第一篇：酸奶菌種的分離及鑒定

酸奶菌種的分離及鑒定

乳酸菌是指一群通過(guò)發(fā)酵糖類(lèi)，產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱(chēng)。乳酸從形態(tài)上可分為球菌和桿菌，并且均為革蘭氏染色陽(yáng)性、在缺少氧氣的環(huán)境中生長(zhǎng)良好的兼性厭氧性或厭氧性細(xì)菌。目前，對(duì)乳酸菌的應(yīng)用研究，著重于食品（如發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品和泡菜）和醫(yī)藥工業(yè)等人類(lèi)生活密切相關(guān)的領(lǐng)域。

目前市售的各種酸奶制品中, 作為發(fā)酵劑的乳酸菌, 通常為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這兩株菌。用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳酸桿菌混合培養(yǎng)發(fā)酵的乳酸飲品能補(bǔ)充人體腸道內(nèi)的有益菌，維持腸道的微生態(tài)平衡，且含有易于吸收的營(yíng)養(yǎng)素，具有抑制腐敗菌、提高消化率、防癌及預(yù)防一些傳染病等功效，并能為食品提供芳香風(fēng)味，使食品擁有良好的質(zhì)地。

保加利亞乳桿菌（L.Bulgarius）:長(zhǎng)桿形，直徑1-3mm左右,能產(chǎn)生大量的乳酸。酸堿度方面,為耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生物的生長(zhǎng);溫度方面,為嗜溫至少許嗜熱,最適生長(zhǎng)溫度在37-45℃之間,對(duì)低溫非常敏感。

嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）：卵圓形，直徑0.7－0.9微米，呈對(duì)或鏈狀排列，無(wú)運(yùn)動(dòng)性。為健康人腸道正常菌群，可在人體腸道中生長(zhǎng)、繁殖。可直接補(bǔ)充人體正常生理細(xì)菌，調(diào)整腸道菌群平衡，抑制并清除腸道中對(duì)人具有潛在危害的細(xì)菌。

本研究對(duì)市售主要品牌酸奶中（河南花花乳業(yè)生產(chǎn)的酸奶）乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，并進(jìn)一步探討制備酸奶條件（溫度、時(shí)間等），以達(dá)到最佳的天然酸奶質(zhì)量效果。

一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（1）乳酸菌的分離純化

1．無(wú)菌操作倒平板、十倍稀釋、劃線分離，恒溫培養(yǎng)

2．菌落觀察與鏡檢 3．篩選生產(chǎn)用菌株（2）優(yōu)化酸奶制作條件

1．制備發(fā)酵液

2．不同條件下，接種發(fā)酵菌劑并發(fā)酵生產(chǎn) 3．觀察發(fā)酵情況

4．品嘗發(fā)酵產(chǎn)品，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià) 5．記錄結(jié)果

二、實(shí)驗(yàn)器材

1）菌種：新鮮乳酸飲料（標(biāo)記只含有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）

2）試劑：脫脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚綠乙醇溶液(溴甲酚綠、無(wú)水乙醇)、酵母膏、瓊脂、革蘭氏染液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、沙黃）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸鈣；

0.4gNaOH固體、4.2ml濃HCL(分析純)、20gCaCO3固體、酵母膏20g、瓊脂30g

香柏油、脫脂奶粉100g、蔗糖10g；

3）儀器：高壓蒸汽滅菌鍋、恒壓干熱滅菌箱、超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)箱、pH試紙、酸乳瓶、培養(yǎng)皿（φ9或φ12）、試管、300ml三角瓶（帶玻珠）、移液管、天平、牛角匙、電爐、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、線繩、標(biāo)簽、500ml錐形瓶、250ml錐形瓶、250ml燒杯、酒精燈、石棉網(wǎng)、接種針（環(huán)）、擦鏡紙

四、實(shí)驗(yàn)方法

4.1乳酸菌的分離純化 4.1.1分離

(1)配制BCG牛乳培養(yǎng)基，分裝三角瓶，包扎，滅菌備用。

BCG牛乳培養(yǎng)基配制

A溶液：脫脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚綠（BCG）乙醇溶液1ml，80℃滅菌20min。（1.6%溴甲苯酚綠（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚綠加入20ml無(wú)水乙醇中，再加水至100ml制成）

B溶液：酵母膏10g，水500ml，瓊脂20g，PH6.8，121℃濕熱滅菌20min。以滅菌操作趁熱將A溶液和B溶液混合均勻后倒平板。（2）樣品的處理

按照無(wú)菌操作要求，從市售新鮮酸乳中吸取10ml檢樣，放入裝有90ml無(wú)菌水的三角瓶?jī)?nèi)，振搖混勻。（3）分離方法 ①倒培養(yǎng)基

在無(wú)菌室，先用紫外線照射半小時(shí)把表面菌滅了，在通風(fēng)10min后，每培養(yǎng)皿傾注約15ml左右已溶化的BCG牛乳培養(yǎng)基，立即放在桌上搖勻，冷卻凝固后即成平板。②十倍稀釋法

將檢樣充分搖勻后，用十倍稀釋法稀釋成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-5各種稀釋度的樣品液。目的是為了確定哪個(gè)稀釋度最適宜。一般在培養(yǎng)基上長(zhǎng)處50-300個(gè)菌落的稀釋度為最佳。③分離

在BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上劃線分離，每稀釋度做兩個(gè)平皿。置40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及周?chē)囵B(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。4.1.2鑒別

（1）配制脫脂乳試管培養(yǎng)基，分裝試管，包扎，滅菌備用。脫脂乳試管培養(yǎng)基成分：20g脫脂奶粉，285ml滅菌水。配制好的脫脂乳培養(yǎng)基分裝到15支試管中。

（2）選取經(jīng)初步鑒定的乳酸菌典型菌落，用接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)至脫脂乳試管中，40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～24h。若牛乳出現(xiàn)凝固，無(wú)汽泡，呈酸性，涂片鏡檢細(xì)胞為桿狀或鏈球狀（兩種形狀的菌種分別選入），革蘭氏染色顯陽(yáng)性，則可將其連續(xù)傳代4～6次，最終選擇出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌種待用 4.2優(yōu)化酸奶制作條件（1）乳酸菌培養(yǎng)基的制作

將脫脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同時(shí)加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃滅菌10～15min，冷卻至35～40℃，作為制作飲料的培養(yǎng)基質(zhì)。即脫脂乳14.3g，無(wú)菌水100ml，蔗糖6g。（2）接種

將純種嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌及兩種等量混合菌液作為發(fā)酵菌劑，均以2～5%的接種量分別接入培養(yǎng)基質(zhì)中即為飲料發(fā)酵液。接種后搖勻，分裝到已滅菌的酸乳瓶中，每一種菌的發(fā)酵液重復(fù)分裝12瓶，將瓶蓋擰緊密封。（3）發(fā)酵

將接種后的酸乳瓶置30℃，36℃和42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2或4h時(shí)。培養(yǎng)時(shí)注意觀察，出現(xiàn)凝乳后停止培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入4～5℃冰箱中冷藏24h以上。經(jīng)此后熟階段，達(dá)到酸度適中（pH4～4.5）,凝塊均勻致密,無(wú)乳清晰出,無(wú)汽泡,獲得較好口感和特有風(fēng)味。（4）發(fā)酵產(chǎn)物鑒定——紙層析法 將分離的純菌種接種到乳酸菌葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基上，40℃培養(yǎng)48h。取產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的液體試管中發(fā)酵液做紙層析。展開(kāi)劑：水30mL、苯甲醇150mL、正丁醇150mL、甲酸3.3mL。顯色劑 ： 將1.6%的溴酚藍(lán)酒精溶液用0.1 mol／L的 NaOH調(diào)pH到6.7。顯色后，分別測(cè)定發(fā)酵液與2%標(biāo)準(zhǔn)乳酸的Rf值，確定發(fā)酵產(chǎn)物中是否有乳酸

五、預(yù)期結(jié)果

1．分離鑒定獲得嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌

2．獲得酸奶制作的最佳條件

六、實(shí)驗(yàn)進(jìn)度

第二篇：乳酸菌菌種的分離篩選方法解讀

乳酸菌菌種的分離篩選方法

乳酸細(xì)菌是一類(lèi)能利用發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱(chēng)。為兼性厭氧菌，桿狀或球狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)。營(yíng)養(yǎng)要求高，需要提供豐富的肽類(lèi) 氨基酸 維生素。在瓊脂表面或內(nèi)層形成較小的白色或淡黃色的菌落。

通常用作為有益微生物的菌種有乳酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌等。乳桿菌常用MRS瓊脂作半選擇培養(yǎng)基。當(dāng)乳桿菌僅是復(fù)雜區(qū)系中的部分菌類(lèi) 時(shí)，SL培養(yǎng)基常用作為選擇性培養(yǎng)基。對(duì)于芽孢乳桿菌常用GYP培養(yǎng)基，鏈球菌有TYC培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基被用作乳球菌的分離培養(yǎng)基。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬的一個(gè)種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運(yùn)動(dòng)，無(wú) 鞭毛。糞腸球菌為革蘭氏陽(yáng)性，圓形或橢圓形。

乳酸片球菌細(xì)胞呈球狀，直徑0.6~1.0μm，在直角兩個(gè)平面交替形成四聯(lián)狀，一般細(xì)胞成對(duì)生，單生者罕見(jiàn)，不成鏈狀排列。革蘭氏陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧。在MRS培養(yǎng)基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長(zhǎng)物呈絲狀。

乳酸菌在一般瓊脂培養(yǎng)基上形成微小菌落，不易觀察，所以分離時(shí)先富集培養(yǎng)并選擇合適的培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基一般添加西紅柿、酵母膏、吐溫-80等物質(zhì)，也常常加入醋酸鹽，因醋酸鹽能抑制部分細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)乳酸菌無(wú)害。

培養(yǎng)基中添加碳酸鈣，乳酸溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣形成透明圈，作為分離鑒別的依據(jù)，通過(guò)對(duì)生成的乳酸量進(jìn)行性能鑒定。

乳酸菌生長(zhǎng)繁殖時(shí)需要多種氨基酸，維生素及微氧，一般菌落比較小。分離培養(yǎng)基一般可添加西紅柿 酵母膏 油酸 吐溫等物質(zhì)，均具有促進(jìn)生長(zhǎng)作用。也常常添加醋酸鹽抑制有些細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)乳酸菌無(wú)害。一.篩選方法： 1.溶鈣圈法：

利用一些產(chǎn)酸類(lèi)細(xì)菌在含CaCO3的培養(yǎng)基上產(chǎn)生CaCO3溶解圈，從而篩選出這些產(chǎn)酸類(lèi)細(xì)菌，可用于乳酸菌的篩選。

其中培養(yǎng)基中加入CaCO3的作用是：①鑒別能產(chǎn)生酸的細(xì)菌；②中和產(chǎn)生的酸，以維持培養(yǎng)基的PH。

篩選過(guò)程：樣品預(yù)處理→梯度稀釋至10-6→選擇合適的稀釋度涂布→37℃培養(yǎng) 48h→挑選產(chǎn)生溶鈣圈的菌落反復(fù)在MRS培養(yǎng)基上劃線→挑起單菌落染色，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種→挑選革蘭氏陽(yáng)性單菌落→試管穿刺4℃冰箱保存。2.溴甲酚綠指示劑法：

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（含溴甲酚綠酒精溶液）

篩選過(guò)程：同上，不同之處是稀釋涂布后長(zhǎng)出菌落，挑取使溴甲酚綠變色的菌落。

二.菌種的分離篩選 1.培養(yǎng)基：

★1.1麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基：麥芽汁（10BX）1L 預(yù)先滅菌碳酸鈣5-10g/L PH自然（分離用）

★★1.2牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖 10g/L 吐溫0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚綠 0.01% PH6.0-6.5（分離用）★1.3番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基： 酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐溫 0.5 mL PH 6.0-6.5（分離用）1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.5 1.5蛋白胨 8-10 g/L 酵母膏 3-5g/L 葡萄糖 13-15g/L KH2PO4 1.5-2.0g/L MgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO4 0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.5 1.6蛋白胨 0.8-1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米漿0.5-1.0g/L KH2PO4 0.1-0.3g/L MgSO4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5（發(fā)酵或種子培養(yǎng)基）★★1.7 MRS培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)計(jì)數(shù)用）

蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏 5.0g、檸檬酸氫二銨 2.0g、葡萄糖 20.0g、吐溫 80 1.0mL、乙酸鈉 5.0g、磷酸氫二鉀 2.0g、硫酸鎂 0.58g、硫酸錳 0.25g、瓊脂 18.0g、蒸餾水1L, pH 6.5。（分離培養(yǎng)基），當(dāng)MRS培養(yǎng)基冷卻至45～50℃時(shí),加入已滅菌的碳酸鈣, 充分混勻,倒平板。1.8 BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）

乳糖5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5℅溴甲酚紫10ml 自來(lái)水1000ml

pH6.5-7.0（分離用）

1.9 BCG牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂：脫脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚綠酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。另取瓊脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g 溶解后調(diào)pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁熱在無(wú)菌操作下兩者混合均勻，倒平板，37℃培養(yǎng)24h，檢查是否有雜菌。2.分離篩選：

2.1富集培養(yǎng)：取1.0g（1.0ml）于無(wú)菌細(xì)口瓶中，加入無(wú)菌麥芽汁液體培養(yǎng)液于瓶口處，密閉，25-32℃培養(yǎng)48h。若培養(yǎng)基表內(nèi)出現(xiàn)絹絲波紋物，鏡檢桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，初步定為乳酸菌。以同樣方法轉(zhuǎn)接2-3次，接種量3-5℅.2.2菌種分離純化： 溶鈣圈法：

富集菌液或樣品適當(dāng)稀釋至10-7，混菌法分離，先加入10-12ml MRS培養(yǎng)基 或麥芽汁培養(yǎng)基，凝固后再注入4-5ml水瓊脂培養(yǎng)基，制成厭氧環(huán)境，30℃或37℃培養(yǎng)2-3天（溫度低時(shí)間稍長(zhǎng)），可出現(xiàn)針頭狀或圓形稍扁菌落，周?chē)纬赏该魅?。挑取透明圈大，培養(yǎng)基變黃的菌落，反復(fù)劃線純化2-3次，所得單菌落編號(hào)，經(jīng)鏡檢后，疑似乳酸菌落接種于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩；蚪尤胍后w培養(yǎng)基中，25-32℃培養(yǎng)24-48h，然后穿刺于MRS培養(yǎng)基或麥芽汁碳酸鈣半固體培養(yǎng)基中，25-32℃培養(yǎng)48h保存?zhèn)溆谩?.3性能測(cè)定： 乳酸菌定性試驗(yàn)：

不同條件下的產(chǎn)酸速率試驗(yàn)：將分離菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中25℃ 37℃溫度下培養(yǎng)測(cè)不同菌株不同溫度的pH。

方法1.吸取發(fā)酵液10ml，注入空試管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0 ℅高錳酸鉀約1.0ml，此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化成乙醛。取濾紙一條，在含氨的硝酸銀

溶液中浸濕，橫搭在試管口上，將試管徐徐加熱至沸騰，使乙醛揮發(fā)，若管口濾紙變黑，證明有乳酸生成。

方法2.紙層析法：展開(kāi)劑為正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛細(xì)血管吸取發(fā)酵液，多次點(diǎn)樣于新華濾紙上，1.5℅標(biāo)準(zhǔn)乳酸為對(duì)照，平衡2小時(shí)后進(jìn)行層析，3℅溴甲酚藍(lán)顯色計(jì)算Rf值。

產(chǎn)酸量測(cè)定：5.0ml發(fā)酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸餾水10-20ml，酚酞指示劑2滴，用0.1mol/l氫氧化鈉滴定至微紅色。

醋酸量（g/100mL）= 氫氧化鈉摩爾濃度.Vx90.08x10-3 /樣品毫升數(shù) x100 同時(shí)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察醋酸速度，耐高溫，耐酒精度，耐低酸度等主要生產(chǎn)性能，選擇優(yōu)勢(shì)菌株。3.菌株鑒定： 3.1菌落形態(tài)：

3.2菌體形態(tài)：（革蘭氏染色觀察）染色鏡檢：桿狀 陽(yáng)性。3.3乳酸菌運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)：半固體穿刺法 3.4生理生化：

3.3.1生化試驗(yàn)：產(chǎn)過(guò)氧化氫，產(chǎn)硫化氫，葡萄糖產(chǎn)生，硝酸鹽還原，產(chǎn)生吲哚，甲基紅，明膠液化，需氧，精氨酸，糖發(fā)酵試驗(yàn)。3.3.2生理試驗(yàn)：

乳酸菌產(chǎn)酸能力曲線：將篩選的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，25-32℃培養(yǎng)48h，間隔4-6h測(cè)定發(fā)酵液pH。

食鹽對(duì)乳酸菌的影響：在MRS液體培養(yǎng)基中，添加0.0℅ 2.0℅ 4.0℅ 6.0℅氯化鈉，菌種分別接種于培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h，測(cè)定OD值。

溴甲酚綠指示劑法：

原理：溴甲酚綠指示劑在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境呈藍(lán)色，分離培養(yǎng)基配制后PH為6.8，加入溴甲酚綠指示劑呈藍(lán)綠色，產(chǎn)酸后菌落周?chē)兂牲S色，較容易鑒別。

培養(yǎng)基：BCG牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂

初篩：將樣品富集液梯度稀釋?zhuān)m溫培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)扁平的黃色菌落及周?chē)囵B(yǎng)基也為黃色初定為乳酸菌。

復(fù)篩：將典型菌落轉(zhuǎn)接脫脂乳發(fā)酵管，若凝固，無(wú)氣泡，呈酸性，鏡檢細(xì)胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，連續(xù)傳代若干次培養(yǎng)，挑選出3-4h能凝固的乳管保存?zhèn)溆谩?/p>

注：1.乳酸菌篩選常在幾種培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行：

分別在麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基，番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基，BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）同時(shí)進(jìn)行混菌 劃線或涂布培養(yǎng)（放厭氧袋），分別25℃ 37℃培養(yǎng)48h。菌落觀察：平板表面形成淺色（黃色或白色）小菌落。麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基表面，菌落周?chē)纬赏该魅?，BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）周?chē)棺仙呐囵B(yǎng)基形成黃色包圍圈。

觸酶反應(yīng)：厭氧菌一般無(wú)觸酶（過(guò)氧化氫酶），用滴管滴加3.0℅過(guò)氧化氫于菌落上，若無(wú)氣泡產(chǎn)生，證明該菌為觸酶陰性。

將各種特征菌落分別接入斜面，培養(yǎng)后保存，進(jìn)一步生理生化試驗(yàn)，以鑒定分別何種乳酸菌。

2.菌落鑒定：半固體或雙平板瓊脂利于乳酸菌的生長(zhǎng)，菌落出現(xiàn)早。2.1菌落形態(tài)觀察：乳白色 邊緣不整齊，稍呈半球狀凸起，實(shí)心菌落。

個(gè)體形態(tài)：半透明 細(xì)桿狀 鏈狀排列，大量時(shí)呈發(fā)絲狀堆積。初步認(rèn)為乳桿菌。2.2生化鑒定：在吲哚試驗(yàn)中，加入菌種試管無(wú)任何變化，為陰性反應(yīng)。說(shuō)明該菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力。明膠液化 淀粉水解 氫氧化鉀試驗(yàn)均為陰性，說(shuō)明此菌為乳酸菌。（過(guò)氧化氫酶 還原硝酸鹽）

糖發(fā)酵試驗(yàn)：發(fā)酵果糖 半乳糖 葡萄糖 乳糖產(chǎn)酸為陽(yáng)性反應(yīng)，其余麥芽糖 蔗糖 棉子糖 鼠李糖產(chǎn)酸為陰性反應(yīng)。根據(jù)手冊(cè)第九版判斷此種乳酸菌為德氏乳桿菌保加利亞亞種。（纖維二糖 甘露醇 山梨醇 七葉苷 水楊苷）2.3乳酸菌生長(zhǎng)曲線 pH-t測(cè)定結(jié)果：

三.幾種乳酸菌篩選舉例

1.嗜熱鏈球菌：樣品來(lái)源：市售酸奶 培養(yǎng)基：M17改良培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度：42℃，需氧情況：兼性厭氧，篩選方法：常規(guī)的稀釋涂布和劃線分離

2.保加利亞乳桿菌：樣品來(lái)源：市售酸奶，培養(yǎng)基：牛肉浸膏 1.5％，酵母浸膏 0.5％，葡萄糖 3.0％，檸檬酸三銨 0.2％，七水硫酸鎂 0.02％，瓊脂 1.5％，pH 5.1。培養(yǎng)溫度：42℃，需氧情況：兼性厭氧，篩選方法：常規(guī)的稀釋涂布和劃線分離法。

3.雙歧桿菌：樣品來(lái)源：嬰兒新鮮糞便，培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基、NPNL培養(yǎng)基、TYP培養(yǎng)基、PTYG培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度：37℃，需氧情況：嚴(yán)格厭氧，篩選方法：常規(guī)的稀釋涂布和劃線分離法。

讀書(shū)的好處

1、行萬(wàn)里路，讀萬(wàn)卷書(shū)。

2、書(shū)山有路勤為徑，學(xué)海無(wú)涯苦作舟。

3、讀書(shū)破萬(wàn)卷，下筆如有神。

4、我所學(xué)到的任何有價(jià)值的知識(shí)都是由自學(xué)中得來(lái)的。——達(dá)爾文

5、少壯不努力，老大徒悲傷。

6、黑發(fā)不知勤學(xué)早，白首方悔讀書(shū)遲?！佌媲?/p>

7、寶劍鋒從磨礪出，梅花香自苦寒來(lái)。

8、讀書(shū)要三到：心到、眼到、口到

9、玉不琢、不成器，人不學(xué)、不知義。

10、一日無(wú)書(shū)，百事荒廢。——陳壽

11、書(shū)是人類(lèi)進(jìn)步的階梯。

12、一日不讀口生，一日不寫(xiě)手生。

13、我撲在書(shū)上，就像饑餓的人撲在面包上?！郀柣?/p>

14、書(shū)到用時(shí)方恨少、事非經(jīng)過(guò)不知難?！懹?/p>

15、讀一本好書(shū)，就如同和一個(gè)高尚的人在交談——歌德

16、讀一切好書(shū)，就是和許多高尚的人談話?！芽▋?/p>

17、學(xué)習(xí)永遠(yuǎn)不晚?！郀柣?/p>

18、少而好學(xué)，如日出之陽(yáng)；壯而好學(xué)，如日中之光；志而好學(xué)，如炳燭之光?！?jiǎng)⑾?/p>

19、學(xué)而不思則惘，思而不學(xué)則殆。——孔子

20、讀書(shū)給人以快樂(lè)、給人以光彩、給人以才干。——培根

第三篇：細(xì)菌分離鑒定

細(xì)菌分離鑒定

目的要求：

熟悉臨床標(biāo)本中常見(jiàn)的病原性細(xì)菌的分離鑒定方法，細(xì)菌分離鑒定。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

一、膿汁、咽拭子等標(biāo)本中病原性細(xì)菌的分離與鑒定

(一)標(biāo)本采集

1.膿拭子：用無(wú)菌棉簽蘸取患處深部膿液或分泌物少許，置入無(wú)菌空試管內(nèi)，送檢。

2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用無(wú)菌棉簽挑取膿稠痰塊，置入無(wú)菌空試管內(nèi)，送檢。

3.咽拭子：囑病人把口張大，用壓舌板壓住舌根，用無(wú)菌棉簽迅速蘸取咽部分泌物，置入無(wú)菌空試管內(nèi)，送檢。

4.血標(biāo)本：疑為敗血癥患者，在嚴(yán)格無(wú)菌操作下，靜脈采血，床旁直接加入含50ml的肉湯瓶?jī)?nèi)，立即搖勻后送培養(yǎng)。

5.腦脊液：對(duì)疑似流腦患者，作腰椎穿刺取腦脊液，立即行直接床旁接種(送檢過(guò)程中應(yīng)注意保溫)。

6.尿道、陰-道分泌物：對(duì)可疑淋病患者，男性可從尿道取材，取材時(shí)導(dǎo)尿管應(yīng)進(jìn)入尿道1cm～2cm，如為剛排尿，應(yīng)等待1h左右;女性則可以從宮頸口取分泌物，當(dāng)內(nèi)窺器插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)取出，取材應(yīng)立即送檢，不可放置冰箱。

(二)分離鑒定程序

待檢標(biāo)本可直接做涂片染色檢查鑒定，必要時(shí)可做分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)及致病性鑒定。常見(jiàn)的致病性球菌檢查程序如下。

直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài)、排列、染色性)

膿、痰、咽拭子

分泌物、腦脊液 觀察菌落性狀、溶血性、色素

血瓊脂平板→ 涂片、染色、鏡檢

↑ 挑取可疑菌落 生化反應(yīng)

血液、穿刺液 →肉湯培養(yǎng)基 純分離 致病性測(cè)定

↓ 藥敏試驗(yàn)

如培養(yǎng)液混濁時(shí)可涂片、染色、鏡檢

(三)常見(jiàn)臨床標(biāo)本的檢查方法

1．膿拭子

在膿汁中除了球菌外，也有桿菌存在，例如革蘭陽(yáng)性的有炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌、枯草桿菌等，革蘭陰性的有大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，此外尚可有真菌、放線菌、螺旋體等。

材料

(1)標(biāo)本：膿拭子

(2)培養(yǎng)基：血瓊脂平板

(3)兔血漿、白色濾紙片、無(wú)菌生理鹽水、載玻片

方法 膿汁 → 革蘭染色 → 鏡檢

↓ ↑

血瓊脂平板 →觀察菌落形態(tài)及溶血情況

↓

致病力試驗(yàn)

(1)將膿拭子作革蘭染色，鏡檢(先作培養(yǎng)再涂片以免污染)，鑒定材料《細(xì)菌分離鑒定》。標(biāo)本放置4℃冰箱保存，待報(bào)告發(fā)出后再丟棄。

(2)將膿汁涂布于血瓊脂平板上，再以滅菌接種環(huán)作劃線分離。置培養(yǎng)37℃培養(yǎng)18h～24h。

(3)經(jīng)培養(yǎng)后據(jù)菌落特點(diǎn)及涂片檢查結(jié)果進(jìn)行初步識(shí)別，根據(jù)需要再作進(jìn)一步鑒定。若菌落較大、溶血透明、產(chǎn)生金黃色色素、涂片為革蘭陽(yáng)性球菌并成堆排列時(shí)可能系葡萄球菌，應(yīng)確定其為何種葡萄球菌;必要時(shí)再作血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)，確定其致病力。

2.咽拭子

咽喉中存在的細(xì)菌較多，可以有厭氧及需氧性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四聯(lián)球菌、腦膜炎球菌、卡他球菌、喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌枯草桿菌、百日咳桿菌肺炎桿菌及綠膿桿菌等。此外也可有白色念珠菌奮森螺旋體等。本實(shí)驗(yàn)以咽拭子作為標(biāo)本，重點(diǎn)檢查病原性球菌。

材料

(1)標(biāo)本:咽拭子。

(2)培養(yǎng)基:血瓊脂平板。

方法

咽拭子

↓

血瓊脂平板

↓

觀察菌落形態(tài)及溶血性

↓

革蘭染色，鏡檢

取標(biāo)本涂布于血瓊脂平板，再以滅菌接種環(huán)劃線分離，置37℃培養(yǎng)18h～24h培養(yǎng)。標(biāo)本放置4℃冰箱保存，待報(bào)告發(fā)出后再丟棄。

可根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行鑒別：

(1)在菌落周?chē)a(chǎn)生2mm～4mm寬、界線分明、完全透明的溶血環(huán)、涂片為革蘭陽(yáng)性球菌并呈鏈狀排列，可能是乙型溶血性鏈球菌。

(2)菌落細(xì)孝半透明、有草綠色溶血環(huán)、涂片為革蘭陽(yáng)性球菌呈鏈狀排列，可能為甲型溶血性鏈球菌。需要進(jìn)一步與肺炎球菌區(qū)別時(shí)，可做膽汁溶菌試驗(yàn)及菊糖發(fā)酵反應(yīng)。

菌落細(xì)小半透明、不溶血、涂片為革蘭陽(yáng)性鏈狀排列的球菌時(shí)，為丙型鏈球菌。

(4)菌落扁平邊緣隆起、中央稍凹、半透明、呈草綠色溶血、革蘭染色為陽(yáng)性雙球菌、呈矛頭狀排列時(shí)為肺炎球菌，應(yīng)以膽汁溶菌及菊糖發(fā)酵反應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌區(qū)分。

(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革蘭染色為陰性雙球菌，呈腎形排列時(shí)，可能為腦膜炎球菌，需要進(jìn)一步作氧化酶試驗(yàn)及糖發(fā)酵試驗(yàn)(接種于含血清之葡、麥、蔗糖發(fā)酵管中)。

二、糞便標(biāo)本中腸道桿菌的分離與鑒定

(一)標(biāo)本收集

取患者的糞便或肛-門(mén)拭子。

(二)鑒定程序

腸道桿菌為一大群革蘭陰性桿菌，從形態(tài)及染色性上無(wú)法鑒別為何種菌，只能依靠生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行鑒定。

患者糞便(粘液、膿血)→腸道選擇、鑒別培養(yǎng)基(如ss、中國(guó)藍(lán)、伊紅美蘭)

↓

挑取可疑菌落(據(jù)大孝顏色、透明度而定)

↓

雙糖鐵及其他鑒別培養(yǎng)基

↓

據(jù)結(jié)果分析鑒定

↓

玻片凝集(做出特異性診斷)

葡萄糖乳糖動(dòng)力H2S尿素

⊕⊕±--艾希菌屬非致病菌

⊕+---克雷伯菌屬

⊕±+++變形桿菌

⊕-++-乙型副傷寒致病菌

⊕-+±-甲型副傷寒

+-++-傷寒桿菌

+----痢疾桿菌

第四篇：菌種安全管理制度

鹽城市婦幼保健院

菌種安全管理制度

1、菌種應(yīng)專(zhuān)人負(fù)責(zé)保管，并由部門(mén)負(fù)責(zé)人經(jīng)常督促檢查。若因工作變動(dòng)，應(yīng)及時(shí)作好全面交換工作。

2、菌種應(yīng)保存于安全的地方，所用冰箱等保存容器均應(yīng)加鎖，若要運(yùn)輸或攜帶必須置于金屬罐內(nèi)密封，由專(zhuān)人領(lǐng)取。

3、建立嚴(yán)格使用登記制度。

（1）所有菌種須按種類(lèi)、來(lái)源、數(shù)量購(gòu)買(mǎi)時(shí)期一一登記入冊(cè)。

（2）使用時(shí)須使用者簽字，主任審批。

（3）實(shí)驗(yàn)菌種使用完畢須高壓來(lái)菌處理并作好銷(xiāo)毀記錄。

4、保存的菌種應(yīng)于規(guī)定時(shí)間定期移種。

5、培養(yǎng)菌種的試管和干燥菌種的安瓿上應(yīng)貼標(biāo)簽，寫(xiě)明編號(hào)，菌名及日期。

6、菌種不得外借，不得隨便帶出實(shí)驗(yàn)室。

7、菌種保存范圍，轉(zhuǎn)移和銷(xiāo)毀等必須嚴(yán)格遵守衛(wèi)生部有關(guān)規(guī)定，主任不定期檢查，核實(shí)菌種使用銷(xiāo)毀情況。

第五篇：菌種傳代操作規(guī)程

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題

目

菌種傳代操作規(guī)程

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頁(yè)序/

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制

定

審

核

批

準(zhǔn)

制訂日期

審核日期

批準(zhǔn)日期

頒發(fā)部門(mén)

質(zhì)量部

生效日期

分發(fā)部門(mén)

化驗(yàn)室

一、目的：為使菌種傳代操作規(guī)范化、制度化，故建立此規(guī)程

二、適用范圍：菌種傳代須按本規(guī)程執(zhí)行。

三、責(zé)任者：微生物限度檢查化驗(yàn)員，質(zhì)量檢測(cè)中心主任。

四、正文：

1、培養(yǎng)基的制備

按微生物限度檢查用稀釋劑、培養(yǎng)基配制操作規(guī)程及斜面配制操作規(guī)程配制好相應(yīng)培養(yǎng)基。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)菌、用胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，白色念珠球菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，制備好的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)后，確認(rèn)無(wú)菌落生長(zhǎng)方可使用。

2.菌種傳代

2.1菌種傳代前應(yīng)準(zhǔn)備好適于該菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)設(shè)備，所有操作均應(yīng)在符合生物安全保護(hù)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

2.2點(diǎn)燃酒精燈，在火焰上部操作，將原有的菌種斜面（簡(jiǎn)稱(chēng)菌種管）與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)接種管）持在左手拇指、食指及中指之間，菌種管在前，接種管在后，使試管內(nèi)斜面向上，兩支試管口平齊，應(yīng)斜持試管呈45°角，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。用右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)兩支試管膠塞，以便接種時(shí)易于撥取。再用右手持接種環(huán)的柄端，垂直或稍斜地把接種環(huán)在火焰上灼燒。將接種環(huán)燒紅約30s，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，以徹底滅菌。用右手的小指和手掌之間以及無(wú)名指與小指之間，在火焰旁分別拔除兩支試管的膠塞，持住。在將試管口在火焰上通過(guò)以殺滅管口的細(xì)菌，但勿燒的過(guò)熱，將燒灼的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無(wú)菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)

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題

目

菌種傳代操作規(guī)程

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基上，如有溶印則表明接種環(huán)未冷卻，待冷后，再?gòu)男泵嫔咸羧∩僭S菌苔。取出時(shí)接種環(huán)不能通過(guò)火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管，在斜面上由下而上劃

“Z”字型曲線，當(dāng)接種完畢，立即將管口通過(guò)火焰滅菌，右手到火焰旁塞上膠塞，不要將管口離開(kāi)火焰旁去迎接右手的膠塞。最后將接種環(huán)燒灼滅菌放置備用。

3.培養(yǎng)

將以上接種好的各菌管放入相應(yīng)溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)，白色念珠菌放入23-28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24-48h，黑曲霉放入23-28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5-7天，其它菌種放入30-35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-24小時(shí)。

4.保存

除銅綠假單胞菌需室溫保存外，將其它傳代培養(yǎng)后的菌種應(yīng)放入4-6℃的冰箱冷藏保存。

依據(jù)：《中國(guó)藥典》2015版及中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范