第一篇：分子實驗

分子生物學實驗設計方案

學院： 專業班級： 課程： 實驗名稱： 組員： 實驗日期：

一、實驗目的

1、學習與掌握利用ITS序列鑒定真菌的原理；

2、掌握用ITS序列鑒定真菌的方法有步驟。

二、實驗原理

1、菌物是真核生物的重要類別，傳統的菌物分類以子實體形態特征和生理生化指標為分類基礎，由于部分菌物的子實體不易獲得，形態特征不易掌握，少數形態特征和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定，是傳統的菌物鑒定工作困難或分類系統意見分歧。內轉錄間隔區ITS(internal transcribed space), 位于5.8S和18S之間（ITS1）以及5.8S和28SrDNA之間(ITS2)，ITS1和ITS2常被合稱為ITS，并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之內。近年來，利用真核生物在rDNA的ITS區域既具保守性又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS區進行PCR擴增、測序。隨著核糖體rDNA ITS序列分析技術在菌物研究中的應用，一些分類地位不明確、親緣關系不清楚的物種通過該技術得到了解決，一些重要的菌物遺傳信息得到闡明。

2、ITS（Internal Transcribed Spacer）：內轉錄間隔區。是真菌核糖體RNA（rRNA）基因非轉錄區的一部分。用于真菌鑒定的ITS序列通常包括ITS1、5.8 S 和ITS2。真菌ITS 區域長度一般在650 ～750 bp(堿基對)。

ITS（Internal Transcribed Spacer）鑒定是指對ITS序列進行DNA測序，通過將測序得到的ITS序列與已知真菌ITS序列比較，從而獲得未知真菌種屬信息的一種方法。

ITS鑒定的原理：rDNA 上的5.8、18 和28 SrRNA 基因有極大的保守性, 即存在著廣泛的異種同源性。而由于ITS 區不加入成熟核糖體, 所以ITS 片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小,因此能容忍更多的變異。在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣泛的序列多態性, 即使是親緣關系非常接近的2 個種都能在ITS 序列上表現出差異, 顯示最近的進化特征。研究表明,ITS 片段的進化速率是18 S rDNA 的10 倍。這就是ITS 序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎。ITS1 和ITS2 是中度保守區域, 其保守性基本上表現為種內相對一致, 種間差異比較明顯。這種特點使ITS 適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析。由于ITS 的序列分析能實質性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異, 此外ITS 序列片段較小、易于分析, 目前已被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的系統發育研究中。ITS 的序列分析還有效地解決Lenti nul a、Suill us、Tuber、Cer at ocystis 和Oi diodendron等真菌應用形態學特征進行分類所引起的紛爭, 彌補了傳統分類上的一些不足。

ITS 鑒定的方法學：真菌rDNA ITS 序列分析用于真菌系統分類通常通過多聚酶鏈式反應(PCR)技術實現。rDNA 多復制的特性, 有利于低濃度或被更高度降解的DNA 樣品中ITS區域的擴增。這有利于研究尚無任何rDNA 序列資料的生物。根據這些基因上高度保守區段設計出通用引物, 借助PCR 技術擴增rDNA 的目的片段。PCR 技術在真菌分類、鑒定中與直接測序法相結合有很大的優越性[ 14] : ①只需少量的DNA, 每次擴增只需約0.1 ～10 ng;②可對DNA 的2 條鏈測序, 從而減少錯誤;③可利用總DNA 的較粗制備品;④適合于自動測序儀進行測序。

三、實驗器材

1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測：

1)、儀器： 離心機 離心管 移液槍(200μL、1000μL)槍頭 研缽 恒溫水浴鍋 超凈工作臺 瓊脂糖凝膠電泳系統 一次性手套 凝膠成像系統 紫外分光光度計 2)、材料：真菌 3)、試劑：

(1)、DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS(2)、3M NaAc(3)、TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA(4)、酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)(5)、氯仿:異戊醇(24:1)(6)、異丙醇(7)、無水乙醇(8)、75%乙醇

(9)、加入巰基乙醇(10)、RNaseA

2、ITS片段的PCR擴增及其產物電泳檢測：

1)、儀器：PCR熱循環儀 瓊脂糖凝膠電泳系統 移液槍 一次性手套 2)、材料：真菌ITS片段 3)、試劑：

（1）、引物：ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(5’端引物)ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’(3’端引物)（2）、ddH2O(2.5mM)（3）、10×MgCl2 緩沖液（4）、DNA模板（5）、脫氧核糖核酸聚合酶(Taq酶)（6）、50×TAE貯存液（7）、6×加樣緩沖液（8）、100bpDNA ladder。(9)、溴酚藍染料

3、ITS片段測序

1)、儀器：PCR熱循環儀 高壓電泳儀 測序用電泳槽 制膠設備 吸頭、與電泳玻璃相配的染色盤、小指管

2)、材料：ITS片段PCR擴增產物 3)、試劑：

藥品： 三羥甲基氨基甲烷（Tris）乙二胺四乙酸(EDTA)硼酸 尿素 丙烯酰胺 N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）過硫酸銨 冰乙酸 碳酸鈉（Na2CO3）甲醛 硫代硫酸鈉 硝酸銀（AgNO3）測序級Taq DNA 聚合酶 4種 d/ddNTP混合液 pGEM-3ZF(+)對照DNA 1μg/μL ITS4/ITS5正向引物 粘合硅烷 硅烷

溶液：

（1）、5×TBE：

Tris 13.5g 硼酸 6.9g EDTA 0.9g 用雙蒸水定容至250mL（2）、6%變性聚丙烯酰胺凝膠貯液：

尿素

63.06g

丙烯酰胺

8.5g

N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺 0.45g 5×TBE 15mL 用雙蒸水定容至150mL（用普通濾紙過濾后使用）。

4、BLAST比對、鑒定屬、種：

儀器：電腦及攜帶BLAST程序（基本局部相似性比對搜索工具）

5、進化樹的繪制

儀器：電腦及攜帶MEGA軟件（分子進化遺傳分析）

四、實驗內容及步驟

(一)、實驗內容：

1、大量真菌的準備;

2、真菌總基因組DNA的提取；

3、真菌基因組DNA純度、濃度的檢測；

4、ITS片段的PCR擴增；

5、ITS片段的PCR擴增產物電泳檢測；

6、ITS片段測序；

7、BLAST比對、鑒定屬、種。

(二)、實驗步驟：

1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測：（1）、準備大量的真菌，然后去1g真菌，在液氮中迅速研磨成粉。

（2）、2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預熱；

(3)、在1.5mL離心管中加入65℃預熱的抽提液700μL。(4)、加入巰基乙醇50μL，上下震蕩，使蛋白質變性沉淀，65℃水浴40min，每隔10min振蕩混勻一次。

(5)、加入等體積（約750μL）的氯仿/異戊醇(24/1)混勻，除去蛋白質，4℃平衡離心，10000rpm，10min。(6)、取上清（約750μL）到1.5mL離心管中，加1/5體積（約150μL）65℃預熱的CTAB/NaCl混勻，加入600μL的氯仿/異戊醇(24/1)混勻，4℃平衡離心，10000rpm，10min。

(7)、取上清，加等體積（約750μL）的CTAB沉淀液，顛倒混勻。65℃水浴30min至沉淀可見。4℃平衡離心，10000 rpm，10min后小心去上清。

(8)、沉淀用TE（0.5mL）溶解，加入等體積（約0.5mL）的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，4℃平衡離心，10000rpm，10min。

(9)、取上清加入2倍體積的無水乙醇（1mL），再加入1/10體積的NaAC（pH 5.2）約0.1mL。(10)、-20℃冰箱1h，4℃平衡離心，12000rpm，10min，棄上清，用70%酒精清洗2次，濾紙吸去多余水分，超凈臺吹干。

(11)、0.05mL TE溶解，加入5μLRNA酶液37℃放置30min；(12)、吸取適量樣品于紫外分光光度計上檢測濃度與純度；(13)、剩余的樣品置于-20℃保存待用。

2、ITS片段的PCR擴增及其產物電泳檢測

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’

1)、PCR Amplification reaction system（PCR擴增反應體系）（50μl）ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2(MgCl2 緩沖液)5.0μl dNTPs(2.5mM)1.0μl Primer5’（5’端引物）2.0μl Primer3’（3’端引物）2.0μl DNA template（DNA模板）1.0μl Taq DNA polymerase(脫氧核糖核酸聚合酶)(5U/μl)0.5μl

2)、反應程序如下：

（1）94℃ for 5 minutes denaturalization（94℃預變性5min）（2）94℃ for 45 seconds denaturation（94℃變性45s）（3）52℃ for 45 seconds annealing(52℃退火45s)（4）72℃ for 1min30sec extension（72℃延伸90s）重復步驟(2)-(4)30次

（5）72℃ for 10 minutes final extension（72℃最后一次延伸 10min）大概500bp左右

3)、取5μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20℃保存：

(1)、瓊脂糖凝膠：將50×TAE貯存液用蒸餾水稀釋成1×TEA電泳緩沖液，待用，按1%稱取適量瓊脂糖置于250mL錐形瓶中，加入對應量1×TEA稀釋緩沖液，蓋上封口膜，以減少水分蒸發，放入微波爐里加熱沸騰，取出搖勻，使瓶壁上粘附的瓊脂糖全部溶解，反復3次，至瓊脂糖全部溶化，放置，待其稍冷卻。

(2)、膠板的制備：將制膠槽置于水平支持物上，選擇合適厚度和齒數的樣品梳，插上梳子。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖凝膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液數滴，搖勻，小心地倒入制膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后，小心拔出梳子，將膠塊取出，至于已加入足量1×TEA電泳緩沖液的電泳槽內。

(4)、加樣：取5μl樣品與2μl 6×加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加樣品槽中，在第一個孔或最后一個上樣孔內加入5μl的100bpDNA ladder。

(5)、電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，以5V/cm(約100V)電泳，當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。

(6)、成像：戴上一次性手套，在波長為254nm的紫外燈下觀察膠塊，DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，用凝膠成像系統照相。

3、ITS片段測序

（一）測序反應：

1.對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)石蠟油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。

2.對于每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：

（1）樣品反應：

質粒模板DNA 2.1pmol 5×測序緩沖液 5ml 引物 4.5pmol 無菌ddH2O 至終體積 16ml

（2）對照反應

pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg)4.0ml

5×測序緩沖液 5ml

ITS4/ITS5正向引物(4.5pmol)3.6ml

無菌ddH2 O 至終體積 16 ml

3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。

4.從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。

5.在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6.把G、A、T、C 4個反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，先經過95℃ 2min，然后進入如下循環：

95℃ 30s 變性 42℃ 30s 退火 70℃ 1min 延伸 45-60個循環后，取出置于冰箱中

7.熱循環程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。

（二）、測序凝膠板的制備

1、玻璃板的處理：

（1）短玻璃板的處理

A.在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。

B.用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過并已經自然干燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。

C.4-5分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。

2、長版處理（換雙橡膠手套）

(1)、用浸透硅烷的吸水紙仔細擦邊玻璃板表面。

(2)、5-10min后，用浸透95%乙醇的干凈吸水紙輕輕擦去多余硅烷(硅烷不能過量，否則影響印染效果)。(3)、用0.4mm邊條裝配好，再用膠帶粘好，用夾子夾好以防滲漏。

(4)、將板呈40°角傾斜，按下面的比例直接混合溶液，然后用燒杯直接灌膠，或用50mL注射器注入，避免出現氣泡（氣泡出現，可敲擊玻璃板，使之排出）。

6%變性聚丙烯酰胺凝膠貯液90mL，四甲基乙二胺(TEMED)60μL，過硫酸胺90μL。灌滿后將鯊魚梳子背面插入液面5-6mm，將板放置20°角使之聚合。在室溫中約20min內聚合（注意底部不要邊條，直接用膠帶封，否則邊條不易取出）。

3、測區產物凝膠電泳（凝膠灌制后2-24h后均可獲得良好結果）

(1)、去掉凝膠兩邊和底部膠帶紙，拔下鯊魚齒梳并轉過來用尖齒插入凝膠約1mm。將凝膠板安裝到電泳儀上，在電極上、下槽都倒入1×TBE電泳緩沖液，用吸管吹洗掉梳齒形成加樣孔中殘留的尿素，并去掉氣泡。

接穩定電源，40cm膠以1300V預電泳20-30min，是凝膠加熱到60℃左右。

(2)、將G、A、T、C 4個小管，各加入3μLDNA測序反應終止液，置于沸水中煮沸2min迅速插入冰中，上樣前，短暫離心混勻。(3)、關閉電源，上樣4μL。

(4)、上樣后，繼續電泳，直至二甲苯藍染料距離玻璃板底部2cm時，終止電泳。

4、DNA測序凝膠的銀染法處理

(1)、玻璃板的分離： 電泳結束后，小心揭開玻璃板，凝膠應牢牢黏附在短板上。

(2)、凝膠的固定： 將凝膠連同放入磁盤中，加入固定液，注意要沒過凝膠，放置20min直至溴酚藍和二甲苯藍的顏色消失。緩緩水平搖動。固定液可回收做定影液。(3)、洗膠： 用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min。漂洗時輕輕搖動，每次前都將膠瀝干10-20s。(4)、凝膠的染色： 加入染色液緩緩搖動染色30min（25min后可在另一瓷盤中備好顯影液，同時要預冷到10℃）。

(5)、凝膠的漂洗： 由于這一步非常關鍵，所以操作一定要非常快。將染色液倒入一個容器內，將瓷盤用雙蒸水涮一下，然后倒入3L雙蒸水，將凝膠浸入，然后將凝膠立即放入準備好的預冷顯影液中（從膠浸入雙蒸水到放入顯影液 不能超過5-10s，如超過則重復（4）（5）步）。

(6)、凝膠的顯影： 緩緩搖動，直到凝膠上顯條帶，一般為5-6min，時間不要過長，否則背景會過深（邊搖動，邊觀察，棕褐色條帶到一定強度后，馬上終止）。

(7)、終止顯影： 將等體積定影液直接加入顯影液，緩緩搖動2-3min（時間過長會使染色變淡）。

(8)、凝膠的漂洗： 用雙蒸水漂洗2次，每次2min。(9)、將凝膠放在空氣中干燥，識讀序列。

4、BLAST比對、鑒定屬、種

5、進化樹的繪制

第二篇：分子實驗學習總結——郁娟娟

DNAstar：序列拼接 MEGA：分析堿基組成 CLUSTAL：序列比對 PAUP：跑樹 DABE：飽和性分析

總思路：序列拼接-比對-

四、下載序列的方法

打開.Fasta格式的序列-File export-sequance alignment-保存 在NCBI上找到相應的序列方法：

Search Nucleotide

for 文章的genibank序列號-reports-復制序列到txt文件中，刪除沒用的東西，只留下序列和學名。保存成txt文件后，打開Editseq-將,txt序列復制到其中-save保存為seq格式

五、將拼接序列翻譯成蛋白質方法

打開拼接的序列-全選中-Goodies-translate DNA

2、如何計算堿基含量比值、答：MEGA-Nucleotide Composition

六、DAMBE序列飽和性分析

序列的飽和性分析在DAMBE程序中，以轉換、顛換數為縱軸，以TN93模型（Tamura and Nei, 1993）校正的距離為橫軸做散點圖。如果這些點隨序列間分歧增大呈線性分布就說明序列間替換沒有達到飽和，序列可以用于后續的系統發育分析。DAMBE還長用在單倍型的歸納、基因頻率和堿基組成分析、遺傳距離計算、序列排序、5.2.2堿基替換飽和效應的檢驗

當核苷酸序列分歧較小時，序列之間被觀察到的核苷酸差異數接近實際替換數。如果序列分歧較大，DNA序列的變異可能會受到飽和效應的影響，這時觀察到的堿基差異可能包含了部分進化雜音。一般說來，堿基轉換發生的頻率高于顛換，但是隨物種分歧程度的增加，轉換/顛換的比率接近或小于1，說明轉換可能已經趨于飽和并可能成為進化雜音，所以轉換和顛換發生的頻率與序列間分歧度的關系就可以反映出堿基替換是否受飽和效應的影響。在著手構建分子系統樹前，為了排除這種進化雜音獲取正確的進化信息，必須對目的片段的堿基替換是否受到飽和效應的影響進行檢驗。

用 DAMBE（Xia，2000）分別對四個mtDNA片段的堿基替換模式進行檢測，以此估計所研究mtDNA片段的堿基替換是否受到飽和效應的影響。

打開DAMBE-FILE-Open standard sequence file-類型unknown-打開

proteincoding

and

nuc.seq-invMtdna-trains-table

versis

advance –go-graphics-trainsition tranversion –tn93-g0-graphstyle-curve only-保存.bmp

問題

1、如何計算密碼子的不同位上堿基變化，轉換顛換比值

2、如何進行序列的飽和性分析

序列的飽和性分析在DAMBE程序中，以轉換、顛換數為縱軸，以TN93模型（Tamura & Nei, 1993）校正的距離為橫軸做散點圖。如果這些點隨序列間分歧增大呈線性分布就說明序列間替換沒有達到飽和，序列可以用于后續的系統發育分析。

3、如何看用Editseq檢驗拼接后的序列是否能正確翻譯為蛋白質

4、如何計算遺傳距離（DAMBE）

一、DNAstar：序列拼接

在序列的拼接時，修改紅色和小寫字母的堿基 具體步驟：

1、2、ABI文件包括圖形和序列、SEQ文件只有序列沒有圖。DNAstar—seqman—File—NEW，把序列都放近去，有兩個正向，倆個反向的序列—Time ends—LOW—SEAN ALL-ASSEMBLE –出現contig 打開-雙擊contig_@_核對-contig-save consenus-single file-保存位置-sequce-add-選擇保存到的位置-點序列名字-add-雙擊-拼接完關閉。3、4、5、原始序列和拼接的序列各保存在一個文件夾內。EDIT-GOODIES-TRALS 翻譯成蛋白質。‘

從ncbi上下載相關的序列和測得的序列保存在一個文件夾內，把前面的內容都刪除，保留種名。加〉符號-保存

二、序列的比對

6、先切齊序列：用Seqman-sequence-add-skip-把所有的序列加進去進行刪除，使序列整齊。-contig雙擊,將序列切齊，再復制到一個新建的文本文檔。

7、切齊后保存方式：contig-export sequences-multiple files=set location-file-保存切齊

8、當在切齊的序列中發現反向序列要改正：用editseq打開序列-select all –goodies-reserse complement-全選粘貼到文本文檔中，目的是比對。

三、構建NJ樹方法(MEGA)

1、將TXT格式保存為nexus和clustal格式（生成alndndnxs）CLUSTAR-進行比對-FILE-LOAD SEQUENCE-打開新建的文本文檔txt-加入進去后-aligment-do complete Alignment-File-Save sequence as –format-custal-ok-File-Save sequence as –format-NEXUS最后保存為nexus和clustal格式，NEXUS是PAUP格式-關閉clustal.2、點擊MEGA-File-open data-.aln文件-打開-ok-點擊向下的綠色圖標MEGA-File-open data-切齊序列,meg-ok-yes-inverttebrate-ok-ok-刪除最后沒用的東西-保存-切齊序列,meg-

3、點擊Mitochondrial-ok-

4、phylogency-construct phylogency-NJ樹-none改成bootstrap-k 2p-compute-保存（image-EMF）

5、使用Mega 2.0分析序列間的p-distance, 即兩兩序列間的核酸差異比例，分析序列變異情況 方法1：

Distance-compute pairwise-distance only改為std err-compute 方法2：

pattern-compute composition distance

三、構建MP樹方法

1、MrBays，目的是轉化為.nex文件步驟為：

用bioedit將.txt文件比對轉換成.nex文件格式

方法：打開BioEdit，將.txt文件打開-Accessory application-clustal multiple alignment-File-export-sequence Aligment-選paup/nex命令.nex-保存-把.nex begin 前面的都刪除。File-open-切齊序列.txt-accessory appliacation-clustal multiple aligment-file-expore-sequence aligment-選paup/nenu命名.nex-保存

2、在.nex中加命令模板

;end;begin paup;log file=coimp;set maxtrees=1000;set criterion=parsimony;hsearch addseq=random nreps=1000;showtrees;describetrees 1/plot=phylogram brlens=yes;savetrees file=coi(mp).tre root=yes brlens=yes;contree all/file=coi.tre;pscore all/CI=yes RI=yes RC=yes;bootstrap

nreps=1000 search=heuristic/addseq=random nreps=100;savetrees file=coi(mpb).tre root=yes;END;

2、打開paup-打開1.nex-open –開始跑樹

3、用treeview 打開.tree樹。

keepall=yes

MrBays建樹

1、用bioedit將.txt文件比對轉換成.nex文件格式

方法：打開BioEdit，將.txt文件打開-Accessory application-clustal multiple alignment-File-export-sequence Aligment-選paup/nex命令.nex-保存-把.nex begin 前面的都刪除。

File-open-切齊序列.txt-accessory appliacation-clustal multiple aligment-file-expore-sequence aligment-選paup/nenu命名.nex-保存2、3、用paup運行.nex文件

接著繼續用paup打開modeltest3.7 文件夾中的model paupblock命令-運行結束后，在modeltest 的modelfolder中生成一文件名為”model.scores”文件。

4、運行modeltest批處理文件，生成一文件名為”mt.txt”文件，則為最適合的模型文件

5、將最適模型文件中的參數(hLRTs)拷貝到.nex文件后，加入貝葉斯運行命令，并改正.ne格式等。刪除前后沒用的，改正外群名字等。只能用一個外群。

begin mrbayes;log start filename=coibayes.log;outgroup Cinara;Prset statefreqpr=dirichlet(0.3321,0.1058,0.1271,0.435);Lset nst=6 rates=gamma;mcmc ngen=1000000 printfreq=100 nchains=4 savebrlens=yes startingtree=random;end;

6、將加好命令的.nex文件拷貝到MrBayes文件夾所在路徑內，運行人頭的MrBayes , 輸入execute.文件名.net,回車。

7、8、輸入 sump burnin=1000回車 輸入 sumt burnin=1000回車

9、運算完畢后點擊close 彈出一對話框，輸入命令語句“ save tree file＝文件名.tre；”回車。

菜單欄Tree中的Show internal edge labels 即可顯示各結點的bootstrap值。

9、生成的.con，用treeview打開

注意：貝葉斯樹只能用一個外群。建設一個新文件夾，將.scores、mt.txt、txt、nex文件都放到一個文件夾內。

ML建樹

方法同MrBays相似。預測模型利用貝葉斯得到的模型。把ML命令模板拷貝到.nex，把log file改成自己的名(=coiML)，外群也改(Daktulosphaira_vitifoliae Cinara_edulis C_arizonica);-把最適模型lset base---likhood下面savetree file=coi savetrees file=coin(mb)Lset Base=(0.3365 0.0976 0.1280)Nst=6 Rmat=(26794342.0000 8028280.5000 10365153.0000 1.4084 255543472.0000)Rates=equal Pinvar=0.7355;–生成的.nex.con文件-treeview打開。

注意：外群要寫成Cinara_edulis形式，可以有多個外群。打開方式和mp樹一致。

戴傳銀筆記 PAUP NJ tree begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=distance;bootstrap search=nj nreps=1000 keepall;savetrees file=nj.tre;end;

PAUP MP TREE begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=parsimony;hsearch addseq=simple(random)bootstrap nreps=1000;describetrees 1/plot=phylogram brlens=yes;savetrees from=1 to=1000;end;

PAUP ML TREE begin paup;outgroup outgroupname;setcriterion=likelihood;gettrees file=xxx.tre;(xxx modeltest文件保存的樹的名稱)hsearch addseq=asis bootstrap nreps=1000;savetrees file=ml.tre;end;

MEGA3.1分析其核酸組成

1、打開MEGA，點擊“File”中的“Open Data”打開“COI.aln”文件，點擊綠色箭頭－“Convert to Mega format”快捷鍵，出一把COI.aln轉換成Mega格式的對話框，點擊OK，即轉換成COI的Mega file，保存。

2、用Mega 打開該文件。選Data Type。Protein－coding nucleotide sequence data？Yes。Select genetic Code。程序自行計算。

3、點擊TA圖標，出現Sequence Data Explorer C：Conserved sites 291/660,分母613是總位點數 V：Variable sites 352/660 P: Parsimony-informative sites 26/660 N: Nonparsimony-informative sites 352-26＝326。

4、Mega-File-open

date-運

算

-sequence

Data Explorer-write data to file-title-寫名字.nex 注意：序列一定要正確，不能是反向的！！！

5、打開paup-打開1.nex-open –開始跑樹

6、Bootstrap 值檢驗及樹的保存

輸入命令“bootstrap nreps＝1000 keepall＝yes search＝heuristic/addseq＝random nreps＝100；”點擊回車鍵，程序開始運算。運算完畢后點擊close 彈出一對話框，輸入命令語句“ save tree file＝文件名.tre；”回車。

菜單欄Tree中的Show internal edge labels 即可顯示各結點的bootstrap值。

7、用treeview 打開.tree樹。

阿征筆記 begin paup;set autoclose=yes notifybeep=yes;log file=log.txt;outgroup A00;set root=outgroup outroot=monophyl;set criterion=parsimony;hsearch chuckscore=1;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=mp.tre root=yes;contree

all/file=mp(contree).tre

strict=no

addseq=random

nreps=500

nchuck=5 majrule=yes percent=50 le50=yes;bootstrap nreps=1000 conlevel=50 keepall=no search=heuristic/addseq=random nreps=100;savetrees

file=mp(bootstrap).tre

root=yes brlens=yes savebootp=both from=1 to=1000;end;征征 20:31:57 我每次都是先寫到contree那一步，然后在里面敲命令，后兩條分別

征征 20:32:13 begin paup;set autoclose=yes notifybeep=yes;log file=log.txt;outgroup A00;set root=outgroup outroot=monophyl;set criterion=parsimony;hsearch chuckscore=1;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=mp.tre root=yes;contree

all/file=mp(contree).tre

strict=no

addseq=random

nreps=500

nchuck=5 majrule=yes percent=50 le50=yes;end;征征 20:32:25 然后bootstrap nreps=1000 conlevel=50 keepall=no search=heuristic/addseq=random nreps=100;征征 20:32:36 跑完后 savetrees file=mp(bootstrap).tre root=yes brlens=yes savebootp=both from=1 to=1000;征征 20:32:54 保存一個有bootstrap的樹 征征 20:33:35 再給你個阿榮給我的 征征 20:33:42

set autoclose=yes criterion=parsimony notifybeep=yes;log file=...;Hsearch addseq=random

nreps=100

start=stepwise savereps=yes randomize=addseq rstatus=yes hold=1 swap=tbr multrees=yes;savetrees format=nexus brlens=yes append=yes file=...;contree all/strict=no majrule=yes percent=50 le50=yes;bootstrap nreps=1000

conlevel=50

keepall=yes search=heuristic/addseq=random nreps=10;征征 20:34:16 對了，我的outroot=monophyl;你們分子不是monophyl

PAUP軟件使用簡要說明

1.數據輸入格式

將需要分析的一組DNA數據經Clustal軟件比對分析后，將其比對結果的*.aln文件用Mega軟件打開并轉換為Mega格式（File-〉Convert To Mega Format），轉換結果會以*.meg文件存在與*.aln同一目錄下，再用DNAsp軟件將*.meg文件轉換為PAUP格式（File-〉Save/Export Date As，以NEXUS File Format保存）即可。

2.MP法分析

先啟動PAUP軟件，選擇相應數據文件，然后在命令行內依次鍵入

outgroup_外群名 回車

Bootstrap_nreps=1000_keepall 回車

Describetree 回車

Savetrees_from=1 to=1000 回車

3.NJ法分析

先啟動PAUP軟件，選擇相應數據文件，然后在命令行內依次鍵入

outgroup_外群名 回車

Set_criterion=distance 回車

Bootstrap_search=nj_nreps=1000_keepall 回車

contree 回車

Savetrees_from=1_to=1000 回車

4.ML法分析

先啟動PAUP軟件，選擇相應數據文件，然后在命令行內依次鍵入

outgroup_外群名 回車

Set_criterion=likelihood 回車

Bootstrap_nreps=100_keepall 回車

contree 回車

Savetrees_from=1_to=100 回車

注：外群名指的是分析數據中外群的代號；

下劃線“_”表示鍵入一個空格；

結果以*.tre格式存在分析數據的同一文件夾內，用Treeview軟件打開。

郁娟娟總結

一 Seqman 用來Assemble ,改錯后保存成Seq.Seqman 將所有的序列打開，將反方向的用Editseq轉換過來。

二 Editseq 打開所有的Seq序列——export as one----fas格式 三 Mega 打開fas格式文件——Alignment---alignment by clustle

第三篇：驗證分子間有間隙實驗改進

驗證分子間有間隙實驗改進

龔繁李躍春

(湖南師范大學化學化工學院 長沙 410081)

摘要：在同一容器中，先后加入二種不同液體至滿,密封容器振蕩,通過對比實驗前后容器中溶液液面的高低情況來說明分子之間存在間隙，增強了實驗的說服力,讓學生直觀的感受到微觀世界里分子構成物質的特點。

關鍵字：分子間隙;實驗改進;對比實驗

1、引言：

在人教版新課標九年級化學上冊第三單元課題二中，課本為了證明分子間存在間隙給學生設計了一個家庭小實驗，將100ml水與100ml酒精混合，所得體積小于200ml以此證明分子間存在間隙。該實驗存在三點缺陷：（1）酒精用量大，浪費藥品（2）液面下降不明顯，影響演示效果（3）在用量筒移取水和酒精時，會有部分液體殘留在量筒壁上，導致實驗口結果說服力不強。（4）操作較復雜，要兩次量筒讀數。為了解決這些問題，我們采用在同一容器中，先后加入二種不同液體至滿,密封容器振蕩,對比實驗前后容器中溶液液面的高低的方法來做該實驗。又取得了較好的效果。

2、實驗部分

2.1實驗目的(1)讓學生初步認識物質是由微粒構成的，構成物質的微粒之間存在間隙

(2)構成不同物質的微粒性質不同、微粒大小也不同。

2.2實驗原理：

分子之間存在間隙且分子總是做不停地無規則運動。將水和酒精充滿容量瓶，混合均勻后，若液面發生下降，則可驗證分子間存在間隙。

2.3實驗用品：

100ml容量瓶1只、100ml燒杯2只、餐紙、保鮮膜、棉線一根、無水酒精、純凈水、品紅溶液。

2.4實驗裝置：

聯系人：龔繁Email：879440991@qq.comTell：1511637622

5保鮮膜

圖一分子間有間隙實驗裝置圖

在相同的兩個燒杯中分別加入100ml的水和50ml的酒精，將裝有水的燒杯中滴加幾滴品紅溶液至燒杯中的水呈紅色。撕一小塊保鮮膜待用

2.5實驗步驟：

2.5.1方案一：

(1)打開容量瓶，用小燒杯移取70ml已滴加了品紅溶液的水于容量瓶中。

(2)用小燒杯移取酒精于容量瓶中直至容量瓶滿。

(3)塞上容量瓶塞，有液體溢出，用餐紙擦干。倒置容量瓶幾次，使液體充分混合，觀察液面下降情況。

2.5.1.1實驗結果：

液面下降1.5cm左右，實驗現象非常明顯

2.5.1.2實驗總結：

優點：

(1)酒精用量少，該實驗只需耗費30ml左右的酒精

(2)滴入品紅溶液的水呈紅色，可明顯觀察到在容量瓶倒置前，容量瓶中液體分層，上層無色，下層紅色。而倒置后溶液呈均勻紅色。

(3)倒置前容量瓶充滿液體，排除了會有部分液體殘留在容量瓶上導致的誤差。

(4)實驗現象明顯，混合后液面下降1.5cm左右

(5)實驗操作簡單，實驗用品少

缺點：將充滿的容量瓶塞上容量瓶塞會有液體溢出，這個操作不規范。

2.5.2方案二：

(1)打開容量瓶，用小燒杯移取70ml已滴加了品紅溶液的水于容量瓶中。

(2)用小燒杯移取酒精于容量瓶中直至容量瓶滿。

(3)用保鮮膜迅速包裹容量瓶，然后將保鮮膜用細線捆緊。用手掌壓住容量瓶口，倒置容量瓶幾次，使液體充分混合，觀察液面下降情況。

2.5.2.1實驗結果：

液面下降1cm左右，實驗現象非常明顯。用無水硫酸銅檢驗容量瓶外壁，并無液體溢出。

2.5.2.2實驗總結：

優點：

(1)酒精用量少，該實驗只需耗費30ml左右的酒精

(2)滴入品紅溶液的水呈紅色，可明顯觀察到在容量瓶倒置前，容量瓶中液體分層，上層無色，下層紅色。而倒置后溶液呈均勻紅色。

(3)倒置前容量瓶充滿液體，排除了會有部分液體殘留在容量瓶上導致的誤差。

(4)實驗現象明顯，混合后液面下降1cm左右

(5)實驗操作簡單，實驗用品少

(6)方案二很好的解決了方案一的缺陷，且實驗效果好。

3、小結

本實驗根據學生的認知結構，以學生已有的知識水平為基礎，利用實驗室及生活中常用品對課本實驗進行了改進。該改進實驗體現了新課標要求下的科學性、可行性、安全性及簡約性四大原則。

(1)科學性：該實驗原理、方法、操作科學合理，現象明顯，符合學生認知結構；

(2)可行性：所選試劑和儀器設備均為實驗室常見試劑和儀器以及常用生活用品，中學現有條件均可滿足，實驗所需時間短（約1.5分鐘）適合在課堂演示；

(3)安全性：該實驗所選試劑和藥品均無毒

(4)簡約性：實驗操作簡單，只需觀察容量瓶中溶液液面的下降即可。

讓學生借助直接的觀察推出分子間存在間隙，且該實驗排除了課本實驗中不嚴謹的地方，不易使學生的思維產生疑惑。從而達到課堂演示的效果。參考文獻：

王桂華.驗證分子間隙實驗的改進，教學儀器與實驗，2006年第08期 王春云.分子間有間隙實驗的改進，物理實驗，1996年第16卷第6期251頁

第四篇：分子模擬作業

期末課程考核

《分子模擬方法與應用》課程心得體會

很高興能學習《分子模擬方法與應用》這門課程,使我們接觸并慢慢了解了一門全新的課程。因為大學本科為生物科學專業，比較偏向于生物機體特征理論學習，碩士也是生物工程，一直對分子模擬中的量子力學、分子力學、計算機軟件模擬等沒有接觸過，有幸選修這門課程，才得已拓寬自己的視野，涉獵物理、化學專業領域。

在上課初期，因為分子模擬與自己專業有點距離，所以接觸起來比較困難，但四位老師在此領域有比較深入的研究，講課清晰有條理，循序漸進，課堂氣氛也比較活躍，大家可以任意和老師討論不懂得問題，交流學習心得，慢慢對課程有了比較深入的了解。

我的碩士研究課題為生物分子方面，通過構建多酶復合體大分子構建一種底物通道，而構建多酶復合體過程中，需要用一種非水解作用的支架將酶連接起來，形成一種分子復合物。若能用分子模擬的知識用軟件將需要構建的分子模擬預測，形成一個比較直觀的印象，則在真正實驗過程中將會事半功倍。下面就是我通過上課聽老師講解，以及查閱《分子模擬基礎》、《分子模擬理論與實踐》在此專業領域的心得。

老師提到，分子模擬方法可以計算復雜龐大分子的穩定構象，熱力學性質及廣辟振動。從化學方面來講，化學就其物質的根本組成來講，是有電子及其原子核構成的，分子結構決定了分子性質。而量子力學與結構化學的出現，使化學研究由宏觀進入微觀。運用分子的結構及其原子核周圍電子的運動來解釋和理解物質的物理和化學性質，在量子力學的基礎上發展起來的量子化學及其相關計算為我們開辟了通向微觀世界的一條途徑，過去只能在實驗室通過化學反應和儀器設備來了解物質的結構和反映，現在通過理論化學和計算機化學計算就能了解各種化學反應變化，或預測某些分子的幾何空間構型。分子模擬就是利用理論方法（模擬分子結構）去實現以往用實驗才能證明的東西（性質）。

一．分子模擬的初步認識

四位老師學識淵博，專業基礎堅固，首先給我們講解了分子模擬的入門知識，1

期末課程考核

分子模擬的層次，包括量子力學和分子力學以及分子動力學，然后通過查閱資料分子模擬的概念有了更清晰的認識。分子模擬是用于模擬分子或分子體系性質，定位于表述和處理基于三維結構的分子結構和性質。

分子模擬涉及量子力學、分子力學、理論化學、計算化學、計算機化學,根據基本原理的不同，分子模擬主要有量子力學模型和分子力學模型兩類。量子力學研究電子運動狀態，用波函數表示，運用解薛定諤方程；分子力學模型考慮核運動狀態，電子運動作運動假設，用質點運動軌跡表示，運用解力學方程（經典牛頓力學方程）。

通過查閱資料可知，通過分子模擬可更全面的了解分子的性質，預測尚未合成的的化合物的性質以及最終目的的設計。分子模擬的主要優勢在于可以降低實驗成本、具有較高的安全性、實現通常條件下較難或無法進行的實驗（例如：超低溫，低于-100℃；超高壓，高于100Mpa）、研究極快速的反應和變化等。

二．上課主要內容

1.量子力學與分子力學（由任老師主要講解）

任老師以獨特活躍的課堂教學首先給我們講解分子模擬的知識，任老師不是古板教學，風趣幽默、課堂氣氛活躍，主要給我們講解了量子力學方面的內容，還有介紹了分子模擬的層次：量子力學、分子力學和分子動力學。所以我們對分子模擬有了初步的了解。量子力學

任老師講解中提到量子力學的分子模擬層次為電子、分子軌道,而分子力學的層次是原子。描述微觀粒子運動狀態的普遍規律是量子力學，在量子力學方法里，一切電子的運動狀態都是用其波函數來表示。計算機技術的迅速發展使量子力學原理得以廣泛應用，幾乎關于分子的一切性質，都可以用量子力學計算來解決，將量子力學中的公式定義算法等編制成計算機程序，用來解決和解釋化學中的問題，就形成了量子化學計算。量子力學的基本定律是波函數所滿足的偏微分方程，是利用波函數來研究微觀粒子的運動規律的一個物理學分支學科，它以分子中電子的非定域化為基礎，一切電子的行為以其波函數表示。根據海森伯的測不準原理，量子力學可計算區間內電子出現的概率，其概率正比于波函數絕對值的平方，而欲得到電子的波函數，則需解薛定諤方程式（）。量子力

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學模型用電子結構理論進行相關計算，電子結構理論的任務為解薛定諤方程式，采用量子化學方法對分子進行處理。隨著量子力學理論的逐步完善以及計算機的普及和計算速度、計算量的不斷提升，分子模擬的理論和方法得到了快速的發展，在化學化工、材料科學、醫藥科學、生命科學等諸多領域發揮著越來越重要的作用。分子力學

任老師在理論化學與物理化學背景下給我們介紹了分子、量子力學的基礎概論，分子力學方法（molecular mechanics ,MM）是依據經典力學的計算方法，此種方法主要根據分子力場計算分子的各種特性，依照波恩-奧本海默近似原理，計算中將電子的運動忽略，而將系統的能量視為原子核位置的函數。分子立場含有許多參數，這些參數可經由量子力學或試驗方法得到。利用分子力學方法可計算龐大與復雜分子的穩定構像，熱力學特性及振動光譜的資料，與量子力學相較，此方法要簡便多。某些情形下，由分子力學方法得到的結果幾乎與高階子力學方法所得的結果一致，但所計算的時間卻小于量子力學的計算。分子力學方法常被用于藥物，團簇體，生化大分子的研究。2.Materials Studio分子模擬軟件（由張老師講解）

張老師教學循序漸進，條理清晰，以簡單的例子具體講解了MS軟件在分子模擬的實際操作，其中涉及了鍵能.鍵角對構想的影響，形象明確。張老師給我們講解運用虛擬實驗講解分子模擬理論基礎，可以側性能，算參數。MS能方便地建立3D分子模型, 深入分析有機晶體、無機晶體、無定形材料以及聚合物, 可以在催化劑、聚合物、固體化學、結晶學、晶粉衍射以及材料特性等材料科學研究領域。

MS在高分子材料中的應用計算機模擬已經應用在高分子科學的各個方面, 包括模擬高分子溶液、表面和薄膜、非晶態、晶態、液晶態、共混體、嵌段共聚體、界面、生物聚合物、高分子中的局部運動、液晶高分子的流變學、力學性質和電活性等。

3.蒙地卡羅計算方法（Monte Carlo method）（由鄧老師講解）

鄧老師主要針對分子模擬中的MC對我們進行了簡單介紹，沒有很深入的講解，所以比較易懂。并且鄧老師作為年輕教師親切和藹，講課認真投入，課堂氣 3

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氛很好，由此，我們對蒙地卡羅模擬有了比較基礎的認識。

蒙地卡羅計算方法為最早針對龐大系統所采用的非量子計算方法,即MC計算法。蒙地卡羅計算法借由系統中質點（原子或分子）的隨機運動，結合統計力學的概率分配原理來得到體系的統計及熱力學資料，即根據待求問題的變化規律，構造合適的概率模型，然后進行大量統計實驗，使模型的某些統計參量正好是待求問題的解。此種方法多用于研究復雜體系及金屬結構及其相變化性質。其弱點在于只能計算統計的平均值，無法得到系統的動態信息，并且利用“隨機數”對模型系統進行模擬以產生數值形式的概率分布。蒙地卡羅的缺點是所依據的隨機運動并不適于物理學的運動原理，且與其他的非量子計算方法相比并非特別的經濟快速。

4.分子動力學模擬（Molecular Dynamics Simulation ,MDS）

岳老師年輕有為，有堅固的專業基礎與知識，講課時條理清晰，在總結前三位老師講解的內容基礎上，使我們鞏固所學內容，又主要講解了分子動力學模擬的主要內容。他以實際程序給我們講解，把復雜的程序清晰地呈現在我們面前，一步步講解，使我們有更加清楚地認識。MDS是目前最廣泛計算龐大復雜體系所采用的方法，并且現已廣泛應用于計算物理、化學、材料、生物科學等領域內的一種計算機模擬技術，它的思想是將組成系統的微觀粒子視為牛頓經典粒子，將所研究的系統視為經典多體系統，通過選擇恰當的場函數來描述系統內微觀粒子間相互作用的勢函數及系統外加約束條件后，利用牛頓運動定律來求解微觀粒子的牛頓運動方程。

岳老師講解了MDS的應用，可模擬肺部吸入PM2.5粒子或其他粒子時對肺的傷害，肺表面活性劑單層不是磷脂雙分子層，需要用分子模擬確定粒子進入肺部的的速度和位置。與蒙地卡羅計算方法相比較，分子動力學模擬系統中粒子的運動有正確的物理依據，并且計算技巧經過許多修改，現已日趨成熟，由于其計算能力強，能滿足各類問題的需求。

三．分子模擬與自己專業領域聯系的思考

分子模擬不僅在物理、化學的領域用重要作用，也可應用于生物分子方面，比如質粒DNA與鏈接載體的構建。我的碩士研究課題為生物分子方面，通過構建多酶復合體大分子構建一種底物通道，而構建多酶復合體過程中，需要用一種非

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水解作用的支架將酶連接起來，形成一種分子復合物。可用分子模擬的知識用軟件將需要構建的分子模擬預測，形成一個比較直觀的印象。分子模擬可模擬包括DNA 的分子模擬、RNA的結構模擬和反義RNA 的分子設計等。在非常詳細的層面上跟蹤構型變化的過程以及核酸形成的大的生物分子配合物研究。并且,分子模擬是蛋白質空間結構模擬和分子設計的一個很重要的方法。借助于先進的計算機圖形工作站,通過圖形接口,既可方便地建立多肽、蛋白質分子的初始模型,也可以顯示已被測定的蛋白質分子的空間結構。

在構建復雜大分子上，以纖維素酶復合體為例，纖維素酶復合體是內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、半纖維素酶通過非水解作用的支架連接，并且會結合識別蛋白。用分子模擬預測它們結合時的折疊狀態以及各自位置，可更有效率的構建。

四．結語

轉眼32課時的分子模擬課程結束了，研究生的課程模式與本科不同，給了我們更多自由討論的空間。感謝四位老師的細心講解，使我們對分子模擬領域有了一定程度的認識，并給以后的分子模擬學習指引了一條道路。我將繼續對分子模擬知識進行學習與了解，希望能運用到自己的研究領域，對今后的學習研究大有裨益。

深知自己所懂不多，所懂太少，在今后的學習中，還需拓寬自己的視野，不要只局限于自己的專業領域，廣泛涉獵。

第五篇：“分子間有間隙”實驗的改進和反思

摘 要：利用實驗室常備物品和閑置儀器進行改進，節省藥品，操作簡單，省時省力。

關鍵詞：水與酒精混合；實驗改進；移液管；注射器

中圖分類號：g633.8 文獻標識碼：b文章編號：1672-1578（2016）06-0265-01

現行人教版義務教育課程標準實驗教科書化學（九年級上冊）第53頁家庭小實驗中“1+1是否一定等于2”[1]，通過“將100ml水與100ml酒精混合，所得體積小于200ml”的結論，驗證分子間有間隙。老教材中是作為演示實驗，用量筒和膠頭滴管來完成的，但這兩種方法都存在一定的不足：

（1）酒精用量為100ml，比較浪費；

（2）200ml量筒內徑太大，混合后產生的液面差不大，現象不明顯，實驗效果不佳。

（3）由于另一種液體是從上面加進去的，在重力的作用下，兩種液體已先發生了一定程度混合，也是導致最后的實驗效果不明顯的原因之一。

（4）實驗要進行再次量液，量液時液面接近刻度時還要改用滴管滴加液體，操作比較繁瑣，費時費力。

這種實驗方法盡管存在諸多不足，但對學生掌握“分子間有間隙”這一知識點仍有一定的幫助。然而新教材將這一演示實驗改為家庭實驗后，老師在課堂上不再演示，而學生在家里呢，一沒藥品，二沒器材，于是這一實驗就形同虛設。

為此，我們試圖尋找一種比老教材實驗節省藥品、材料易得、操作簡單、效果明顯的實驗方法，增設這一實驗，幫助各位同行改善教學效果，為教育事業貢獻自己的微薄之力。通過使用各種常規儀器和實驗手段實驗，參照近年來人們對該實驗進行改進的眾多研究成果[2][3][4]，我們進行了無數次的實驗，最后得出了一個最佳實驗方案，現介紹如下，供各位同仁參考。

1.實驗器材

10ml一次性注射器1支，10ml移液管1支，打有半孔的3號橡皮塞2個。

2.實驗方法

2.1 將移液管短管一端插入橡皮塞的半孔中，然后將注射器針頭插入橡皮塞中，使針頭伸入移液管內，并將注射器活塞歸零；

2.2 將移液管尖嘴端伸入盛有酒精的試劑瓶中，拉動活塞抽取5ml酒精（如圖2所示）；

2.3 然后將移液管尖嘴端伸入盛有稀紅墨水的燒杯中，再抽取5ml稀紅墨水，將移液管尖嘴端插入另一個半孔3號橡皮塞中密封（如圖3所示）；

2.4 取下注射器，反復顛倒幾次移液管，靜置觀察，液面幾乎降到移液管的球泡內（如圖4所示）。

3.實驗說明

3.1 僅需10ml酒精，藥品用量少；

3.2 利用注射器來抽取藥品，改變了藥品添加的方向，自下而上，避免了藥品本身重力對實驗的影響，液面高度差更明顯，實驗效果更好；

3.3 注射器和橡皮塞為實驗室常備物品，取材方便。而由于高中化學教材的改版，酸堿中和滴定實驗已不再使用移液管，通過這一設計，使已經成為閑置品的移液管又有了用武之地，避免了資源的浪費；

3.4 抽入的兩種液體不會裝滿移液管，留有充裕的空間（刻度以上部分），再加上移液管中部的球泡空間大，在反復顛倒移液管時，在內部氣泡的“流動”過程中，能夠使兩種液體充分混合。而移液管的管徑很小，兩種液體混合后液面高度差較大，增強了實驗效果；

3.5 利用注射器來抽取藥品，改變了藥品的量取方式，操作簡單、省時省力。

4.實驗研究的反思

這僅是筆者在日常教學中開發舊儀器新用途的一次創新體驗和嘗試，相信這樣的事例還有很多，只要我們在日常教學工作中多觀察思考、勤動手動腦，就能設計出更多類似的效果更佳的實驗，充分利用現有資源，完善和彌補教材實驗不足的同時，提高自身的教學教研能力和水平，加快自身的專業成長，為自己鐘愛的教育事業作出更多的貢獻。