管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養箱、恒溫箱、臺秤、5L-發酵罐，無菌室、培養皿（直徑9 cm）、陶瓦蓋、鋼管、鋼管放置器、恒溫培養室、滅菌刻度吸管、玻璃容器、稱量管、毛細滴管、天平、直尺或游標卡尺、超凈工作臺，無菌培養皿，酒精燈，牛津杯，鑷子，移液器等等

（五）.生物效價測定所需材料

（1）菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），菌液濃度約為

106個/mL。菌株保存的時間過久，影響其對抗生素的敏感度，導致抑菌圈變大、模糊或者出現雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣的結果。因此，菌液在使用一段時間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數。

（2）抗生素標準品和供試品：頭孢拉定標準品和供試品。（3）培養基：效價檢定用培養基1號。

（4）無菌緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59g，磷酸二氫鉀0.41g，加水1000mL，即為pH 7.8的磷酸鹽緩沖液。制備緩沖液的試劑應為分析純，配制后的緩沖液應澄清，分裝于玻璃容器內，經121℃蒸氣滅菌30 min備用。（5）草酸，10 M NaOH

四、實驗步驟

⑴篩選高產放線菌

從土壤里篩選出高產放線菌，于斜面培養基中保藏

⑵接種

在超凈工作臺上，將長好的斜面孢子用無菌接種針挖塊約0.5×1cm，接種于滅過菌的高氏一號培養基中。

⑶培養 2 將接種好的種子搖瓶于28℃恒溫室搖床上，轉速為200r/min，培養48小時左右。

⑷實罐滅菌

1、將冷凝水管路斷開，拔下電極，打開罐蓋，將發酵培養基裝入發酵罐及補料瓶，易產生泡沫的培養基盡量不要超過兩升。

2、連接管路：取樣管路連接，補料管路連接；空氣過濾器用硅膠管與罐蓋空氣管連接，并用彈簧夾夾緊；排氣口與過濾器用硅膠管連接；安裝溫度電極、pH電極、溶氧電極，pH電極用們帽蓋緊電極上端口，溶氧 電極用鋁鉑紙包裹電極上端口，防止受潮。蓋緊其它罐蓋接口。

3、提起玻璃罐體及補料瓶放入滅菌鍋，蓋好牛皮紙，蓋好鍋蓋，確定發酵溫度及時間。

4、滅菌結束后，盡快將罐放回原位并盡快通入空氣。

⑸發酵操作

1、將滅菌后的罐體放回原位，連接冷凝水管路，通入冷凝水，連接通氣管路，調整通氣量至3～5L/min。

2、將溫度電極、pH電極、溶氧電極與控制器連接。

3、補料管連接：打開補料蠕動泵防護蓋，搬開進出口處的白色管夾，將硅膠管嵌入入口處的管夾并夾緊，用手轉動泵頭，將硅膠管沿凹槽安裝直至出口處，開手動開關約十秒后夾緊出口處管夾，關手動開關；將酒精棉球放在罐蓋補料口內，將針頭插入并穿透密封蓋； 打開蠕動泵手動開關，使輸液管中充滿料液，置于自動狀態。

⑹接種

將培養48小時的搖瓶種子接種于發酵罐中，使用接種圈放置酒精棉點燃，進行無菌接種，接入100ml種子。接種后立即進行第一次取樣。

⑺發酵生產

⑻發酵過程的測定：

?發酵液狀態觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態

?發酵中殘糖的測定-DNS法：

1.取1.0mg/ml葡萄糖標準溶液，按下表加入試劑。沸水浴加熱5min，冷水冷卻定容至25ml搖勻，在520nm按波長測吸光度。

編號

葡萄糖標準溶液/ml

水/ml

溶液糖含量/mg

DNS試劑/ml 0 1 2 0 2 0 0.2 0.4 0.6

1.5 1.5 1.5 1.5 0.2

1.8 0.4

1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 3

0.6 4

0.8 5 1.0

0.8

1.5 1.0

1.5 1.2

1.5 1.5 1.5 6

1.2 7

1.4 8

1.6

0.6

1.4 0.4

1.6

2.取發酵液0.5ml置于50ml容量瓶中，加6mol/l的鹽酸溶液2ml，在沸水溶液中加熱15min水解，冷水冷卻后及時6mol/l氫氧化鈉溶液1.8ml，并定容到50ml的總糖水解液。

3.取總糖水解液2ml于25ml比色管中，加入DNS試劑1.5ml沸水浴中加熱5min，冷水冷卻后定容至25ml搖勻，以空白作對照在520nm波長測吸光度。

?氨基酸氮的測定：甲醛法(陳鈞鳴和徐玲娣,1991)。取2ml發酵液濾液于三角瓶內,加蒸餾水10ml,甲基紅指示劑2滴,用O.3MHCI調節pH至溶液呈紅色,再用0.02858MNaOH溶液調pH至溶液呈橙色(中性),加18%中性甲醛溶液4ml,搖勻,靜置10min,加l%酚酞指示劑8滴,用0.02858NNaOH標準溶液滴定至微紅色為終點。氨基氮的計算公式為:氨基氮(mg/l00ml)=滴定體積*20。

⑼放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯實驗的

1、配制培養基高壓滅菌。

2、倒平板。

3、涂布指示菌。

4、以無菌操作在培養基表面直接垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙。

5、收集發酵液，緩緩加入草酸將發酵液酸化至pH 1.4-3.0左右，70 ℃，2 min，以10000 rpm離心20 min。

6、取上清加入水稀釋20%左右，在4℃，用10 M NaOH中和至pH6.4-6.8。

7、吸取中和液100 μL 加入牛津杯中，37℃培養16hr，觀察結果。

⑽效價測定 1.稱量

稱量前，將抗生素標準品和供試品從冰箱取出，使與室溫平衡，供試品應放于干燥器內至少30 min方可稱取。供試品與標準品應用同一天平；吸濕性較強的抗生素在稱量前1~2小時更換天平內干燥劑。標準品稱量不可少于20 mg，取樣后立即將稱量瓶或適宜的容器及被稱物蓋好，以免吸水

稱樣量的計算W=V*C/P(式 2.10-4)式中：W：需稱取標準品或供試品的重量（mg）

V：溶解標準品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積量（mL）

C：標準品或供試品高劑量的濃度（U/mL，μg/mL）P：標準品的純度或供試品的估計效價（U/mg，μg/mg）2.稀釋

從冰箱中取出的標準品溶液，必須先在室溫放置，使其溫度達到室溫后，方可量取。標準品或供試品溶液的稀釋應采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2 mL，稀釋步驟一般不超過3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開始放溶液。稀釋標準品與供試品用的緩沖液應同一批和同瓶，（預計不夠時，應事先與另一瓶混勻后再用），以免因pH或濃度不同影響預定結果。稀釋時，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準確補加至刻度。標準品與供試品高低濃度之比為2:1或4:1，但所選用的濃度必須在劑量反應直線范圍內。3.雙碟制備

在超凈工作臺上，用滅菌大口吸管（20 mL），取已融化的培養基20 mL注入雙碟內，作為培養基的底層，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋覆蓋，放置20~30 min，備用。取出試驗用菌懸液，按已試驗適當的菌量（高濃度所致的抑菌圈直徑18~22 mm），用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水浴中（一般細菌48~50℃，芽孢可至60℃）的培養基內，搖勻作為菌層用。用滅菌大口5mL吸管，吸取菌層培養基5 mL，使均勻攤布在底層培養基上，置水平臺上待凝固，用陶瓦蓋覆蓋，放置20~30 min，備用。4.放置鋼管

用鋼管放置器，或其他方法將鋼管一致、平穩地放入培養基上，鋼管放妥后，應使雙碟靜置5~10 min，使鋼管在瓊脂內稍下沉穩定后，再開始滴加抗生素溶液。5.滴加抗生素溶液

每批供試品取5~10個雙碟，滴加溶液用毛細滴管或定量加樣器，在滴加之前須用滴加液洗2~3次。在雙碟的4個鋼管中以對角線滴加標準品與供試品溶液的高、低二種濃度的溶液，滴加順序為SH→TH→SL→TL，也可用SL→TL→TH→SH。（S代表標準品，T代表供試品，H代表高濃度，L代表低濃度），滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴散時間不同影響測定結果。滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩置于雙碟托盤內，雙碟疊放不可超過3個，避免受熱不均，影響抑菌圈大小，以水平位置平穩移入35~37℃恒溫培養室，培養至所需時間。

6.抑菌圈測量

用直尺或游標卡尺測量抑菌圈的直徑，以毫米為單位，誤差不超過0.1mm。

五、結果與計算

根據實驗測量的抑菌圈大小，計算抗生素供試品的效價單位。

第三篇：實驗2 土壤中稀有放線菌的分離--土壤樣品采集

實驗2 土壤中稀有放線菌的分離--土壤樣品采集 1 目的

1.1 了解微生物分離和純化的原理 1.2 掌握常用的分離純化微生物的方法 2 原理

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。本實驗將采用不同的培養基從土壤中分離不同類型的微生物。3 材料 3.1 培養基

淀粉瓊脂培養基(高氏I號培養基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，馬丁氏瓊脂培養基，查氏瓊脂培養基。3.2 儀器或其它用具 取樣鏟、塑料袋、記號筆、1．布點：按照土壤類型和作物種植品種分布，按土壤肥力高、中、低分別采樣。一般150-300畝（不同地區可根據情況確定）采取一個耕層混合樣，采樣點以鋸齒型或蛇型分布，要做到盡量均勻和隨機。應用土壤底圖確定采樣地塊和采樣點，并在圖上標出，確定調查采樣路線和方案。

2．采樣部位和深度：用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣0.5-1kg，在采樣過程中，采取的混合樣一般都大于該重量，所以要去掉部分樣品，將所有采樣點的樣品攤在塑料布上，除去動植物殘體、石礫等雜質，將大塊的樣品整碎，混勻，攤成園形，中間劃十字分成四份，然后對角線去掉兩份，若樣品還多，將樣品再混合均勻，再反復進行四分法，直至樣品最終重量要求0.5-1公斤（試驗用的樣品2公斤）為止。如下示意圖。一用取土器或鋤頭直接挖入耕層取樣。每個點切取的土塊寬度、厚度應基本一致。裝入事先準備好的塑料袋內扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm處取樣。

3．采樣方法、數量：1)面積小，地勢平坦，肥力均勻的田塊，采用對角采樣法。2)面積中等，地勢平整，有些肥力差異的田塊采用棋盤式采樣法。3)面積大，地勢又不平坦，肥力不勻的田塊采用蛇型線采樣法。土樣由20個樣點組成。樣點分布范圍不少于3畝（各地可根據情況確定）。每個點的取土深度及重量應均勻一致，土樣上層和下層的比例也要相同。采樣器應垂直于地面，入土至規定的深度。采樣使用不銹鋼、木、竹或塑料器具。樣品處理、儲存等過程不要接觸金屬器具和橡膠制品，以防污染。每個混合樣品一般取1kg左右，如果采集樣品太多，可用“四分法”棄去多余土壤。

4．樣品編號和檔案紀錄：做好采樣記錄：土樣編號、采樣地點及經緯度、土壤名稱、采樣深度、采樣日期、采樣人等。

第四篇：實驗二_____土壤中放線菌的分離

實驗講義5 土壤中枯草芽孢桿菌分離方法

取土樣時最好選取如花壇等地方的土樣，去掉表層5~10cm的土壤后取樣。

放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常壓加熱至水沸騰后維持20min，取出，置28-37攝氏度培養24-48h，液面則產生黃白色皮膜。用接種環取皮膜適量于無菌水中分散，稀釋涂布于蔗糖豆芽汁瓊脂平皿，置28-37攝氏度培養24-48h，挑取典型菌落。

實驗6

土壤中放線菌的分離（實訓）

實驗目的：1掌握配制合成培養基的一般方法。

2掌握稀釋倒平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術。3掌握平板劃線法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術。4掌握涂布平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術。

實驗材料：

藥品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、瓊脂。其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無菌培養皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。

實驗原理：

高氏一號合成培養基是培養放線菌的培養基。這種培養基是采用化學成分完全了解的純試劑配制而成的培養基，高氏一號培養基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O 作為無機鹽，FeSO4?7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成。

放線菌是重要的抗生素產生菌，主要分布在土壤中，其數量僅次于細菌，一般在中性偏堿性、有機質豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據放線菌的營養、酸堿度等條件要求，常選用合成培養基或有機氮培養基。如果培養基成分改變，或土壤預先處理（120℃熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數滴10%酚等），都可以使細菌，霉菌出現的數量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養基上形成單獨菌落，并可得到純菌株。

實驗步驟：

1.高氏一號合成培養基的制備

高氏一號瓊脂培養基（培養放線菌用）

可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。

配制時，先用冷水，將淀粉調成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補足水分至1000ml。112℃滅菌20分鐘。

2.土壤中放線菌的分離（1）待測樣液的制備

選定取樣點（最好是有機質含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數次，然后取2～10cm處的土壤。盛土的容器應是無菌的。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應盡快投入實驗。

稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10～20min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液，靜置30s。另取裝有9ml無菌水的試管3支，編號10-

3、10-

4、10-5。用無菌吸管無菌操作取10-2濃度的土壤懸液1ml并加入編號10-3的無菌試管中，并吹吸吸管2~3次，使與9ml水混勻，即為10-3濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個稀釋度換1支無菌吸管）。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進行。（2）稀釋倒平板法分離土壤中放線菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分別從10、10菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號10、10的培養皿內。將溫度為45～50℃的高氏一號培養基倒入上述各培養皿內，輕輕旋轉使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右），每天觀察培養基表面有無微生物菌落。（3）涂布平板法分離土壤中放線菌

取2套無菌平皿，在皿底貼上標簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-

4、10-5）、組別、姓名、操作日期等。每個稀釋度做一個培養皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一號培養基15~20ml左右，待冷凝成平板。

用無菌吸管從濃度最小稀釋液開始，每次吸取0.1ml加到一組相應編號（10-5）的高氏一號平板上（每次吸取前，吸管要在液體內吹吸幾次），再依次將10-4的土壤稀釋液加到相應平板上。用無菌刮棒（從濃度小的稀釋液開始）將加入平板培養基上的土壤稀釋液在整個平板表面涂勻。（4）平板劃線法分離土壤中放線菌

取一培養皿置于實驗臺上，左手將培養皿打開稍許，向培養皿內注入熔化的營養固體培養基10～12毫升，輕輕轉動培養皿，使其中的培養基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個區。每組兩個平板培養基。

將培養皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁取少許10-2濃度的土壤稀釋液，迅速送入培養皿內，在平板培養基的一邊，作第1次平行劃線 6～7條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養皿邊緣，也不要將培養基劃破。（5）培養

接種完畢，將平皿放入28℃恒溫箱培養7天，觀察平皿上放線菌（主要是鏈霉菌）菌落。（6）挑菌落

待三種方法的平板長出菌落后，鑒定微生物類群，并根據鏡檢結果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉移到斜面培養基上進一步培養。轉種至斜面，菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。

準備實驗內容：

問曾老師借 無菌刮棒 打火機 酒精燈

無菌報紙包（1個）

99mL水/三角瓶（玻璃珠）

5支移液管 3支9mL水的試管

培養皿6套 槍頭（1mL/0.1mL）

高氏一號培養基500mL（150mL三角瓶2個，200mL試管）思考題：

1.檢查接種后培養物的生長情況和染菌情況。

2.觀察與記錄以下內容。

大小

形狀

邊緣顏色

表面代謝物

種類 3.如何區分放線菌和真菌、細菌？

放線菌菌落小而緊密、干燥、不透明、難以挑取，當大量孢子覆蓋于菌落表面時，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，由于基內菌絲和孢子常有顏色，使得菌落的正反面呈現出不同的色澤。霉菌菌落的話應該是比較大的，可能是大而疏松也可能大而緊密，其他一些跟放線菌都差不多，比如都是顏色多種多樣，與培養基緊密結合難于挑取。但在氣味上有很大差別，放線菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。還有一點就是放線菌菌落周圍瓊脂平面會有變形的現象。若稀釋平板的稀釋度不夠，放線菌會被抑制了或者菌落太小，而其他細菌的菌落又太多，不容易找到。

第五篇：土壤微生物的分離培養技術實驗報告

重慶大學研究生專業實驗教學

實驗報告書

實驗課程名稱： 實驗指導教師： 學

院： 專業及類別： 學

號： 姓

名： 實驗日期： 成績：

重慶大學研究生院制

一、實驗目的

1、了解分離與純化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培養基的方法與平板劃線分離的基本操作技術；；

3、學習習近平板菌落計數的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步觀察來自土壤中的幾類微生物的菌落形態特征，并能判斷菌的類型。

二、實驗原理

1、培養基的種類

培養基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質，用以培養、分離、鑒別、保存各種微生物或積累代謝產物。一般的培養基應包含適合微生物生長的6大營養素即水分、碳源、氮源、能源、無機鹽和生長因子。培養基的種類很多，根據培養成分的不同可分為天然培養基、合成培養基與半合成培養基；根據物理狀態的不同又可分為液體培養基和固體培養基。微生物的分離、純化、記數等方面的研究常常使用的就是固體培養基。本實驗就是使用的固體培養基。

已配制好的培養基必須立即滅菌，如來不及滅菌，應暫存冰箱，以防止其中微生物生長繁殖而消耗養分和改變培養基酸堿度所帶來不利影響。

培養基的原材料來源十分廣泛，本實驗采用的原材料為土豆。

2、接種方法與無菌接種

將微生物的培養物或含有微生物的樣品移植到培養基上的操作技術稱之為接種。接種是微生物實驗及科學研究中的一項最基本的操作技術。接種的關鍵是要嚴格的進行無菌操作。微生物的接種方法很多，劃線接種、三點接種、穿刺接種、混澆接種與涂布接種是幾種常用的接種方法。

劃線接種是最常用的接種方法，即在固體培養基表面作來回直線形的移動，就可以達到接種的目的。常用的接種工具為接種環、針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。三點接種是把少量的微生物接種在平板表面，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察研究它們的形態。研究霉菌形態時就常用此法。

穿刺接種是用針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺。該法常用于厭氧菌種的保藏或微生物的動力研究。

混澆接種是先將待接的微生物放入培養皿中再倒入冷卻至45℃左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就被稀釋了。待平板凝固后，置于適宜溫度下培養，就可以長出單個菌落的微生物。

涂布接種是將菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可以長出單個菌落的微生物。

本實驗采用的是劃線接種。為了防止接種時引入其它微生物，整個操作過程均需在無菌操作臺上進行，還需對操作員的雙手進行酒精消毒，每次劃線前都需灼燒接種環，接種時才打開培養皿且不能全部打開，接種完馬上關上。

三、實驗器材

1、儀器

培養皿、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、酒精燈、玻璃棒、接種環、15ml離心管、試管架、鑷子、電磁爐、鍋、恒溫培養箱、高溫滅菌鍋、無菌操作臺、酒精燈、天平、濾紙等。

2、材料

土豆、瓊脂、蒸餾水、酒精、土壤樣品

四、實驗步驟

1、土壤稀釋液的配制

① 在菜地用九點取樣法取適量土壤樣品，具體操作為：在菜地選取九個取樣點，在每個取樣點取相同量的表層土壤（10cm左右），然后將其混合均勻；

② 稱取1g土壤樣品與99ml蒸餾水，將其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸餾水于15ml離心管中，再用移液槍取1ml前一步已配制的土壤溶液于離心管中，搖勻，即為10-3的土壤溶液；

④ 重復前一步，將土壤溶液稀釋為10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀釋液。

2、土豆培養基的制備

① 用天平稱取200g土豆，清洗干凈后去皮切丁；

② 用量筒量取1000ml蒸餾水與電磁爐鍋中，再加入已準備好的土豆，將其煮爛；

③ 從鍋中取出已煮爛的土豆，用紗布過濾，濾液待用； ④ 稱取20g瓊脂與濾液中，再用蒸餾水定容至1000ml；

⑤ 在制備好的濾液中加入0.1ml菌液，然后放入高溫滅菌鍋中，在121℃下滅菌20min；

⑥ 取出已滅菌的土豆培養基，待其熔化后冷卻至60℃，倒入每付平板約15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接種與分離

① 將接種需要的所有器材均放置于無菌操作臺上；

② 用浸泡在酒精里棉花給雙手滅菌，點燃酒精燈，右手拿接種環，左手拿培養基；

③ 將接種環放在火焰上燒灼，待其冷卻后在10-6土壤稀釋液中蘸取少量液體，打開培養基的一部分，采用劃線接種，使之形成單菌落，一共劃線3-4次，每劃線一次就需在火焰上燒灼一次；

④ 重復上步，接種10-

7、10-8的土壤稀釋液的微生物；

⑤ 接種完的培養基放在恒溫培養箱中倒置培養48h，取出觀察。

五、結果與思考

1、實驗結果

圖1 實驗結果如圖1所示。由圖1可知，采用劃線接種土壤微生物的培養皿里有單菌落出現，這說明劃線接種能達到分離培養的目的。

學習過微生物這門課程的同學都知道，真菌的菌落較大且疏松，菌絲細長，呈絨毛狀、蜘蛛網狀、棉絮狀，無固定大小，多有光澤，不易挑，孢子會呈現紅色、褐色、綠色、黑色、黃色等不同的顏色；細菌的菌落較小，形狀表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多為白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有細菌。

2、思考題

⑴在平板劃線法中，為什么每次都需要將接種環上的剩余物燒掉？

答：這么做的主要目的是殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，以使下次劃線的菌種直接來自于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少，從而達到分離菌株的目的。

⑵為什么要把培養皿倒置培養？

答：①操作時培養皿蓋上可能粘有水珠或者細菌，倒著培養可以避免培養皿蓋上的水珠或者微生物落在培養皿上；

②培養過程中，細菌在代謝繁殖過程中會產生一些有害于細菌生長繁殖的代謝物，釋放熱量及有水排出，如果不倒著培養會有水珠滴落到培養基中，影響菌落的生長;③如果培養目標是收集細菌代謝物，而且代謝物易溶于水，倒著培養可能會方便收集。

六、實驗總結 我本科所學專業是材料科學與工程，本次實驗是我高中后第一次接觸微生物方面的知識。在本次實驗課里，段老師先給我們詳細講解了微生物分離培養方面的許多理論知識，然后才進入了理論環節。在實驗操作過程中段老師一直在我們旁邊觀察我們的實驗操作過程，一旦出現錯誤，會立即指出并耐心的給我們講解應該怎么做，我擔心自己從來沒做過微生物培養方面的實驗會做不好，段老師還一直在旁邊鼓勵我，并給我講解了許多微生物分離培養方面的知識，最后我獨立完成了本次實驗。此次實驗課，我真的是受益匪淺，學到了許多微生物分離培養方面的知識，十分感謝段老師。

圖2 如圖2所示，本次微生物分離培養實驗中，有些培養皿里菌落很少，只有一個，有的甚至沒有。我認為出現這種情況原因可能是：劃線接種時，未等接種環冷卻就開始接種，微生物可能被高溫殺死；在接種時，酒精燈火焰太大，進行接種操作的全過程又離酒精燈火焰很近，這也可能將微生物殺死。