第一篇：蛋白質組技術平臺舉例

蛋白質組技術平臺舉例

北京蛋白質組研究中心功能蛋白質組研究技術平臺是國際人類肝臟蛋白質組計劃（HLPP）表達譜和修飾譜項目的實施平臺之一，目前擁有國際先進的蛋白質分離、鑒定系統，配以MALDI-TOF-MS、MALDI-TOF-TOF-MS、ESI-Q-TOF-MS、ESI-Ion Trap-MS等大型質譜設備以及超級計算機檢索系統，形成了高通量、高靈敏度、高分辨率和規模化的蛋白質組研究技術平臺，結合相應的標記技術（DIGE、ITRAQ、SILAC等）和富集技術（IMAC等），平行構建了差異蛋白質以及修飾蛋白質的鑒定技術，目前已經開展重大疾病，尤其是肝臟疾病和腫瘤相關的蛋白質組研究，為下一步重要藥物靶標的發現奠定了基礎。平臺現可承接一些單項的蛋白質組學技術服務, 同時平臺也開展規模化、高通量的蛋白質組學委托科研服務。服務項目包括樣本制備、雙向電泳、圖像分析、膠內酶切、蛋白質鑒定、數據庫查詢與結果分析、免疫印跡及磷酸化蛋白質檢測。

一、樣品制備技術

1.適于雙向電泳的蛋白質提取及定量；

2.亞細胞器提取及純度評價（質膜、線粒體、內質網、細胞核、胞漿）；

3.Beckman公司 Optima? L-80 XP超速離心機；

4.Beckman公司 Avanti? J-25高速離心機。

二、電泳及電轉系統

1．BIO-RAD公司PROTEAN IEF Cell等電聚焦儀；

2．BIO-RAD公司PROTEAN II xi Cell電泳槽；

3．BIO-RAD公司Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Module/Mini Trans-Blot Module；

4．Amersham pharmcia Biotech公司IPGphor等電聚焦儀；

5．Amersham pharmcia Biotech公司Ettan DALT II System；

6．Amersham pharmcia Biotech公司Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer

Unit；

7．圖像分析軟件BIO-RAD公司 PDQuest? 2-D analysis software version:7.11；

8．圖像分析軟件Amersham pharmcia Biotech公司Image Master? 2D version:5.0；

9．自動切膠酶解系統為BIO-RAD公司Spot Cutter；WATERS公司 MassPrep；

10．Amersham pharmcia Biotech公司Spot Handling Workstation。

三、蛋白質組學中的核心質譜技術

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜MALDI-TOF-MS可測定生物大分子的分子量高達600KDa。通過肽質量指紋譜（PMF）和肽序列標簽（PST）技術可高靈敏度、高通量、快速鑒定蛋白質，是蛋白質組學研究必不可少的生物質譜，也是臨床蛋白質組學首選的技術。還可分析寡核苷酸序列、多糖結構、聚合物分子量分布、特殊合成化學品等。

美國ABI公司MALDI-TOF/TOF質譜儀 能從一個樣品PMF圖譜中選擇幾個肽離子進行片斷化和MS/MS分析,而且分析可在數秒或數十秒內完成。該儀器是目前進行高通量蛋白質組分析非常理想的儀器。

電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜儀ESI-Q-TOF-MS自動化LC-MS/MS肽段測序功能，是多肽組學研究的重要技術。樣品用量少，僅fmol樣品就可測序（如電泳膠）。

離子阱串聯質譜儀ESI-Ion Trap-MS 中心具有兩臺離子肼串聯質譜，高通量LC-MS/MS肽段測序功能，為SHOTUGUN技術首選串聯質譜。

第二篇：東華大學生物科學與技術研究所蛋白質研究組招聘博士后研究人員

東華大學生物科學與技術研究所蛋白質研究組招聘博士后研究人員

本研究組主要從事原核生物基因內含子的鑒定、結構與功能以及剪接機理的研究；

2、功能基因中蛋白質內含子的結構與功能、進化與應用的研究；

3、應用蛋白質剪接技術開發蜘蛛絲蛋白的研究。本課題組現因研究工作需要，擬招聘2-3名博士后，待遇按照東華大學統一規定。工作出色者，本課題組有能力推薦去北美學習深造。

應聘人員應具備以下基本條件：

1.立志從事科學研究，富有探索精神，思想活躍。

2.具有扎實的生物化學與分子生物學理論知識以及嫻熟的實驗技能。

3.以第一作者身份在 SCI 收錄的英文期刊雜志上發表過研究論文。

4.有責任心和團隊精神。

聯系地址：東華大學生物科學與技術研究所，上海松江人民北路 2999號，郵編：201620

聯系人：孟 清老師

Tel ：0086-21-67792651

Fax ：0086-21-67792647

E-Mail ：mengqing@dhu.edu.cn

應聘者將個人簡歷等，通過以上述聯系方式發送給我們。

第三篇：分子克隆3—蛋白質相互作用研究技術

蛋白質相互作用研究技術

一、雙雜交和其他雙成分系統

二、用GST融合蛋白進行Far Western 印記來檢測蛋白質-蛋白質相互作用

三、用GST融合蛋白沉降技術檢測蛋白質-蛋白質相互作用

四、通過免疫共沉淀確定結合蛋白

五、采用GFP和熒光共振能量轉移技術測定蛋白質相互作用

六、利用BIAcore通過表面胞質基因共振光譜學分析相互作用的蛋白質

七、。。

導言

一、多數蛋白質研究工作可分為四個類別：

1.二、蛋白質-蛋白質相互作用研究的3個層次

1.研究的目的是確定各種可能與目標蛋白相互作用的蛋白質，此時要撒大網，因此生理意義暫時不被看重；

2.感興趣的相互作用蛋白質已被確定，研究的目的是通過詳細分析生物學功能，來確定相互作用的生理學意義和影響。

3.某中相互作用已被發現，并且被證實是生理性的，此時研究的目的是提供一種高通量的方法，以發現能夠按所需的方式調節這種相互作用的試劑。

三、與蛋白質相互作用直接相關的另一領域是分子模建：

四、各種技術應用分析：

1.所列方案（1~6），不能證明觀察到的相互作用是直接或間接的，如果研究目的是確定直接相互作用，最終使用的方法中必須采用純化的蛋白質。

2.特定蛋白質的內在性質在某種程度上決定了哪種技術能有效的用于分析蛋白質相互作用；`` 3.雙雜交和基于GST-融合的篩選方法（方案1，2，3）適用于撒大網式的應用研究。方案2，3只是用來確定體外的相互作用,這種體外的相互作用應當進一步在體內通過單獨的方法來證實。

4.對于相互作用在生理上的證實和探索，采用內源蛋白質的免疫共沉淀（方案4）和FRET（方案5）的方法更可取；

5.為快速分析過去已確定的相互作用，雙雜交和GST沉降分析具有一些明顯的優勢；

一、雙雜交和其他雙成分系統

二、用GST融合蛋白進行Far Western 印記來檢測蛋白質-蛋白質相互作用(一)`引言

1.細菌表達的谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白被用于直接測定蛋白質-蛋白質相互作用，以及親和純化。

2.融合蛋白的設計依賴于所選擇的檢測方法和計劃采用的篩選方式。

[1].對于文庫篩選，將盡可能大的探針蛋白包括進去可以增加檢測到的相互作用的數目。

[2].如果探針蛋白含有已知的相互作用區，并且他們用于證實預期的相互作用，那么僅含有這些結構區域的融合蛋白可能更好。

3.GST成分可以二聚化并能產生背景。

4.籌劃Far Western 印記實驗需要考慮的因素：

[1].最重要的因素是：在沒有過多降解和不溶解蛋白質的條件下合成融合蛋白的能力。

[2].從不同融合蛋白制備物得到的結果可能有所不同，所以監控融合蛋白的狀態是非常重要的，這包括純化期間和純化后，如果蛋白質被存放，還包括使用前后。[3].有助于確認蛋白質-蛋白質相互作用特異性的兩個對照是 a)用融合蛋白突變體探測，這種突變體可以破壞相互作用； b)用標記GST來探測膜。？

[4].最終，還要確定是否用變性/復性循環來探測膜，這樣設計是為了使錯誤折疊的蛋白質重新折疊成天然構像。

a)從SDS-PAGE轉移到膜的蛋白質通常不需要變性和復性，如果在檢測SDS-PAGE時沒有產生蛋白質-蛋白質相互作用，那么引入變性/復性過程可能產生陽性結果； b)在探測表達文庫覆蓋印記的濾膜時，許多研究人員發現變性/復性是必需的步驟。[5].5 5.5(二)實驗方案

1.Materials [1].緩沖液和溶液 [2].2.Methods: [1].放射標記蛋白探針的制備 [2].探測膜

3.3(三)注意事項

三、用GST融合蛋白沉降技術檢測蛋白質-蛋白質相互作用

(一)`引言

1.GST-pull down 利用了GST對谷胱甘肽偶聯球珠的親和性，從非相互作用蛋白的溶液中純化相互作用蛋白。該技術對探測蛋白質在溶液中的相互作用特別有用，而這種相互作用在膜的分析中可能是檢測不到的。2.GST-pull down通常有兩種應用：

1)確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間新的相互作用；

a)未知蛋白可能受濃度的限制，為確定新的相互作用，未知蛋白質必須以足夠的量存在，以使這種相互作用能用所選擇的檢測方法觀察到。b)放射標記的細胞裂解液時最常用的蛋白質來源

c)在實驗前要考慮：實驗目的，探針蛋白的表達等。2)證實探針蛋白與已知蛋白間可疑的相互作用；

a)各種蛋白質來源可用于確定和探詢這種相互作用。

b)用于檢測相互作用的方法是由能否獲得對靶蛋白的抗體來決定的；如果抗體得不到，那么就可利用S標記的體外翻譯蛋白或靶蛋白用表位做標簽。必要時，可用編碼蛋白的質粒轉然培養細胞，以增加分析蛋白質的豐度。c)控制質量作用（如非特異性聚集）的影響，并確認探針蛋白同靶蛋白分子間結合的特異性是非常重要的。

d)結合特異性的最好控制是包括一種帶有突變相互作用域的GST融合蛋白，喪

35失與這種突變探針蛋白的結合就表明靶和探針間的正常結合是特異性的。e)測試假定靶蛋白與GST間的結合也很重要。

3)3

這兩種實驗的設計和實施都有所不同。

3.GST-pull down必須對每個蛋白質復合物的分析進行優化：

1)發生相互作用的緩沖液；

2)與融合（探針）蛋白混合的把蛋白的量；所需材料的量主要由把蛋白的豐度和相互作用的親和力決定（實驗開始時兩個參數通常是未知的。）3)清洗球珠的條件； 4.4(二)實驗方案 A.材料

1.緩沖液和溶液

1）裂解緩沖液：? 2）50%谷胱甘肽瓊脂糖球珠懸液：在裂解緩沖液中配。（Beads are often supplied by commercial vendors in solutions containing alcohols.It is important to wash the beads thoroughly in GST pull-down lysis buffer and to generate a 50/50 slurry of beads in GST pull-down lysis buffer prior to use.）

3）溶于50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)中的還原型谷胱甘肽（20mmol/L）

（glutathione;γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH）

4）

2.專用設備

1)沸水浴

2)翻轉樣品旋轉儀（有，無？）3)谷胱甘肽瓊脂糖球珠 3.細胞和組織 4.附加試劑 B.方法

預清除細胞裂解液

1.將細胞裂解液與50?l的50%谷胱甘肽瓊脂糖球珠懸液和25?g GST在4℃翻轉混合孵育2h（實驗室內如何實現？）。需要檢測相互作用的裂解液的量是高度可變的。開始用1×106~1×107個細胞的裂解液。（細胞裂解液提前制備好是否可以？若提前制備好，放于4℃還是-20℃）

a)預清除步驟主要是從裂解液中除去與GST成分或球珠有非特異性相互作用的蛋白質。b)如果相互作用的檢測主要是用針對候選相互作用蛋白質的抗體，那么做預清除并不總是必須的。包含兩種對照很重要：GST加球珠和僅有球珠。

c)在用35S標記的細胞裂解液用于確定新的蛋白質-蛋白質相互作用時，預清除步驟有助于降低本底。

d)實驗的目的是比較GST與GST融合蛋白，有必要對每個反應制備足夠量的預清除細胞裂解液。（多少算足夠？以蛋白質的濃度定？還是靶蛋白的表達量來定？）

e)試劑有效的混合是成功的關鍵，為達到此目的，反應應在一個合理的體積中進行：一個好的起始值是500~1000?l。

2.在微量離心機上以最大速度在4℃離心混合物2min。（13,000 rpm）3.將上清（就是預清除的細胞裂解液）轉移到新的離心管中。

探測細胞裂解液

4.設定兩個含等量預清除細胞裂解液及50?l的50%谷胱甘肽瓊脂糖球珠懸液的微量離心管。在一個管中加約（~5-10 μg）的GST蛋白，另一管中加約（~5-10 μg）的GST融合探針蛋白。將離心管在4℃翻轉混合孵育2h。兩個反應中加入的探針和對照蛋白終濃度應該是相同的。（終濃度相同的意義是什么？如果融合蛋白不純化，如何確保其濃度相同？）

5.在微量離心機上以最大速度離心樣品2min。（13,000 rpm）（谷胱甘肽瓊脂糖球珠的分子量，其連上蛋白后是否可以沉淀下來？）

6.在新的離心管中收集上清。這些樣品可通過步驟10中的SDS-PAGE進行分析。（進行分析的目的：How much of the interacting protein was depleted from the total cell lysate.以優化實驗條件）

7.用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在微量離心機上以最大速度離心混合物1min。棄去上清。重復洗三次。（4次---cold spring harbor protocol）8.（可選）加入50?l 20mmol/L的還原型谷胱甘肽到球珠中，洗脫GST融合蛋白及任何與其結合的蛋白質。在微量離心機上以最大速度離心2min。（洗脫方法的缺點：若多次洗脫，最后終體積較大，后續上樣較麻煩。所以多數研究者選擇將球珠煮沸以使目的蛋白與GST融合蛋白分離。）

9.將球珠（來自步驟7）或洗脫蛋白質（來自步驟8）與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合。

檢測相互作用蛋白質

10.將樣品煮沸4min并作SDS-PAGE分析。

11.檢測與GST融合蛋白結合的蛋白質的方法取決于細胞裂解液是否被的目的。

5S標記以及實驗a)如果目的是檢測與融合蛋白結合的所有的35S標記的蛋白，就在干膠儀上將膠抽干，并用X線膠片曝光進行放射自顯影。

b)如果目的是檢測特異性結合的蛋白質，就將蛋白質從SDS-PAGE轉移到膜上，進行免疫印跡分析。

c)如果目的是確定與融合蛋白結合的蛋白質的大小和豐度，而這些蛋白質是來自非放射性的裂解液，就用考馬斯亮藍或硝酸銀將膠染色。

(三)注意事項

四、通過免疫共沉淀確定結合蛋白

(一)`引言(二)實驗方案

A.材料 1.緩沖液和溶液 2.專用設備 3.細胞和組織 4.附加試劑

B.方法

(三)注意事項

五、采用GFP和熒光共振能量轉移技術測定蛋白質相互作用

(一)`引言(二)實驗方案

A.材料 5.緩沖液和溶液

6.專用設備 7.細胞和組織 8.附加試劑

B.方法

(三)注意事項

六、利用BIAcore通過表面胞質基因共振光譜學分析相互作用的蛋白質

(一)`引言(二)實驗方案(三)注意事項

第四篇：技術組日常工作

技術組日常工作

1、報表

檢待修井：區隊上報各自檢待修井（附產量、功圖），技術組分析判斷后整理，早上8：00之前報調度和通井工段，并與通井工段溝通，派車檢修

排量：區隊上報各自技措井、二壓井、新井、恢復井、事故處理井產量，技術組整理，早上8：00之前報大隊統計處，同時了解技措井等產能和動態情況

晚報表：技術組每晚20：30之前向調度和大隊統計處上報當天落實情況

2、考勤

早上8：00之前技術組向調度上報技術員考勤情況

3、油井動態

至少每月跟區隊對接一次油井動態

4、設計

通井車上車前技術組出設計、安全技術交底，作業完后技術組視頻審查，收設計、交底單、工單、作業總結

5、現場監督

技術員對上車檢修井、技措井、二壓井、恢復井、事故處理井必須現場監督，嚴把質量和技術關

6、熔蠟

每月選40-50口結蠟嚴重、結蠟周期短的油井與通井工段溝通進行熔蠟（目前我們只有自能熱洗車一部）

7、功圖測試

目前技術組技術員人員較少，在不影響技術組正常日常工作的前提下，要求技術員每月測試一定數量的功圖

8、巡井

每月二次巡井，重點是檢修過的油井，并要求有記錄

9、含水化驗

技術組每月隨機抽選各區隊5-10油井，讓區隊取樣送到技術組，技術組化驗含水情況，并與數據庫對比，化驗完后在調度群里公示

10、停井恢復

每年技術組都會選10--20口停躺井進行恢復，（分析周邊相鄰油井產量、注水受益情況、油井自身資料進行分析，總結出最簡單有效的方法進行恢復）

11、學習

要求技術員自覺學習，不斷增長知識，同時提高自身素養

12、培訓

每月對技術員進行至少二次以上的安全、技術等方面的培訓，并要有培訓記錄

13、資料整理

這是一個長期而漫長的工作（各類資料的統計、新資料的收集、已有的資料分類）

14、采油工程月報 每月初向研究所傳采油工程月報

15、數據庫

每月上傳月度數據、油井檢修管柱數據

16、衛生區

技術員每天8點左右打掃大隊院子

17、其它方面

要求技術員要自律、自愛

第五篇：技術組工作總結

車輛管理大隊技術組工作總結

2010年，技術組在大隊各級領導的正確領導下，緊密圍繞資產設備管理、質量、節能等中心工作，按照油田公司“屬地管理、直線責任”的相關要求，切實把各項工作落到實處。秉承“想干事、會干事、干成事”的工作態度，技術組全體同仁認真履行各項職責，圓滿完成了上級部門安排的工作任務。我們將今年的工作做以下總結：

（一）資產設備管理工作

1.創新車輛修保方式，保證設備完好率

切實履行大隊制定的設備管理工作目標：完好率達到93%以上；利用率達到74%以上；設備責任事故發生率為0 ；

一、二維完成率100%。

設備管理方面采取“三檢制”的管理方式，由駕駛員在每次出車前、行使中、收車后自檢自查。中隊堅持每月不少于兩次的車輛回場檢查，每月一次的車輛技術性能檢查，大隊每季一次的車輛技術性能檢查，并做好記錄。在中隊及大隊的檢查中發現問題能整改的立即整改，不能立即整改的限期整改，大隊每季度對檢查情況進行評比，并將評比結果與獎金掛鉤。

在車輛維護保養方面，技術組根據國家標準GB18565《營運車輛綜合性能要求和檢驗方法》、GB7258《機動車運行安全技術條件》、GB/T 15746《汽車修理質量檢查評定標準》，結合大隊車型具體情況制定了車輛各級維護制度，確定了大隊各類車型的二 級維護基本作業項目，嚴格貫徹落實車輛維護工藝，提高了車輛技術狀況，有效降低了燃油消耗和尾氣排放。同時，編制了符合內部競賽要求的車輛二級維護作業項目、技術要求和評分標準，將工藝標準與節能減排效果有機地結合起來。大隊嚴格執行4S管理標準，針對剎車油（8萬公里更換）、助力油（8萬公里更換）、防凍液（8萬公里更換）、火花塞（8萬公里更換）、傳動皮帶（10萬公里更換）、正時皮帶（8萬公里更換）等部位，根據各自更換里程對這些部位分別進行更換。同時注重“三濾”的維護。空氣濾清器堵塞，會導致空氣流速緩慢，流量減少，空氣與燃油的混合比例失調，一方面造成發動機耗油，另一方面由于混合氣太濃，燃燒不徹底，排放物超標，對環境造成污染。在車輛二級維護中，大隊認真做好空氣濾清器、機油濾清器和柴油濾清器的清潔工作。

技術組針對車輛保養周期短、次數多，實際效果不明顯的問題，大隊延長了單車保養周期，將原本每季度一次的保養周期改為現行的四個月一次，這樣不僅最大限度的利用了設備資源，同時也降低了保養費用。另外，大隊改進了車輛機油更換制度，將原有的機油更換里程從5000公里提升至7000公里，這樣更加符合大隊的生產實際，也避免了不必要的浪費。2.重視基礎資料管理

重視基礎資料的重要性，堅持將資料統計分析做為開展一切工作的前提。車輛管理大隊匯集了全廠20多種車型，各種車型 的使用條件、年限差異造成了復雜的技術狀況，為了逐步提高車輛綜合管理水平，完善各種基礎數據，技術組組織相關人員到廠檔案室查找說明書，利用網絡查找車輛的有關數據。始終堅持將資料統計分析做為開展各項工作的第一要素，有效提高了工作準確率。堅持以統計分析結果結合現場情況開展工作，使設備管理工作做到重點突出、工作有序。為車輛管理大隊的設備管理工作打下了堅實的基礎。

設備的轉資：對于2010年所購入設備，包括車輛、計算機、打印機、空調等，及時、準確將有關數據錄入，完成轉資，使大隊的帳物相符。

裝備計劃和報廢管理：根據要求每年兩次裝備計劃申報。能夠根據生產的需要填寫裝備計劃申報表，報廢申報時把大隊設備中到報廢年限和不需用設備上報及時，做到不漏報，避免造成不良后果。

檔案管理：提高對檔案管理的重視程度，通過對大隊檔案室安裝空調、防火窗簾等設備，加大檔案的管理力度，使檔案管理工作做到有條不紊、萬無一失、真實準確。

同時，對車輛臺賬、報表等資料做到精細填寫，及時做好車輛回廠檢查記錄、一維記錄和小修記錄，確保資料的準確無誤。3.開展同車型紅旗車檢查評比活動

為提高駕駛員業務能力、車輛使用和維護的水平，保障車輛的技術狀況。調動駕駛員工作積極性，提高服務質量和車輛完好 率、利用率。根據廠領導的指示，資產科的要求加強資產設備管理工作力度，提高車輛檢查保養和維修質量，使大隊管好、用好車輛，實現節能降耗，在大隊內部開展同種類車型紅旗車檢查評比活動，在同種車型之間形成比、學、幫共同提高的氛圍，做好車輛的維護、保養工作，提高車輛的技術狀況，同時提高了駕駛員的業務能力和綜合素質及崗位服務質量，樹立了窗口形象。

（二）技術監督中心具體工作

1.切實做好質量工作。針對質量工作中存在的薄弱環節，緊抓質量法律法規政策的學習，努力熟悉質量工作。同時積極參加上級部門組織的各類質量培訓。通過參加高升采油廠組織的質量培訓，對質量管理體系以及質量法規制度有了較系統的了解，豐富了質量知識。通過 “2010質量月活動”的培訓學習，認識到質量體系工作的重要性，對今后的工作起到了很大的幫助。2.進一步明確節能工作方向，充分認識節能工作的重要性和現實意義。嚴格按照《高升采油廠2010年節能節水工作部署》的要求，積極構建適合車輛管理大隊的節能管理體系。嚴格要求、精細管理，注重源頭防治，在日常工作中加強監督，并配合大隊一系列的管理制度及規定，落實大隊節能、節水管理辦法，加強日常管理，并不定期進行檢查。認真完成好各級部門分配的各項工作。積極研究探索工作中遇到的各種問題，同時開展“節能宣傳周”活動。通過活動，極大地激發了大隊職工對節能減排工作的熱情、有效地促進了車管大隊節能工作的開展，提高了大隊員 工的環保意識。

（三）存在的不足

在廠四季度目標考核中，考核小組指出了工作中的不足之處，為技術組以后的工作提供了幫助。具體情況如下：

1、無本單位規范且簽發的資產設備管理制度；執行記錄（管理活動記錄、檢查記錄、文件制度發放記錄）不全；管理臺賬（裝備購臵臺賬、資產修理臺賬、資產變動臺賬及綜合臺賬）不完善。

2、應急預案內容需完善。

3、遼L-11774直拉桿球頭曠，遼L-22083右主襯套壞、右剎車油管老化。

4、無質量分析會記錄、質量培訓無教案。

日常工作中難免存在著疏忽與不足，敬請各位領導批評指正。