第一篇：實驗總結的幾種高效釀酒酵母轉化方法

電轉法

設計方案一：

感受態制備：

1.挑一環酵母菌接種于5mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養過夜； 2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養約16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃離心收集菌體，用25mL冰無菌水洗滌一次后，細胞用10ml冰無菌水重懸，可換成較小的離心管； 4.加入1ml，pH7.5，10×TE緩沖液，搖晃均勻，再加入1ml 10×LiAc，旋轉搖勻，于30度輕輕搖動45min；

5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同時旋轉搖動，于30度輕輕搖動15min； 6.于4℃離心，棄上清（用槍吸），再用25mL冰無菌水洗滌；

7.2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗滌，離心收集菌體，棄上清（用槍吸）； 8.每管用100ul山梨醇溶解，分裝于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。電轉化：

1．向感受態細胞中加入約5～10ug（體積小于10 ul）的DNA，用槍吹吸均勻，轉移至預冷的電轉杯中，靜置5min；

2．擦干電轉杯，電擊，電擊參數：1.5KV，25uF，200歐姆；

3．立即加入1ml 預冷的山梨醇，轉移至EP管中，于30℃靜置1h； 4．離心，棄上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培養2h； 5．離心得菌體后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板進行涂板。

說明：該方法可直接采用50或100mL體系的一步法，即直接挑單菌落于YEPD中培養至預定菌濃，也可采用試管搖菌收集菌體制備感受態。

設計方案二：

感受態制備：

1.挑一環酵母菌接種于5mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養過夜； 2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養約16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃，5000rpm，5min離心收集菌體，用25mL冰無菌水洗滌后，細胞重懸于8ml處理液中（處理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室溫靜置30min；

4.4℃，5000rpm，5min離心收集菌體，用1.5mL 1mol/L預冷的山梨醇洗滌三次，離心條件一樣；

5.每管用100ul山梨醇溶解（以黃槍頭能吸取為宜，菌濃低時可適量少加入山梨醇），最后以80 ul的終體積轉移至EP管中（菌體太多可適當放棄部分），置于-70℃冰箱保存。電轉化：

1.向感受態細胞中加入約3ug（體積小于10ul）的DNA，用槍吹吸均勻，轉移至預冷的電轉杯中，靜置5min；

2.擦干電轉杯，電擊，電擊參數：2.0KV，25uF，200歐姆；

3.立即加入1ml 預冷的山梨醇，轉移至EP管中，于30℃靜置1h；

4.離心，棄上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培養2h； 5.離心得菌體后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板進行涂板。

說明：處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。制備體系可按比例放大。

設計方案二特別適合于采用一步法制備感受態細胞 具體如下：

1.挑一環酵母菌接種于5mL YEPD培養基中或轉接于50mL YEPD中，在30℃、250-300rpm 條件下培養至OD=6-10（為防止菌體老化，可將50mL培養體系提早收獲細胞，取菌體時，以1mL/次，取菌兩次或三次不等，使用菌濃達到預定的OD:6-10）；

2.取1mL菌液分裝于EP管中，于4℃，12000rpm離心30s，棄上清； 3.收集菌體，用預冰的無菌水洗滌兩次，離心條件一樣；

4.所得菌體用1mL處理液（配方同上）于室溫下處理30min；

5.離心，棄上清，加入1ml 1M 預冷山梨醇，離心，棄上清，重復兩次； 6.最終用1M 預冷山梨醇溶解菌體至終體積為80 ul，于-70℃冰箱保存； 7.電轉方法同上。

8.每一步的離心均30s即可，在較短的時間內制備出的感受態轉化效率特別高。

備注：OD檢測均為600nm，空白參比為：YEPD，高濃測定時應稀釋測定。所有無菌水與山梨醇均在冰上預冷處理；在制備感受態階段，所有離心均在4℃條件下。

醋酸鋰轉化法

方案一：

1.挑一環酵母菌接種于5mL YEPD培養基中，30℃、200rpm培養過夜；

2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養約5h(OD:0.5-0.8)；

3.于4℃，5000rpm，5min離心收集菌體； 4.25mL冰無菌水洗滌兩次，離心條件一樣； 5.用1mL 0.1M LiAc懸浮，離心收集菌體；

6.再用0.5mL 0.1M LiAc懸浮，以50 ul/管分裝于EP管中，置于冰上備用； 7.依次向上述50 ul感受態細胞中加入50% PEG3350 ：240ul、1M LiCl：36ul、2mg/ml 單鏈DNA：50ul、轉化DNA（5-10ug）：50ul； 8.劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻（約1min）； 9.30℃水浴孵育30min；

10.42℃水浴熱休克20～25min；

11.13000rpm離心30s收集酵母菌體，重懸酵母于1ml YEPD培養基，30℃搖床

孵育4h；

12.離心收集沉淀菌體，取除約800 ul上清液，然后按每100 ul/板進行漲涂板。

方案二：

1、接種液體YEPD培養基，過夜培養至1-2×107cells/ml；

2、取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養約5h(OD:0.5-0.8)；

3、收集細胞，并用無菌水清洗，之后用1ml無菌水重懸，并轉移到1.5ml離心管； 4、1ml TE/LiAC（10×TE[0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5]；lO×LiAc[1 M LiAc pH 7.5）清洗細胞，然后用1×TE/LiAC重懸至2×109 cells/ml； 5、1.5ml離心管中取50u懸浮液，用1ug轉化片段和50ug單鏈鮭魚精DNA混合；

6、加入300ul滅菌的40%PEG溶液，劇烈混勻； 7、30度振蕩培養30min； 8、42度水浴熱擊15min；

9、離心5s，用1ml 1×TE重懸，適當稀釋后涂布于選擇培養基。

附：

電轉法方案二中的處量液配制方法：

1.A液成份：100 mM LiAc，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5；配制量：500mL。

1.1 稱取54.654g山梨醇，用適量dd無菌水溶解于500 mL容量瓶中； 1.2 事先配制1 M LiAc母液，再從LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中； 1.3 事先配好1M Tris-HCl（pH 7.5），再取5mL至1.1所述容量瓶中； 1.4 用dd無菌水定量至500mL，轉移至試劑瓶中，于4℃保存。2.B液成份（母液）：1 M DTT

配制量：20mL。2.1 稱取3.09g DTT，加入到50mL小燒杯內； 2.2 加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22um濾器過濾除菌； 2.3 適量分成小份后，-20℃保存。

3.在使用時按每50mL菌體量用8mL處理液（A+B）。以50mL菌體為例：取A 液8mL，再取80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混勻，備用。

第二篇：酵母轉化問題參考

Ways to Destroy Your Yeast Transformation

by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture

Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E.coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip.Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid…

1.Forgetting to add single stranded DNA

While E.coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment.If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation.2.Using old PEG

PEG(polyethylene glycol)is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer.Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly.The percentage of PEG will make or break the success of your transformation;an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off.If you can stand it, make new PEG for every transformation.Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation.3.Using cells in stationary phase

Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency.This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed – only that your successful transformation rate will be much lower.Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation.4.Using the wrong selective marker

A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit.Double check to save yourself some tears!

5.Cutting corners when heat-shocking

This is a major difference between E.coliand yeast transformations: while E.coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock.Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes.I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced.If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minutes, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.

第三篇：轉化方法和酵母質粒抽提

酵母轉化（快速）

侯昕

1、挑單菌落于3ml 2XYPAD培養基中，30°C 200rpm培養至菌濃度為2X108 cell/ml。（約18h）。

2、用1.5ml離心管收集菌液兩次，每次1ml，13500rpm，常溫離心30秒。3、4、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。在菌中依次加入

50％PEG3350

240ul

1M LiAc

34ul 2mg/ml S.S.carrier DNA

50ul plasmid DNA(各1ug)

36ul 每加入一種后，要吸打混勻。5、6、42°C水浴1－3小時。

13500rpm離心1分鐘，吸棄上清。沉淀中加500ul水，吸打均勻，100ul涂皿。

7、30°C培養兩天

此方法可用于已知蛋白互做檢測，將兩個質粒共轉化。

2×YPAD：Yeast Extract

16g

2mg/ml carrier DNA：

Peptone

32g

鮭魚精DNA（Sima D1626）

Glucose

32g

溶于水，低溫放置過夜，滅

Adenine hemisulfate

80mg

菌后－20°C保存。

d2 H2O

800ml 酵母轉化（高效）

侯昕

1、挑酵母單菌落于100ml SC液體培養基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X107 cell/ml（稀釋20倍，OD545或OD600為0.1）。※或挑酵母單菌落于50ml 2XYPAD液體培養基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X108cell/ml（稀釋200倍，OD545或OD600為0.1）。

2、用兩個50ml離心管分別收集40ml菌液，3000g，常溫離心5分鐘。

3、將菌分別轉入兩瓶150ml 2XYPAD培養基中，擴大培養至菌濃度為2X107cell/ml。

4、用500ml離心管收集300ml菌液，3000g，5分鐘。用 200mlddH2O洗兩次，將菌轉入一個50ml離心管。

5、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。

6、配Mixture：

50％PEG3350

14.4Mml

1M LiAc

2.16ml 2mg/ml S.S.carrier DNA

3ml plasmid DNA＋ddH2O

2.04ml

7、把Mixture加入菌沉淀中，吸打均勻。

8、42°C水域熱激45分鐘；每5分鐘搖一下，使其受熱均勻。

9、3000g，離心5分鐘，棄上清，菌沉淀中加40ml水，吸打均勻，涂皿，100－200u/皿。

此方法可用于酵母雙雜交文庫篩選，建議分步轉化。

酵母質粒抽提

侯昕

1、收集菌液，10000g，離心10秒。

2、菌沉淀中加200ul YLS，牙簽打散。

3、加200ul 苯酚氯仿異戊醇（25：24：1），搖5分鐘，13000rpm，離心5分鐘。

4、將上層轉入一新離心管中，重復3。

5、將上層轉入一新離心管中，加20ul 3M NaOAc（pH5.2）、500ul乙醇，搖勻，10000g，4°C離心10－30分鐘。

6、750ul 75％乙醇洗，10000g，離心5－10分鐘。

7、重復6。

8、吹干，加10－20ul 水或TE。

此方法得到的質粒可用于電轉大腸桿菌

Yeast lysis solution（YLS）：

2％（v/v）

Triton X－100

1％（w/v）

SDS 100mM

NaCl 1mM

EDTA

第四篇：消化實驗方法總結

《豆粕粉碎粒度與蛋白質體外消化率的關系研究》

采用胃蛋白酶-胰酶兩步法，通過體外模擬雞體消化道內環境來比較不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，從而確定適合肉仔雞生長的較適宜豆粕粉碎力度。

平均粒徑采用GB 6971-86 方法，體外試驗采用Boisen和Fernandez等體外模擬消化方法。胃蛋白酶最適濃度的選擇

1g豆皮→100ml三角瓶+25ml磷酸緩沖液（pH=6.0 0.01M）+10ml鹽酸（0.2M）→溫和攪拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鮮胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌劑（青霉素+鏈霉素）→39℃恒溫水浴中震蕩6h,消化后+20%黃基水楊酸5ml→室溫靜置30min→抽濾→干燥后殘渣凱式定氮法測蛋白質含量→計算蛋白質和干物質消化率。確定最適胃蛋白酶濃度為75mg/ml.胰酶最適濃度選擇

在最適（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的產物中加入10ml磷酸緩沖液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氫鉀緩沖液配制）pH=6.8→39℃恒溫水浴中震蕩18h→消化后+20%磺基水楊酸5ml→室溫靜置30min→抽濾，干燥后殘渣按照凱式定氮法測其蛋白質含量，計算粗蛋白和干物質消化率，確定最適胰酶濃度為110mg/ml。胃蛋白酶一胰酶兩步法測定過程[1]

分別稱取原樣和過篩豆粕于三角瓶中，4個重復，使用最適濃度測定不同粒度豆粕蛋白和干物質含量，并通過氨基酸自動分析儀測其氨基酸含量，計算粗蛋白、干物質和氨基酸消化率。《燕麥粉添加量對面包營養組分含量和淀粉體外消化性的影響》 淀粉體外水解動力學測定

1g樣品+50ml磷酸緩沖液（pH=6.9）→37℃水浴消化5min→取0.2ml消化上清液→1min后加入1mlα-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）→37℃水浴繼續消化→每隔15min分別取消化液0.2ml于25ml試管中+0.8ml蒸餾水+1mlDNS→沸水浴中煮沸10min→取出后+15ml蒸餾水，搖勻→空白管調零，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖的含量。采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液繪制標準曲表2，根據還原糖釋放量的變化比較淀粉的體外消化性。《苦蕎芽粉饅頭品質及體外模擬消化研究》 甲醇提取液的制備

參照Bojana(2011)提取樣品的方法并稍作修改。準確稱取5g待提取的苦蕎饅頭樣品浸沒于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均質機攪拌使樣品破碎均質。樣品液超聲波提取15min，將懸浮液轉移至離心管中。原樣品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重復一次，合并提取液。2500r/min離心，取上清液于45℃水浴下蒸發至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，備用。酚含量測定

采用Folin–Ciocalteu法（FILIPCEV 2011）測定試樣的總酚含量，并稍作修改。取500μL蒸餾水，加入125μL的標準溶液或提取液后，再加入125Μl Folin–Ciocalteu試劑，充分混勻后加入1.25ml 7%碳酸鈉溶液，漩渦混勻后避光放置90min后于760nm處測定混合液的吸光值。以沒食子含量為縱坐標（μg/ml），吸光度為橫坐標，得回歸方程為y=0.014X+0.041（R2=0.995）。按照測定沒食子酸標準液吸光度的步驟測定待測液吸光度。黃酮含量測定

采用NaNo2-Al(NO)3方法測定。取一定濃度的樣品水溶液0.1ml與0.2ml 5%NaNO2溶液，漩渦混勻后室溫下放置6min，加入0.2ml 10%的ALCL3，振蕩后靜止6min，然后加入2ml 1M NaOH溶液，最后加水定容至5ml，放置15min后于波長510nm處測定混合液吸光值。以蘆丁含量為縱坐標（μg/ml），吸光度為橫坐標得回歸方程為y=0.007x+0.030（R2=0.991）。按照測定蘆丁標準液吸光度的步驟測定待測液吸光度。體外模擬消化過程

體外模擬消化過程參考Gawlik等人的方法，略作修改。

模擬唾液：2.38gNa2HPO4，0.19gKH2PO4，8gNacl和0.91gα-淀粉酶（220U/ml）溶于1升水中形成模擬唾液，用磷酸鹽緩沖液調節溶液為pH=6.75。

模擬胃液：0.32%胃蛋白酶溶于0.3mol/L的Nacl，用HCL調節溶液pH=1.2。模擬腸液：0.05g胰蛋白酶和0.3g膽汁溶于35ml的NaHCO3（0.1mol/l）。

體外提取過程（S0）：準確稱取6.0g蕎麥饅頭樣品浸沒于100ml甲醇水（80/20，v/v）溶液中，靜置6h，懸浮液轉移至離心管中，2500r/min離心10min，取上清液于45℃水浴下旋轉蒸發至干，用甲醇重新溶解并定容到10ml，-20℃保存，備用。

口腔消化過程（S1）：準確稱取6g樣品置于100ml的燒杯中并加入30ml模擬唾液，用均質機攪拌使樣品充分破碎均質后放入水浴搖床中，37℃振蕩10min。

胃腸消化過程（S2）：取出水浴搖床中的樣品，用3mol/l的鹽酸調節溶液體系至pH=1.5后加入30ml模擬胃液，置于40℃水浴搖床中振搖60min。反應結束后取5ml的樣液，于70℃的水浴鍋中加熱滅酶，經過模擬胃部消化的消化液用0.1mol/l的NaHCO3調節使溶液體系的pH=6，加入30ml膽汁胰酶的復合液，再分別加入5ml 1mol/l的Nacl和1mol/l KCl，置于37℃水浴震蕩120min模擬腸道消化，于70℃的水浴鍋中加熱滅酶，-20℃保存備用。每個樣品重復三次。

腸道吸收過程（S3）：將20ml剩余消化液轉移到透析袋中，并將透析袋置于裝有50ml PBS緩沖液的燒杯中，37℃水浴震蕩4h。將PBS緩沖液轉移到離心管中，-20℃保存備用，每個樣品重復三次。

《羊奶嬰兒配方奶粉中蛋白質體外模擬消化研究》 外模擬胃消化

體外模擬胃消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的HCl調乳液p H3。在每100m L乳樣中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U)，于

37℃恒溫搖床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH調節乳液p H值至7滅酶，測定其中蛋白質的胃消化率。體外模擬腸消化

體外模擬腸消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的Na OH調乳液p H7。在每100m L乳樣中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U)，于37℃恒溫搖床上消化水解2h，然后沸水浴5min滅活，測定其中蛋白質的腸消化率。體外模擬總消化

體外模擬總消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的HCl調乳液p H3。在每100m L乳樣中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U)，于37℃恒溫搖床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH調節乳液p H值至7。再向每100m L乳樣中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U)，于37℃恒溫搖床上消化水解2h，然后沸水浴5min滅活，測定其中蛋白質的總消化率。燕麥全粉中蛋白質體外消化的測定

燕麥蛋白質的體外消化實驗采用Wang[15]報道的體外消化模型進行,略有改動。具體操作如下:準確稱取一定質量的樣品分散于0.1 mol/L HCl中形成50 g/L的溶液,置于37℃水浴中預熱5 min,以酶∶底物為1∶ 100加入胃蛋白酶,在37℃恒溫振蕩器上反應,分別在不同的消化時間(0、10、30、60、120 min)取樣,用1 mol/L的NaOH調節pH7.0終止消化反應,120min所得的消化液調節pH7.0后,以酶∶底物為1∶ 100加入胰蛋白酶,在消化10、30、60、90、120min之后取樣分析。

第五篇：實驗總結-細胞培養方法

一、培養細胞常用配置

培養基的配置：基礎培養基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml 凍存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超凈工作臺常規配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精燈1盞，液器1臺，斜架1臺，酒精噴壺1個，酒精棉球缸1個，污缸1個，常規耗材：培養瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200μl、10μl），培養皿，6/24/48/96孔板，醫用脫脂棉球，凍存管 所需試劑：培養基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

實驗前準備：所需的各項高壓后的耗材及污物缸放于超凈工作臺內，用酒精噴壺噴灑實驗臺面，并關閉工作臺打開紫外燈照射30min后開始實驗操作。培養基及胰酶恢復常溫后使用，可37℃水浴5-10min

二、細胞復蘇 步驟：

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。超凈臺內準備一支15ml離心管備用。

3.將所需的培養基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液融化至黃豆粒大小后迅速取出。

5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min，5min）。6.取出2個培養皿并做好標記（復蘇日期等），提前加入5-10ml培養液；離心結束后用1ml培養液懸液混懸沉淀細胞后分別加入培養皿內。

7.將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8.將培養瓶放入培養箱內培養

注意事項：

1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進口產品。

3.離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。

4.離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。

5.凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液

6.復蘇細胞分裝的問題：復蘇1管細胞一般可分裝到2-3只培養皿中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。

7.加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度

8.原理：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

三、培養液的更換

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.將培養皿蓋內口朝上放在架子上，將培養皿內的培養液懸空倒進污缸 5．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養基瓶內吸取5-10ml培養基再懸空移入培養皿內，將培養皿蓋在酒精燈上消毒2-3次后蓋上。6.將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。7.將培養瓶放入培養箱內培養

每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代。

四、細胞傳代

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養液，胰酶，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。

4.將培養皿蓋內口朝上放在架子上，將培養皿內的培養液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養皿內。

5.將培養皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min（消化時間根據細胞不同時間不同），對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。（若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養基于培養皿內，并用移液器吸取少量的培養基輕柔的反復沖洗培養瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態。

7.取1或2個新的培養皿，然后將細胞培養基均勻的分到2或3個培養瓶內（注意原來傳代時使用的培養瓶可繼續傳代使用），進行1傳2或1傳3的培養。8.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養基皿內吸取5-10ml培養基懸空移入每個培養皿內，將培養皿蓋在酒精燈上消毒2-3次蓋上，在皿蓋上做好實驗標記。

9.將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

10.將培養瓶放入培養箱內培養。注意整個培養箱底托盤內一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。

每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代或保株。

五、細胞株的保存

原理：細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度增高，pH值改變，部分蛋白質由于上述原因而變性，引起細胞內部空間結構紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內結構成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內容物丟失。如果細胞內冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構型發生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外，減少胞內形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。

實驗步驟：

選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養瓶中的細胞培養液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。加入凍存管中，再加入1ml配置好的凍存液后放入梯度降溫盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養液，胰酶，二甲基亞砜DMSO，胎牛血清（解凍），梯度降溫盒恢復常溫，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。

4.將培養瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側后將培養瓶內的培養液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養瓶內。

5.將培養皿蓋內口朝上放在架子上，將培養皿內的培養液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養皿內。6.將培養皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min（消化時間根據細胞不同時間不同），對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。（若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養基于培養皿，并用移液器吸取少量的培養基輕柔的反復沖洗培養瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態。

7.將懸浮細胞吸入15ml離心管內，加入4ml培養基離心1000r/min，5min 8.預先配制凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定數量備用 9.棄去培養基，用凍存液進行重懸混勻后，將1ml含有細胞的凍存液移入凍存管內，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。

10.將培養基，胰酶瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

8.將凍存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌內長期保存。或直接放入梯度降溫盒內，放入-80℃冰箱內過夜后最后存放于液氮罐內。（梯度降溫盒內為甲醇，使用5次需要更換，每次使用需做好標記，使用前需恢復常溫）

六、細胞轉染

RNA干擾（RNA interference, RNAi）: ? 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。基因沉默，主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質化等原因使基因不能正常錄;

? PTGS是啟動了細胞質內靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導致TGS和PTGS。

? 由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，（長度超過三十的dsRNA會引起干擾素毒性）所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。

? 病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應。

作用機制

1)其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。

4)siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

5)RNAi發生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應基因沉寂。所以正常機體內各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。

脂質體轉染原理：

1.脂質體是磷脂分散在水中時形成的脂質雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，從而發現了膜的融合及內吞作用，因而可用作外源物質進入細胞的載體 2.陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內釋放，并進入細胞質中，再進一步進入核內轉錄、表達

DNA轉染步驟

1.轉染前一天接種細胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml無抗生素培養基每孔，第二天轉染時細胞達到90-95%每孔。

2.轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混勻。

4.B液：脂質體使用前輕輕混勻，脂質體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5.B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6.將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7.孵箱37℃培養48h（轉染時間待定）。8.第二天看細胞狀態來決定是否換液。9.同時設立細胞對照組，空白轉染組。

siRNA轉染步驟

1)轉染前一天接種細胞于6孔板（40x104），2ml無抗生素培養基每孔，第二天轉染時細胞達到50-60%每孔。

2)轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混勻。（siRNA按照說明書稀釋）4)B液：脂質體（RNAimax）使用前輕輕混勻，脂質體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5)B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6)將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7)孵箱37℃培養48h（轉染時間待定）。8)第二天看細胞狀態來決定是否換液。9)同時設立細胞對照組，空白轉染組。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上進行轉染實驗

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀釋液，取附贈的DEPC水至管內，打開離心管前先離心，將附在管壁上的凍干粉離心下來 2)溶解時滴加適量的DEPC水后蓋上管蓋，震蕩溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分別標記GAPDH，NC，NV-FAM，三個片段名稱，從管內吸取20ul的稀釋液分裝后

4)將稀釋液至于-80度冰箱保存。

? 轉染前一天，在6孔板上接種40x104AGS cell，再取一個35mm培養皿接種40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生長培養基。使細胞在轉染的時候有50-60%的融合率

? 從細胞中除去生長培養基

? 每個孔中加入1.5ml新鮮不含血清的培養基，并準備如下混合物 1)A液：(取7個EP管，分別標記空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三個片段)。在250ul的opti-mem終加入100pmol siRNA（稀釋好的siRNA濃度為20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均勻

2)B液：（取一個EP管標記RNAiMAX），RNAiMAX 使用前搖勻，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀釋RNAiMAX混勻后并在室溫下溫育5min 3)混合A液和B液，混勻B液后吸取256ul至A液中室溫下溫育20min ? 將混合物混勻后加入到含AGS的6孔板與35mm培養皿中，每孔終體積為2ml，則加入混合液500ul，并輕搖混勻 ? 在37℃的二氧化碳培養箱中培養5-6小時 ? 更換含血清的培養基并培養細胞24-48小時 24-48小時后收細胞跑WB，看沉默效果