第一篇：質(zhì)粒提取常見問題解析

質(zhì)粒提取常見問題解析

涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死？

參考見解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時殺菌。蘸了酒精后再燒一小會，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒還是干燒較長時間后，冷卻了再涂。同時作多個轉(zhuǎn)化時，應(yīng)用幾個涂布棒免得交叉污染。

原先測序鑒定沒有問題的細(xì)菌，37℃搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常? 參考見解：這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)粒或比較特殊的序列中。解決辦法：

1、降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。

3、質(zhì)粒抽提有一個酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過高造成的，請大家注意一下！

【有兩種方法可以在提質(zhì)粒前判斷菌生長是否正常：

1、利用你的嗅覺。只要平時做實驗仔細(xì)點就能聞出大腸桿菌的氣味，新鮮的大腸桿菌是略帶一點刺鼻的氣味，但不至于反感。而在泥水狀的菌液中你只要一湊過去就感覺到其臭無比或者沒有氣味，可以和正常菌液對照。

2、肉眼觀察活化菌株。對于生長不正常的菌液進行劃板驗證或者稀釋到濃度足夠低涂板，第二天觀察單克隆生長情況，LB平板生長的DH5A正常形態(tài)在37℃16h后直徑在1mm左右，顏色偏白，半透明狀，濕潤的圓形菌斑，如果觀察到生長過快，顏色又是泛黃的話基本上不正常了。】

未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決？ 參考見解：

1、大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。

2、質(zhì)粒拷貝數(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

3、菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4、堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。

5、溶液使用不當(dāng)：溶液2和3在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

6、吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。

7、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時)：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。

8、乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。

9、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。

10、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。

11、洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12、洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1min可達(dá)到較好的效果。

細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？ 參考見解：

1、很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的要好一些。

2、質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生長情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。

3、判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。

4、菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。達(dá)到OD600 1.5就可以了，（尤其是對于試劑盒提取要注意）另外如果只是簡單的酶切驗證根本無需酚氯仿抽提（安全考慮，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰當(dāng)，轉(zhuǎn)管過程仔細(xì)吸取不會有太多雜志。

為什么加了溶液Ⅱ后，菌體沒有逐漸由混濁變澄清？提出來的條帶幾乎沒有，但是RNA很亮（沒加RNA酶）？

溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液沒有由混濁變澄清，參考見解：

1、可能是因為溶液儲存不當(dāng)，或?qū)掖尾僮鳑]有及時蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較多，相對少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。

2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒有變清，這也會導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下．

3、可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高．如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買試劑盒提．用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的ＲＮＡ酶。

4、如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過程中使膜蛋白變化（數(shù)量變多），很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高溫或者低溫研磨等),然后使用一般的發(fā)放。

5、可能質(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。

加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒有明顯的改變？ 裂解不完全,參考見解：

1、問題可能是發(fā)生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒有沉淀？

2、可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積。

3、可能是“雜菌”污染，如果菌液生長異常快，就有可能被雜菌污染。這種情況一般表現(xiàn)為和目的菌有相同的抗性，生長速度異常，能夠提出質(zhì)粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產(chǎn)物不是自己想要的質(zhì)粒，要特別注意一下。抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，為什么要是酚/氯仿混合使用？怎樣使用酚與氯仿較好？ 參考見解：酚與氯仿都是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

參考見解：保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊醇？

參考見解：在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，可以降低抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。加入酚/仿抽提，離心后在水相和有機相間沒有出現(xiàn)變性蛋白相層，在隨后的乙醇沉淀步驟中卻出現(xiàn)大量的半透明沉淀，溶解后發(fā)現(xiàn)蛋白濃度很高？

乙醇沉淀時，較純的質(zhì)粒沉淀是白色的（PEG純化的沉淀是透明的肉眼不易發(fā)現(xiàn)），如沉淀是半透明的凝膠狀，則應(yīng)是蛋白含量高。參考見解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次檢測溶液III反應(yīng)完成后的離心上清pH是否在8.0左右？有時由于溶液III配置的問題，會出現(xiàn)溶液III反應(yīng)后離心的上清pH與8.0偏差較大的現(xiàn)象，這會降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差過大也會導(dǎo)致水相和平衡酚互溶。使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒的純度很好，但酶切不能完全切開? 參考見解：

1、確認(rèn)酶的有效性。

2、平衡酚是否被氧化（正常是黃色，而氧化后是棕色的）。

3、是否不小心吸入了痕量的酚。

4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（殘留的鹽類會影響酶切）。

5、乙醇漂洗后是否完全干燥（殘留的乙醇會影響酶切）。

堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA進行瓊脂糖電泳進行鑒定時，看到的三條帶分別是什么？ 參考見解：堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，得到的三條帶是以電泳速度的快慢排序的，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。提取質(zhì)粒中RNA沒有去除？ 可能是RNase失效或效率不高。參考見解：

1、更換RNase A，并保證其儲存條件是正確的

2、手工提取質(zhì)粒的，可單獨增加一步去除RNA的步驟，溶液III反應(yīng)后，在離心的上清中加RNase，室溫下去除RNA 10min～30min（需要保證RNase A是經(jīng)過失活DNase的），同時較高溫度（如50℃）會更加快速完全的去除RNA，經(jīng)驗所得經(jīng)過高溫處理的質(zhì)粒質(zhì)量不是很高。

提取的質(zhì)粒電泳后，為連續(xù)的一片火箭狀？ 參考見解：

1、質(zhì)粒如果鹽離子多，會有走膠變形的現(xiàn)象，如果提到的質(zhì)粒不夠純，會有電泳條帶不平齊的現(xiàn)象。

2、當(dāng)電壓太大時，容易出現(xiàn)火箭狀，而降解應(yīng)該是彌散狀。

3、可能是宿主菌影響的，質(zhì)粒抽提好后，用酚-氯仿處理一下再酶切，若有改善，則為宿主菌影響。轉(zhuǎn)化到其它宿主菌再切。

4、NaOH的濃度過高，會出現(xiàn)火箭狀的結(jié)果。

用堿裂解法提取質(zhì)粒，裂解5分鐘，沒有用酚 / 氯仿抽提，最后用滅菌水溶解質(zhì)粒DNA15min。雙酶切后跑膠一條帶都沒有，原因是什么？ 參考見解：

1、溶解時間稍微短了點，但是根據(jù)各個實驗室RNase不同，這個條件是不同的。在溶解的過程要渦旋處理促進溶解。

2、確認(rèn)一下酶切過程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切體系的Buffer或者是水，特別是水中；其次是酶切體系的問題；建議再把提取的產(chǎn)物用70%酒精重新洗滌一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。

3、也可能在用乙醇洗時把質(zhì)粒倒掉了。

4、沒有用RNase消化，不要用放久的 RNase否則會有DNA酶的污染；

5、在沒有進行酶切時,把所提的質(zhì)粒跑一下核酸電泳看看,如果是提核酸的問題那這一步電泳結(jié)果應(yīng)該沒有大于三千的條帶,這樣可以先排除核酸提取的問題.若是沒有酶切時間過長等其他問題的話可以那可以檢查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的問題，建議將超純水換成TE。

用堿裂解法提取的質(zhì)粒,取3ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌涂amp抗性平板，卻出現(xiàn)陽性克隆較少（含綠色熒光蛋白，陽性克隆應(yīng)該顯綠色，在紫外燈下非常明顯，就幾十個菌落）大部分菌落不發(fā)綠，這些菌落比發(fā)綠的菌落小一些的現(xiàn)象，為什么？ 參考見解：

1、做一次陰性對照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生長,說明amp過期,一般這種情況不多見。一般粉末狀的amp不容易失效,如果amp有效的話,可以配制遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)的濃度,如果細(xì)菌耐藥的話,也能生長良好,如不耐藥,則放置數(shù)天仍不見細(xì)菌生長。

2、拿陰性和陽性的細(xì)菌各取數(shù)個放于高濃度的amp液體培養(yǎng)基中,如能生長,說明空白菌中帶有耐藥菌,建議換菌.3、提質(zhì)粒的菌受污染了，重新劃線挑單克隆。

培養(yǎng)基、抗生素、質(zhì)粒提取都沒有問題，而細(xì)菌菌液提取不到質(zhì)粒？

參考見解：如果是氨芐抗性的，有可能是質(zhì)粒丟失造成的。主要是培養(yǎng)時間較長，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的beta-內(nèi)酰胺酶過多，作用時間過長，同時培養(yǎng)基pH值降低，氨芐青霉素失活，從而使無質(zhì)粒的菌株大量增殖。解決的辦法：可以添加葡萄糖，縮短培養(yǎng)時間，改用羧芐青霉素。|||謝謝樓主,還有什么專題也要貼出來啊!|||謝謝分享

到一個小tips。轉(zhuǎn)帖過來和菜鳥分享。大蝦憑手感就可以了,我們還是要學(xué)學(xué)的,受益匪淺

1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強度的環(huán)境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-?R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？

用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

5．在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進行洗滌或重沉淀。

6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？

加進去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。

8．如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉淀DNA？

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20％。本實驗選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。

9．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

10．為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。

11．為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

第二篇：質(zhì)粒提取有關(guān)問題及注意點

質(zhì)粒提取常見問題解析

涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死？

參考見解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時殺菌。蘸了酒精后再燒一小會，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒還是干燒較長時間后，冷卻了再涂。同時作多個轉(zhuǎn)化時，應(yīng)用幾個涂布棒免得交叉污染。

原先測序鑒定沒有問題的細(xì)菌，37℃搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常? 參考見解：這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)粒或比較特殊的序列中。解決辦法：

1、降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。

3、質(zhì)粒抽提有一個酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過高造成的，請大家注意一下！

【有兩種方法可以在提質(zhì)粒前判斷菌生長是否正常：

1、利用你的嗅覺。只要平時做實驗仔細(xì)點就能聞出大腸桿菌的氣味，新鮮的大腸桿菌是略帶一點刺鼻的氣味，但不至于反感。而在泥水狀的菌液中你只要一湊過去就感覺到其臭無比或者沒有氣味，可以和正常菌液對照。

2、肉眼觀察活化菌株。對于生長不正常的菌液進行劃板驗證或者稀釋到濃度足夠低涂板，第二天觀察單克隆生長情況，LB平板生長的DH5A正常形態(tài)在37℃16h后直徑在1mm左右，顏色偏白，半透明狀，濕潤的圓形菌斑，如果觀察到生長過快，顏色又是泛黃的話基本上不正常了。】

未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決？ 參考見解：

1、大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。

2、質(zhì)粒拷貝數(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

3、菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4、堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。

5、溶液使用不當(dāng)：溶液2和3在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

6、吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。

7、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時)：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。

8、乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。

9、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。

10、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。

11、洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12、洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1min可達(dá)到較好的效果。

細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？ 參考見解：

1、很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的要好一些。

2、質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生長情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。

3、判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。

4、菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。達(dá)到OD600 1.5就可以了，（尤其是對于試劑盒提取要注意）另外如果只是簡單的酶切驗證根本無需酚氯仿抽提（安全考慮，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰當(dāng)，轉(zhuǎn)管過程仔細(xì)吸取不會有太多雜志。

為什么加了溶液Ⅱ后，菌體沒有逐漸由混濁變澄清？提出來的條帶幾乎沒有，但是RNA很亮（沒加RNA酶）？

溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液沒有由混濁變澄清，參考見解：

1、可能是因為溶液儲存不當(dāng)，或?qū)掖尾僮鳑]有及時蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較多，相對少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。

2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒有變清，這也會導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下．

3、可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高．如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買試劑盒提．用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的ＲＮＡ酶。

4、如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過程中使膜蛋白變化（數(shù)量變多），很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高溫或者低溫研磨等),然后使用一般的發(fā)放。

5、可能質(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。

加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒有明顯的改變？ 裂解不完全,參考見解：

1、問題可能是發(fā)生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒有沉淀？

2、可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積。

3、可能是“雜菌”污染，如果菌液生長異常快，就有可能被雜菌污染。這種情況一般表現(xiàn)為和目的菌有相同的抗性，生長速度異常，能夠提出質(zhì)粒，跑膠的條帶也異常的亮，但產(chǎn)物不是自己想要的質(zhì)粒，要特別注意一下。抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，為什么要是酚/氯仿混合使用？怎樣使用酚與氯仿較好？

參考見解：酚與氯仿都是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

參考見解：保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊醇？

參考見解：在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，可以降低抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。加入酚/仿抽提，離心后在水相和有機相間沒有出現(xiàn)變性蛋白相層，在隨后的乙醇沉淀步驟中卻出現(xiàn)大量的半透明沉淀，溶解后發(fā)現(xiàn)蛋白濃度很高？

乙醇沉淀時，較純的質(zhì)粒沉淀是白色的（PEG純化的沉淀是透明的肉眼不易發(fā)現(xiàn)），如沉淀是半透明的凝膠狀，則應(yīng)是蛋白含量高。參考見解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次檢測溶液III反應(yīng)完成后的離心上清pH是否在8.0左右？有時由于溶液III配置的問題，會出現(xiàn)溶液III反應(yīng)后離心的上清pH與8.0偏差較大的現(xiàn)象，這會降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差過大也會導(dǎo)致水相和平衡酚互溶。使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒的純度很好，但酶切不能完全切開? 參考見解：

1、確認(rèn)酶的有效性。

2、平衡酚是否被氧化（正常是黃色，而氧化后是棕色的）。

3、是否不小心吸入了痕量的酚。

4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（殘留的鹽類會影響酶切）。

5、乙醇漂洗后是否完全干燥（殘留的乙醇會影響酶切）。

堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA進行瓊脂糖電泳進行鑒定時，看到的三條帶分別是什么？

參考見解：堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，得到的三條帶是以電泳速度的快慢排序的，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。提取質(zhì)粒中RNA沒有去除？

可能是RNase失效或效率不高。參考見解：

1、更換RNase A，并保證其儲存條件是正確的

2、手工提取質(zhì)粒的，可單獨增加一步去除RNA的步驟，溶液III反應(yīng)后，在離心的上清中加RNase，室溫下去除RNA 10min～30min（需要保證RNase A是經(jīng)過失活DNase的），同時較高溫度（如50℃）會更加快速完全的去除RNA，經(jīng)驗所得經(jīng)過高溫處理的質(zhì)粒質(zhì)量不是很高。提取的質(zhì)粒電泳后，為連續(xù)的一片火箭狀？ 參考見解：

1、質(zhì)粒如果鹽離子多，會有走膠變形的現(xiàn)象，如果提到的質(zhì)粒不夠純，會有電泳條帶不平齊的現(xiàn)象。

2、當(dāng)電壓太大時，容易出現(xiàn)火箭狀，而降解應(yīng)該是彌散狀。

3、可能是宿主菌影響的，質(zhì)粒抽提好后，用酚-氯仿處理一下再酶切，若有改善，則為宿主菌影響。轉(zhuǎn)化到其它宿主菌再切。

4、NaOH的濃度過高，會出現(xiàn)火箭狀的結(jié)果。

用堿裂解法提取質(zhì)粒，裂解5分鐘，沒有用酚 / 氯仿抽提，最后用滅菌水溶解質(zhì)粒DNA15min。雙酶切后跑膠一條帶都沒有，原因是什么？ 參考見解：

1、溶解時間稍微短了點，但是根據(jù)各個實驗室RNase不同，這個條件是不同的。在溶解的過程要渦旋處理促進溶解。

2、確認(rèn)一下酶切過程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切體系的Buffer或者是水，特別是水中；其次是酶切體系的問題；建議再把提取的產(chǎn)物用70%酒精重新洗滌一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。

3、也可能在用乙醇洗時把質(zhì)粒倒掉了。

4、沒有用RNase消化，不要用放久的 RNase否則會有DNA酶的污染；

5、在沒有進行酶切時,把所提的質(zhì)粒跑一下核酸電泳看看,如果是提核酸的問題那這一步電泳結(jié)果應(yīng)該沒有大于三千的條帶,這樣可以先排除核酸提取的問題.若是沒有酶切時間過長等其他問題的話可以那可以檢查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的問題，建議將超純水換成TE。

用堿裂解法提取的質(zhì)粒,取3ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌涂amp抗性平板，卻出現(xiàn)陽性克隆較少（含綠色熒光蛋白，陽性克隆應(yīng)該顯綠色，在紫外燈下非常明顯，就幾十個菌落）大部分菌落不發(fā)綠，這些菌落比發(fā)綠的菌落小一些的現(xiàn)象，為什么？ 參考見解：

1、做一次陰性對照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生長,說明amp過期,一般這種情況不多見。一般粉末狀的amp不容易失效,如果amp有效的話,可以配制遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)的濃度,如果細(xì)菌耐藥的話,也能生長良好,如不耐藥,則放置數(shù)天仍不見細(xì)菌生長。

2、拿陰性和陽性的細(xì)菌各取數(shù)個放于高濃度的amp液體培養(yǎng)基中,如能生長,說明空白菌中帶有耐藥菌,建議換菌.3、提質(zhì)粒的菌受污染了，重新劃線挑單克隆。

培養(yǎng)基、抗生素、質(zhì)粒提取都沒有問題，而細(xì)菌菌液提取不到質(zhì)粒？

參考見解：如果是氨芐抗性的，有可能是質(zhì)粒丟失造成的。主要是培養(yǎng)時間較長，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的beta-內(nèi)酰胺酶過多，作用時間過長，同時培養(yǎng)基pH值降低，氨芐青霉素失活，從而使無質(zhì)粒的菌株大量增殖。解決的辦法：可以添加葡萄糖，縮短培養(yǎng)時間，改用羧芐青霉素。|||謝謝樓主,還有什么專題也要貼出來啊!|||謝謝分享

到一個小tips。轉(zhuǎn)帖過來和菜鳥分享。大蝦憑手感就可以了,我們還是要學(xué)學(xué)的,受益匪淺 1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強度的環(huán)境。2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-?R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？

用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

5．在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進行洗滌或重沉淀。6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？

加進去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。8．如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉淀DNA？

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20％。本實驗選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。9．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

10．為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。

11．為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

去年做了半年載體構(gòu)建，連接無疑是其中重要的一關(guān)，根據(jù)自己的實驗心得和已有資料做個總結(jié)，希望對大家有用，同時希望戰(zhàn)友們批評指正！互相進步！首先說說2片段連接

通常是指目的片斷和載體片斷的連接，包括①小片段（目的片斷小于載體片斷的大小）和載體片段的連接，這種情況多些，也比較容易連接，按照說明書要求的比例進行即可，比如TAKARA的pMD19-T Simple Vector連接時Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為1 ：2～10即可，如果效果不佳，檢測一下感受態(tài)細(xì)胞，如果片斷過小比如幾十bp，連接時要加大小片段的摩爾數(shù)，多連幾管，挑選白斑，以上是指雙酶切后的連接，即載體和目的片斷倆端的酶切位點相同；②大片段（目的片斷與載體片斷的大小差不多甚至大于載體的大小）和載體片段的連接，目的片斷與載體片斷的大小差不多的情況應(yīng)盡量避免，因為這會給目的片斷膠回收帶來麻煩，我就遇到過這種情況，膠回收時很是費盡，最后勉強分開，當(dāng)然換個載體也許就解決問題了。我做過3000多bp和pMD19-T Simple Vector的連接，開始不行，后來成功了，連接率不高，我的經(jīng)驗是如果感受態(tài)細(xì)胞沒問題，那就反復(fù)試目的片斷和載體片斷的連接比例，可以超出此范圍1 ：2～10一試。再說說多片斷的連接

做多個片斷的連接，首先強調(diào)一個問題，那就是大家一定要注意所有片斷倆端的酶，把他們的特征要弄得清清楚楚，是否存在同尾酶和同裂酶，多片段同時連接時這個問題就太重要了；多片段連接要總體先規(guī)劃好了，再開始入手設(shè)計引物，否則考慮不周后患無窮啊,呵呵！①多片斷的連接最經(jīng)常的做法是順次倆倆連接（目的片斷和載體片斷的連接），就采用載體上的多克隆位點，注意順序！如果所選載體多克隆位點上的倆個酶切位點比較近，甚至相鄰，最好分步酶切載體，比雙酶切效果好的多，經(jīng)驗！接下來的方法和前面的差不多，就是麻煩些

②多片斷的同時連接，我最多做過四個片斷的同時的連接，當(dāng)然，其中包括載體片斷。做多個片斷的同時連接，不得不把我走過的彎路告訴大家！那就是同尾酶的問題，我也是在合成引物后發(fā)現(xiàn)的這個問題，我的其中一個片斷倆端分別是XhoI和SalI，結(jié)果問題來了，酶切后連接時有可能正連也可能反向連接，如果連正了還好，反了就比較郁悶了，根據(jù)當(dāng)時的實驗設(shè)計，如果想改就得改所有其他片段的引物，硬著頭皮來吧！篩吧！一個原則，小片段要量大，多設(shè)計幾種比例，連吧，挑選白斑，做菌落PCR檢測連接情況，想想覺得痛苦，每個板挑幾十個白斑做鑒定，大部分假陽性，不過最后還是找到了正確連接的克隆，可是浪費了很多時間和金錢，慘痛的教訓(xùn)！感覺多片斷的連接，關(guān)鍵還是片斷之間的摩爾比，大膽嘗試吧！

需要說明的一點，以上主要是針對粘性末端的連接，關(guān)于平端連接，我做的比較少，歡迎其他同學(xué)總結(jié)！

分子克隆實驗專題--

（五）感受態(tài)細(xì)胞的選擇與使用 分子克隆實驗專題--

（五）感受態(tài)細(xì)胞的選擇與使用 常用感受態(tài)細(xì)胞的特性：

TOP10，DH5α：藍(lán)白斑篩選，高效克隆，質(zhì)粒抽提 JM110：甲基化酶缺陷型

SURE：克隆不穩(wěn)定插入片段，降低同源重組 DH10B：文庫構(gòu)建，長片段質(zhì)粒的克隆（150kp

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化）

Stbl2：克隆不穩(wěn)定插入片段，正向重復(fù)，逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，克隆甲基化基因組序列。

Stbl3：克隆慢病毒表達(dá)載體中的正向重復(fù)序列，降低逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中長末端重復(fù)序列的非目標(biāo)同源重組。

選擇適宜的感受態(tài)細(xì)胞

序列的結(jié)構(gòu)，長度，載體種類以及特殊要求等。

選擇適宜的轉(zhuǎn)化方式

熱激轉(zhuǎn)化：常規(guī)克隆，片段較短（<10kb)

電轉(zhuǎn)化: 建庫，基因敲除，長片段（>10kb)感受態(tài)細(xì)胞使用的注意事項

連接產(chǎn)物或質(zhì)粒的量

效價：1μg標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆的數(shù)目，單位為cfu。

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞：106，107，108，109cfu

電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞：108，109，1010cfu

常規(guī)的克隆根據(jù)連接產(chǎn)物和質(zhì)粒的量選擇適當(dāng)效價的感受態(tài)細(xì)胞，特殊轉(zhuǎn)化（如建庫）則選擇最高效價的感受態(tài)細(xì)胞，一般選用電轉(zhuǎn)。

感受態(tài)細(xì)胞效價測定

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒：pUC18, pUC19,pBR322

超螺旋，超純

質(zhì)粒使用量：<5μl, <1ng

設(shè)立陰性對照，多涂幾板(3塊以上）取平均值。

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的使用

質(zhì)粒PCR擴環(huán)的產(chǎn)物以及進行體內(nèi)重組的線性片段不宜選用DH5α高效感受態(tài)細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化。

可能原因： DH5α本身不適合這種操作；高效感受態(tài)制備的試劑對于這種轉(zhuǎn)化有抑制作用。

可選用TOP10感受態(tài)細(xì)胞。

電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的使用

盡量降低轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的離子濃度，防止細(xì)胞被擊穿。

大量的連接產(chǎn)物提純后進行轉(zhuǎn)化，或者進行透析后再轉(zhuǎn)化，有些進行體內(nèi)重組的酶切產(chǎn)物進行提純后進行轉(zhuǎn)化。

氨芐平板的衛(wèi)星菌落

氨芐平板涂板后如果時間太長，就會產(chǎn)生衛(wèi)星菌落，在單克隆周圍生成小的克隆。

氨芐抗生素只能抑制菌落生長，而不能殺死，當(dāng)抗生素降解失效后，被抑制的菌體重新形成菌斑。

解決方法：使用新鮮配置的氨芐培養(yǎng)基平板，提高氨芐的使用量，選用高質(zhì)量的氨芐抗生素。

感受態(tài)細(xì)胞的取用

特殊制備的感受態(tài)細(xì)胞在超低溫條件下可以維持效價半年以上，在制成之后要立即放入超低溫冰箱。

感受態(tài)細(xì)胞對溫度的變化非常敏感，取用時要快取快放，不能將整包的細(xì)胞放在外面然后取用。

看清標(biāo)記，防止拿錯。分子克隆實驗專題-

（二）酶切連接要點探討 分子克隆實驗專題-

（二）酶切連接要點探討

聲明：關(guān)于酶切連接的實驗做法我在之前的帖子里已經(jīng)非常詳細(xì)的介紹了，原帖鏈接：http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=2311683 我們在這里對相關(guān)問題進行探討 1.酶切

（1）

PCR產(chǎn)物的酶切

①酶切位點兩端要有適當(dāng)?shù)谋Ｗo堿基。一般在設(shè)計引物的時候會在新添加的酶切位點前加4-5個堿基當(dāng)做保護堿基，這種保護堿基的序列沒有特殊的要求，不要添加完后使你的引物不能用就行了（好引物應(yīng)該具備的條件大家應(yīng)該都知道吧）

–

NEB http:// ?

分步酶切順序的選擇：選擇適當(dāng)?shù)拿盖许樞?低鹽-----高鹽）甲基化位點的影響

設(shè)計方案時盡量避免使用 ?

JM110

PCR 擴增后再切 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量與定量

質(zhì)量：抽提過程中雜質(zhì)的殘留

定量：分步酶切時,酶切足夠的DNA,保證第二步回收到濃度較高的載體或片段 酶切不完全

公用buffer選擇不當(dāng) ?

質(zhì)粒DNA量過多 ?

酶的活性不高 酶切出的小片段回收效率低 ?

PCR擴增后再酶切

回收上柱時加終濃度為20%的異丙醇 ?

Glass beads

(> 40 bp)3.影響連接的因素

（1）

片段的質(zhì)量

片段回收時紫外線照射對克隆效率的影響

（2）摩爾比

In general, maximum cloning efficiency is achieved when using a 2:1 molar ratio of insert: vector.分子克隆實驗專題-

（一）質(zhì)粒提取 分子克隆實驗專題-

（一）質(zhì)粒提取 知識儲備：

質(zhì)粒(Plasmid)是一種宿主染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主的細(xì)胞質(zhì)中。

質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。常見的天然質(zhì)粒有F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。

質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型: 緊密控制型(Stringent control)-低拷貝和松馳控制型(Relaxed control)-高拷貝。

前者只在細(xì)胞周期的一定階段進行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時,它也不能復(fù)制,通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有 1 個或幾個質(zhì)粒,如 BAC。后者的質(zhì)粒在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制,在每個細(xì)胞中有許多拷貝,一般在 20 個以上,如 pUC57,~200 copies。質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進入細(xì)菌中擴增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值。

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA原理：

根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA的結(jié)構(gòu)差異來實現(xiàn)分離的。在pH12-12.5時，線性DNA被徹底變性，但共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA雖然H鍵也發(fā)生斷裂，但兩條互補鏈仍會緊密纏繞結(jié)合在一起。當(dāng)在溶液體系中加入pH4.8的KAC時，溶液恢復(fù)中性，質(zhì)粒DNA迅速復(fù)性，染色體DNA則由于變性而相互混亂纏繞，不能復(fù)性，從而離心即可以把變性的染色體DNA沉淀和蛋白-SDS復(fù)合物沉淀分離出來。試劑成分：

Buffer S1(pH 8.0)

+RNase

50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)

10mmol/L EDTA(pH 8.0)Buffer S2(pH12-12.5)

0.2mol/L NaOH

1%SDS Buffer S3(pH4.8)

3mol/L 乙酸鉀

冰醋酸(HAC,乙酸）

異硫氰酸胍或鹽酸胍 質(zhì)粒檢測：

電泳檢測：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

吸光值檢測：采用分光光度計檢測260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說明有RNA污染。Buffer S1的作用：

任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的p H，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不過的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。

那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA.如果哪天你手上正好缺了Buffer S1，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。

Buffer S2的作用

用完后一定要把蓋子擰緊，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。

很多人不知道其實破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為 SDS也是堿性的，只是弱了點而已。

很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩。Buffer S3的作用

每個人都知道，Buffer S3加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。

最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在Buffer S2中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然 SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate，PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，Buffer S3加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA 自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是Buffer S3加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復(fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實沒有關(guān)系。Buffer S3加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。

第三篇：質(zhì)粒提取簡介及問題分析

質(zhì)粒提取簡介及問題分析

一、導(dǎo)論

(一)質(zhì)粒提取的原理：

為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：

溶液I，50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0；

溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸。

讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言幾乎沒有任何影響，所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽質(zhì)粒呢？只要用等體積的水或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。

輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2%的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer(雙層膜)結(jié)構(gòu)向micelle(微囊)結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌(不妨可以自己試一下)，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢?那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩。

溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS，也會有少量沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉(SDS)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(PDS)，而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。(二)細(xì)菌的收獲和裂解。

細(xì)菌的收獲可通過離心來進行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。盡管針對質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出精確的裂解條件不切實際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。

1、大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。

2、可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

3、一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株)用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當(dāng)隨后用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心進行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時，不宜使用煮沸法。

4、當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA 株，如HB101)中小量制備質(zhì)粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能完全滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質(zhì)粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚：氯仿進行抽提)可以避免此問題。

5、目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進行選擇性擴增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來煞為費事，而在對數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。(三)質(zhì)粒DNA的純化。

常用的純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。如，用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。溴化乙錠通過嵌入堿基之間而與DNA結(jié)合，進而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加，從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和(每2個堿基對大約結(jié)合1個溴化乙錠分子)。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。

二、質(zhì)粒DNA的小量制備(一)細(xì)菌的收獲和裂解。

1、收獲。

1)將2ml含相應(yīng)抗生素的LB加入到容量為15ml 并通氣良好(不蓋緊)的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。

2)將1.5ml培養(yǎng)物倒入離心管中，4℃、12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。3)吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。

2、堿法裂解。

1)將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。溶液I可成批配制，高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細(xì)菌沉淀在溶液I中完全分散。

2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個內(nèi)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。

3)加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3-5分鐘。

4)用離心機于4℃、12000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

5)可做可不做：加等量酚：氯念，振蕩混勻，用微量離心機于4 ℃以12000g離心 2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不必用酚：氯仿進行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。6)用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合，于室溫放置2分鐘。7)用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘。

8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。9)用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒(如Xf3或pUC)，其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3-5μg。

ii.如果要通過限制酶切割反應(yīng)來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶，在適宜溫育1-2小時。將剩余的DNA貯存于-20℃。iii.此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物：。

3、煮沸裂解。

1)將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。STET：0.1mol/L NaCL，10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100。

2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。3)將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。4)用微量離心機于室溫以12000g離心10分種。5)用無菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。

6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉(pH5.2)和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。7)用微量離心機于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。

8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。9)加1ml 70%乙醇，于4℃以12 000g離心2分鐘。

10)按步驟8)所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體(2-5)分鐘。11)用50μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌株(endA 株，如HB101)中小量制粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能完全滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在Mg 2 存在下溫育(V中用限制酶時)質(zhì)粒DNA可被降解。在上述方案的步驟9)之間增加一步，即用酚：氯仿進行抽提，可以避免這一問題。(二)質(zhì)粒DNA小量制備的問題與對策。

堿裂解和煮沸都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒有什么麻煩。多年來，在我們實驗室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題：

1、有些工作者首次進行小量制備時，有時會發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。

2、在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現(xiàn)無質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。

三、質(zhì)粒DNA的大量制備(一)在豐富培養(yǎng)基中擴增質(zhì)粒

許多年來，一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴增質(zhì)粒只對生長在基本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物2-5mg質(zhì)粒DNA，而且重復(fù)性也很好。

1)將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數(shù)晚期(DNA 600約0.6)。培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關(guān)物進行接種。

2)將含相應(yīng)抗生素的500ml LB或Terrific肉湯培養(yǎng)基(預(yù)加溫至37℃)施放入25ml對數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時(搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分)，所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。3)可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復(fù)的質(zhì)粒，有必要通過擴增。這些質(zhì)粒只要從生長達(dá)到餉新一代的質(zhì)粒(如pUC質(zhì)粒)可復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)，因此無需擴增。這些質(zhì)粒只要從生長達(dá)到飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進行處理，具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點，可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質(zhì)粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細(xì)菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。

4)于37℃劇烈振搖(300轉(zhuǎn)/分)，繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時。(二)細(xì)菌的收獲和裂解。

1、收獲。

1)4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。2)將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

3)按步驟1)所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。

2、堿裂解法。

1)將冼過的500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[來自收獲細(xì)菌的步驟3] 重懸于10ml(18ml)溶液I中。2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)]。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。

3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。

4)加15nl(20ml)用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、高分子量RNA和鉀-SDS-蛋白質(zhì)-膜復(fù)合物。

5)用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分[步驟4)]。6)上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。7)用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。

8)小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70%乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。

9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。

四、質(zhì)粒DNA的純化

(一)聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒DNA。

1、將核酸溶液所得]轉(zhuǎn)入15mlCorex 管中，再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于4℃下以10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。

2、將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇，充分混勻，用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖)于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧，回收沉淀的核酸。

3、小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70%乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

4、用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。

5、加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量離心機于4℃以12000g離心5分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。

6、吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。

7、將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積(約1ml)乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒DNA。

8、吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。

9、吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。10)用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1：100稀釋[用TE(pH8.0)] 后測量OD 260，計算質(zhì)粒DNA的濃度(1OD260=50μg質(zhì)粒DNA/ml)，然后將DNA貯于-20℃。

10、純化。

一些試劑的生化作用原理

1、溶液Ⅰ

溶霉菌：水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA受機械剪切力作用而降解。

EDTA：金屬離子螯合劑，螯合Mg2+，Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶(DNase)對DNA的降解作用(DNase 作用時需要一定的金屬離子強度作輔基)，同時EDTA的存在，有利于溶霉菌的作用。因為溶霉菌的反應(yīng)要求有較低的離子強度環(huán)境。

2、溶液Ⅱ-NaOH-SDS液

NaOH：核酸在pH值為5~9的溶液中是最穩(wěn)定的，但pH大于12或小于3時，就會引起雙鍵之間氫鍵的解離而變性。在溶液Ⅱ中的NaOH濃度為0.2N，加入提取液時，該系統(tǒng)的pH就會高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

SDS：為陰離子表面活性劑，主要功能有：溶解細(xì)胞膜上的脂肪與蛋白，從而破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白SDS蛋白質(zhì)結(jié)合為復(fù)合物，使蛋白變性沉淀下來，但SDS能抑制核糖核酸沒的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，以防用RNase去除RNA時受到干擾。

3、溶液Ⅲ-3M KAc(pH4.8)溶液：

KAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸，所以該溶液實際上是KAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的KAc溶液是為了把pH 12.6的抽取液pH調(diào)回到中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol∕L KAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷。減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物作用后，能形成溶解度較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀完全。

4、為什么用無水乙醇沉淀DNA: 此為實驗中最常用的沉淀方法。乙醇的優(yōu)點是低度極性，可以以任意比例和水相混容，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液時以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在的DNA，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合。其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來代替無水乙醇(因無水乙醇價格更貴)，但加95%乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中總有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，會影響收得率。折衷的做法是初次沉淀DNA是可用95%乙醇代替無水乙醇，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用異丙醇選擇性沉淀DNA，一般在室溫下放置15~30min即可。

使用乙醇在低溫條件下沉淀DNA，分子運動大大減少，DNA易于聚合而沉淀，且溫度越低，DNA沉淀得越快。

5、RNase處理核糖核酸后，再次沉淀DNA時為什么一定要加NaAc至最濃度達(dá)0.1~0.25M。

在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA納鹽沉淀。當(dāng)加入大量鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全。當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不太好，在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進行洗滌或重沉淀。

6、為什么將DNA保存于TE緩沖液中？ 在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa2=7.2)、硼酸系統(tǒng)(pKal=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可以作為DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根將與Ca2+產(chǎn)生沉淀；在DNA酶反應(yīng)時，不同的煤對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高鹽離子濃度，有哦則要求低鹽離子濃度，采用Tris-HCL(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖對時Tris+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCL系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。

操作要領(lǐng)：

1、該實驗成功的標(biāo)志是把染色體DNA，蛋白質(zhì)與RNA去除干凈。獲得一定收得率的質(zhì)粒DNA。去掉染色體DNA最為重要，也較困難。因為在全部提取過程中，只有一次機會去除染色體DNA，其關(guān)鍵步驟是加入溶液Ⅱ與溶液Ⅲ時，控制變性與復(fù)性操作時機，既要使試劑與染色體DNA充分作用使之變性；又要使染色體DNA不斷裂成小片段而能與質(zhì)粒DNA相分離。這就要求試劑與溶菌液充分搖勻。搖動時用力適當(dāng)。一般加入SDS后要注意不能過分用力振蕩，但又必須讓它反應(yīng)充分。

2、當(dāng)加入溶液Ⅱ5min后，若沒有看到溶液變稠時，實驗不能再繼續(xù)做下去了。

3、配置試劑時，要用重蒸水配置外，其器皿必須嚴(yán)格清洗，最后要用重蒸水沖洗三次，凡可以進行滅菌的試劑與用具都要經(jīng)過高壓蒸汽滅菌，防止其他雜質(zhì)或酶對DNA的降解，對Ep管、Tip頭與非玻璃離心管等只能濕熱滅菌，然后放置在50℃溫箱中烘干使用。

4、用乙醇沉淀DNA時，要觀察水相與乙醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才可放在冰箱中去沉淀DNA。

第四篇：質(zhì)粒抽提常見問題與解答

1.沒有提出質(zhì)粒或者質(zhì)粒收獲量很低

A菌種老化

建議：對于甘油保存的菌種，需要先進行活化，涂布或者劃線菌種，重新挑選單菌落進行液體培養(yǎng)，并對菌種進行初搖活化，按照1:500的比例進行菌種培養(yǎng)。二次培養(yǎng)時間最好不要超出16小時(或者OD600不超過3.0)。

B低拷貝質(zhì)粒

建議：如果是由于低拷貝質(zhì)粒引起的質(zhì)粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量，并相應(yīng)增加各種Buffer的用量。

C質(zhì)粒丟失

建議：某些質(zhì)粒在次繼代培養(yǎng)的過程中會出現(xiàn)丟失的想象，另外檢查篩選抗生素的濃度是否正確。

D裂解不充分

建議：如果采用超過推薦量的菌體進行質(zhì)粒制備，會導(dǎo)致菌體裂解不充分。可適當(dāng)減少菌體的用量或者相應(yīng)增大各種Buffer的用量。并確保細(xì)菌混懸均勻。

EBuffer中有沉淀未溶解

建議：BufferB1和BufferN1，BufferC1在溫度較低時會出現(xiàn)沉淀，使用前請檢查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，請置于37℃溫育片刻，待溶液澄清后使用。

FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇

建議：按照說明書要求加入要求量的無水乙醇，使用后旋緊瓶蓋，防止乙醇揮發(fā)。另外對于質(zhì)粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗滌，請確保乙醇的體積不小于70%。

G離心柱中乙醇?xì)埩?/p>

建議：漂洗后，可適當(dāng)延長離心時間，盡量去除殘留的乙醇。另外對于質(zhì)粒中提，大提和朝大量提取，建議離心后，將柱子或大漏斗用吹風(fēng)機冷風(fēng)吹片刻(或置于65℃烘箱)，以徹底去除殘留的乙醇，便于洗脫和后續(xù)實驗操作。

H洗脫液加入位置不正確

建議：洗脫液應(yīng)加在膜中央，已取得最好的洗脫效果。

I洗脫液pH值不正確

建議：將DNA從柱子上洗脫下來的最適pH值在7.0-8.5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會顯著影響洗脫效果，請使用試劑盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)進行洗脫，如果用ddH2O進行洗脫，請確保pH在7.0-8.5之間。

J洗脫體積的選擇

建議：洗脫體積將會影響最終的收獲量，洗脫體積越大，收獲量越高，但是濃度將會降低。請使用試劑盒推薦的洗脫體積進行洗脫，以保證最好的收獲量和濃度。如果需要高濃度的質(zhì)粒，請減少洗脫體積。另外，如果想收獲高濃度高收獲量的質(zhì)粒，請根據(jù)試劑盒要求進行二次洗脫，再用推薦的方法進行沉淀，濃縮質(zhì)粒。

K洗脫時間的選擇

建議：加入洗脫Buffer后，室溫放置2-5分鐘，將有利于洗脫。

2.質(zhì)粒純度不高

A蛋白質(zhì)污染

建議：選擇推薦量的菌體，離心后小心吸取上清，如果上清液中混有懸浮物，可再次離心，以徹底去除蛋白。另外如果用ddH2O作為稀釋溶液,測定OD比值，比值可能較低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer來稀釋。

BRNA污染

建議：檢查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA應(yīng)該存放在4℃，如果存放時間過長，或者沒有正確存放，RNaseA活力下降，請重新加入RNaseA。

C基因組DNA污染

建議：加入BufferB1后，輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩渦旋，加入BufferB1的處理時間最好不要超過5分鐘。

D菌株為含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株

建議：請選用含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株質(zhì)粒DNA提取試劑盒，或者轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到不含內(nèi)源核酸酶宿主菌株中。

3.加樣時DNA飄出加樣孔外

原因：柱中殘留乙醇未除干凈。

建議：洗脫質(zhì)粒DNA前確保無乙醇?xì)埩粼谥由稀？稍匐x心或者抽真空。

第五篇：銷售常見問題解析

1、網(wǎng)上了解價格

這類客戶通常會連續(xù)轉(zhuǎn)過幾家店后才會決定是否購買，例如：在網(wǎng)上了解的是N518 來店后直接會問N518多少錢，銷售員在這時千萬不要直接報價，因為我們在價格方面沒有優(yōu)勢，當(dāng)客戶問這個問題的時候是一個非常好的轉(zhuǎn)型的一個機會，通常我會說您好，電紙書N518系列有三款型號，不知道您說的是哪款，此時要看是什么樣的客戶，如果是那種比較強勢的就不要吞吞吐吐的，要自信一些很有底氣的報價：N518我們?nèi)珖慕y(tǒng)一價格是XXXX當(dāng)客戶轉(zhuǎn)身要走時一定不要放棄，緊跟一句您就看中518了嗎？我們最新的產(chǎn)品您了解一下吧，我給您介紹一下好嗎？通常客戶都會停下腳步 等待你介紹，這時的機會很大，接下來你可以問客戶問題，先要了解客戶對產(chǎn)品到底了解多少，根據(jù)他所了解的一些產(chǎn)品相關(guān)的東西你在給出相應(yīng)的問題和解決方案，切忌：想盡一切辦法給客戶驚喜，最后讓他覺得你給介紹的產(chǎn)品才是他最需要的2、長期關(guān)注價格 經(jīng)常在賣場里詢價

這類客戶通常會給銷售員一個假象，路過我們店面的時候會順嘴問一句你家XX電紙書多少錢，你說什么都不理你就讓你報下價格，然后轉(zhuǎn)身就走。

如果遇到類似這樣的客戶大家不要慌，越是這樣的客戶說明他越是謹(jǐn)慎，越是謹(jǐn)慎就越經(jīng)不住我們嚇，這時最好的武器就是我們的形象，案例：我遇到過這樣的一個客戶，產(chǎn)品是N518我報的價格是2980 當(dāng)時他就很生氣說了一句你們怎么這么貴，當(dāng)時我就覺得有希望，我說不是我們價格貴，是全國都是這個價格 我又問他您問到多少錢啊 他很不情愿的告訴我2600 我就笑了一下您被騙了 應(yīng)該是2300當(dāng)我說完這句話的時候客戶就是滿臉的疑問緊接著我就很熱情的把請進店里 跟他說產(chǎn)品售后，給他贈值服務(wù)，跟他講為什么價格亂為什么什么價格都有在問他相關(guān)的需求為他提出其他的方案，有的時候即使你知道客戶就是要高端你也要適當(dāng)?shù)耐葡碌投撕苷嬲\的和他說：其實您用510就可以了完全不用那么高端的，讓客戶覺得你是在為他著想，是客戶更加信任你 最后價格絕對不是問題。

備注（請專賣店的銷售人員利用好自己的形象，我們的專業(yè)術(shù)語，一定把講客戶和談客戶區(qū)分開，朋友式的聊天和買賣式的交易談話給人的感覺是完全不一樣的，一切為客戶著想 最后肯定是談客戶，而不是講客戶）

3.預(yù)算有限

我比較喜歡轉(zhuǎn)型，我相信每個人都有自己的銷售方法 我最喜歡的還是轉(zhuǎn)型，因為在轉(zhuǎn)型的過程當(dāng)中你又機會和客戶走的更近，讓客戶更加信任你，主要表現(xiàn)就是你在不停的為他解決問題，最后你選出的產(chǎn)品肯定是可以滿足他需求的產(chǎn)品。轉(zhuǎn)型的前提 對產(chǎn)品要非常了解，任意拿出幾款產(chǎn)品都要說出各自的優(yōu)勢 無論高端低端都有個自得特點 用心就能想的出來 簡單列舉幾個低端比高端價格除外。1 N510D20510待機時間超長 一定比d20長 穩(wěn)定性好體積小 比D20更方便攜帶n517n518單手持的時候517明顯比518要舒服，518指示燈亮影響看書，體積比517重，筆沒有517的舒服

3d21f21我想每個人對這兩款產(chǎn)品都很尷尬 有 D21的時候針對個人用戶F21就不知道該怎么推了 不過個人發(fā)

現(xiàn)F21翻頁速度要比D21快很多

請大家根據(jù)個人需求去推相應(yīng)的產(chǎn)品，不要一味的推高端，一切為客戶著想才是一個成功的銷售員該做的。

產(chǎn)品技巧的演示

位置: 這里的位置是指你和客戶所站的位置，1、你要站在一個不容易讓客戶很輕松就出店的位置可以理解為客戶前面讓他不容易擺脫你

2、盡量的和客戶站的近一些 特別是中老年人 因為賣場一般都比較雜亂 有的時候你在介紹產(chǎn)品的時候容易聽不清對你銷售產(chǎn)品有影響

3、盡量讓客戶正面對著一個死角這樣的話在你給他演示的過程中避免它看見代理商的店 讓他的注意力集中在你的店里防止出去詢價

演示內(nèi)容:產(chǎn)品演示前盡量裝一些市面上比較暢銷的書籍，或比較不錯的有聲讀物，來吸引客戶，初步讓客戶產(chǎn)生興趣，盡量找一些比較不錯的PDF文件或者反復(fù)試驗不出問題的 WORD文檔，在演示帶手寫的電子書的時候一定要讓客戶體會到漢王手寫識別的功能，在演示OCR軟件的時候盡量用公司提供的演示樣張。根據(jù)需求演示功能 給自己留有余地：銷售過程中要問清客戶需求了解需求后在演示相應(yīng)的功能，在沒有確定成交的情況和已經(jīng)滿足客戶的初步需求的時候 剩下的產(chǎn)品特點先不要說，因為這一點可能成為我們和客戶談判最后的底牌，同時也是為轉(zhuǎn)型做鋪墊

銷售過程中要問的問題

其實在銷售過程中有很多問題，并不是固定的 我總結(jié)的這點也只不過是平時比較常問的，主要的目的還是要引導(dǎo)客戶，幫助客戶發(fā)現(xiàn)自己需求，但在問問題之前請銷售員一定不要刻意的去問，是在兩個人聊天聊的挺投機的時候去問，比如第一句就在客戶進店點名電子書的時候去問，主要起兩個作用 1、看客戶是否對我們的產(chǎn)品有所了解，如果說聽說過 或者直接說了解過那這個人很可能就知道產(chǎn)品的價格在報價的時候就要多加注意

2、如果說沒了解過 那我們就可以熱情主動的和客戶說那您坐 我給您詳細(xì)介紹下，緊接著拿出演示機給客戶講解。第二問題就是要近一步的鎖定客戶的目標(biāo)。看客戶到底需求什么樣的產(chǎn)品，第三個問題主要還是在同客戶溝通的時候去提出來這個問題的目的是吧客戶引開，當(dāng)客戶說出喜歡看什么書時可以把我們準(zhǔn)備好的資源給客戶看，近一步交流 了解客戶。當(dāng)客戶自己不知道該選擇什么，或者你和客戶已經(jīng)談的很好的并且很信任你你可以這樣去發(fā)問 您覺得這款怎么樣？ 可能客戶已經(jīng)有理想的選擇 可你提出這個問題可能會給他一個新的驚喜。第五個問題當(dāng)客戶被你說東心了在猶豫的時候千萬不要和停下來。這個時候問這句話是最合適的 因為如果你幫他解決完他擔(dān)心的問題他基本沒有退路了當(dāng)你給客戶介紹完產(chǎn)品，并且很全面客戶仍以言不發(fā) 起身要走 這時一定要上前問一句，肯定是你之前某個細(xì)節(jié)出了問題不要放棄近一步了解。在銷售過程中沒有固定話術(shù)，大家記住一點引導(dǎo)客戶 不停的拋出問題和難題，然后在不停的解決你所給客戶拋出去的難題。@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@2

首先，賣產(chǎn)品就是在賣自己，顧客之所以會選擇購買你的產(chǎn)品就是因為相信你，相信從你口中介紹出來的產(chǎn)品，你在推銷你的產(chǎn)品的同時也是在推銷你自己，所以想做好銷售就要先學(xué)會做人。

銷售是一門學(xué)問，不是簡單的介紹產(chǎn)品，報個價，這樣的事情任何人都能做得來，就像“輕松銷售法”里面所說的以明確、清楚、只鎖定一個目標(biāo)為一個方向。每一句就是要達(dá)到一個目的為一個單位。比如如果顧客正在詢問產(chǎn)品可以這樣主動反問顧客問題：“先生/小姐，請問您是個人用還是單位用”這樣問的目的是要了解顧客是個人用戶還是單位采購。

做銷售最重要的一點就是要“強勢”，在有些人看來強勢是厲害一點，態(tài)度

蠻橫一點，其實不然。強勢是讓你在跟顧客交流時能占有主動權(quán)，主動去引導(dǎo)顧客，使顧客跟著你的思路走下去，不要出現(xiàn)顧客帶著你走的局面，這樣銷售產(chǎn)品會顯的比較被動，換句話說顧客會欺負(fù)你，比如討價還價，索要贈品等。如果你不能滿足他的要求他就會拿不買來要挾你。

總的來說今天再看輕松銷售法要比第一次看理解的更透徹一點，因為這畢竟是自己做零售的這一年來親身經(jīng)歷的事情，想說的還有很多現(xiàn)在就分享到這里。@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@2222

將客戶依照其個性分解為17種類型，根據(jù)這些客戶類型的談話特點，我們相應(yīng)采取一些溝通談話的對策

1、健談型

? 客戶可能只顧自己的感受暢談，不要讓夸夸其談的顧客將你引入和銷售會談毫不相關(guān)的其他話題中，要抓住一切機會禮貌地將談話引入正題。(經(jīng)常會有被說暈的感覺,聽對方滔滔不決的講他們公司和公司的產(chǎn)品)

2、少言寡語型

這種客戶說得太少，甚至你問一句他就答一個字，不然就是用“哼”、“啊”作答。然而，你不要失去耐心，盡量不要用封閉式的提問，提出一些不能僅僅用“是”或“否”回答的問題，選擇開放式的提問打開他的話匣子。話語要顯示出你獲得信息的熱情，來調(diào)動客戶的積極性。要比平日更具耐性，直至客戶開尊口，并示意客戶說下去。（說了半天對方?jīng)]音，還要來一個喂？一定不要出現(xiàn)這個景象,一定要多問客戶）關(guān)鍵字“什么”、“哪里”、“告訴”、“怎樣”、“為什么”、“談?wù)劇薄ⅰ叭绾巍?/p>

3、因循守舊型

? 這種客戶會聆聽，但會在購買決策上磨蹭，如果不及時采取促成交易的行動或條件，時間消耗下去也將會失掉這單生意。要向客戶指出信息帶來的幫助，如果有非常合適的項目也可以提供給他，或提出來更好的方案。如果這次你的提案和以往有些不同也可以強調(diào)新方案的優(yōu)勢，說明與以往的不可比性。

4、反對型

? 往往客戶上來先表示反對，來挫你的銳氣。事實上是要爭取談判的主動地位。有可能反對是無理的，但你盡量不要與其爭論和回?fù)簟⒈３掷潇o，聽他把話說完，同時面帶微笑表示談判還可以進行下去。一方面你抓住客戶提出的需要（主要是執(zhí)行效果的）表示可以調(diào)整方案

如果你能夠現(xiàn)場就把方案調(diào)整過來了，馬上再來詢問“如果這樣如此--------可不可以？”；另一方面把客戶的意見加到方案中，來確認(rèn)“您看是不是這樣？”。＊若客戶再反對，你可能要重新思考方案的價值了，＊給自己留后路先撤回來＊，請客戶再給機會進行下一個方案＊。

5、膽怯型

這類客戶往往是沒有經(jīng)驗或沒有決策權(quán)，不愿意負(fù)責(zé)。如果是他沒有經(jīng)驗，要提供引導(dǎo)、保證和支持，幫助客戶克服成交的擔(dān)心心理，鼓勵客戶，證明他決策的正確，使其放松壓力，表示你可以成為他信任的朋友。若是他沒有決策權(quán)，一方面可以陳述方案的要點與效果的描述令他確信這是個好生意；再有就是請他引見

能夠決策的人物出場。

6、自我為中心型

? 這種客戶具有優(yōu)越感、愿意用以上對下的口吻講話。保持上下的距離會令他有良好的感覺。仔細(xì)地聆聽并且恭維他，在合適的時候，向他征詢意見，把他的主意變成你的生意。（如果您的業(yè)務(wù)可以輔射到河北，天津就建議您用個北方區(qū)更劃算，您看呢？）

7、果斷型

? 這類客戶很自信，知道將要得到什么。如果方案得到認(rèn)同不要給客戶過多的銷售解釋，盡快將注意力提到合同要求上。對客戶關(guān)心的內(nèi)容只給必要的細(xì)節(jié)，要嚴(yán)格忠于事實，因為他可能是通過細(xì)節(jié)來驗證他的判斷。

8、精明型

? 這類客戶善于搬出不同方案進行比較，或用一方的信息銷售人員的方案對付另一方信息銷售人員，要應(yīng)用巧妙的恭維來表達(dá)對他的判為討價能力的贊賞，同時表示在象他這樣如此精明的客戶面前，你就遇到了識貨的人/懂行的人/專家。這類客戶是砍價的專家，甚至胡砍一通，你就更要采用“示弱”的姿態(tài)，點明對方的精明已經(jīng)使你無利可圖，要對方手下留情。（您可真是高手，我們從來沒有過您這么多的增值服務(wù)，希望您今年用的好，能與您長期合作我非常榮幸）

9、質(zhì)疑型

? 這類客戶會找到方案中的問題點提出懷疑，不要躲避問題，對他的反對做出反應(yīng)，但不要和他爭論，確實是你的問題就坦然承認(rèn)，也別做過多解釋，否則你越描越黑，給他感覺問題越來越大。若不是你的問題，只是對方虛張聲勢或小題大做，要敢于說話，應(yīng)用邏輯和已證明的事實，有可靠的數(shù)據(jù)支持最好。

10、牢騷型

? 這是個事事不順心的客戶，牢騷是他發(fā)泄和減壓的方式。你要特別快樂，不要被他的心情所影響，力圖找到困擾他的麻煩是什么，搞清是與你方案有關(guān)的原因還是除此之外的原因。是與你有關(guān)的原因，要聽清楚，表示同情和關(guān)切。是你能解決的不妨表示可以幫忙試試，千萬別都攬下來！有些你做不到。若不是你的原因，客戶他發(fā)完了牢騷可能就好了。別讓客戶陷在牢騷里，樂觀開導(dǎo)，轉(zhuǎn)移話題，為了繼續(xù)談你的事。(立邦)

11、條理型

? 這類客戶做事緩慢，似乎對你提出的每句話都在權(quán)衡，你急他不急。你表示很急切，可能他會采取更保守的態(tài)度，或用你急切的心態(tài)壓制你。調(diào)整你的步伐，和他保持一致，放慢速度，你可能還可以獲取對方更多的需求信息，在給對方的方案還可以盡量向細(xì)節(jié)上擴展，使他有充分的時間接受如做些宣傳方面的信息。最好在見面前就給他方案，留時間讓他消化，但也要注意方案的周全性。

12、依賴型

? 這類客戶在做決定時需要有人幫助、參謀，來證明他決定的正確。你最好把參謀的角色擔(dān)當(dāng)起來。為了解客戶的需要，在你可以在首次接觸時就問他一些問題，然后在后面跟進時說明你的產(chǎn)品方案就是為他量身訂做的，能最好地滿足他的需要。在談話時將上一次的結(jié)果作為這次的開始，“您上次要我做一個有關(guān)某某的計劃，我給您做好了”“我把和您溝通的內(nèi)容

做了一個方案,我給您發(fā)過去您看一下?”。在細(xì)節(jié)的處理上，可以解釋為就是圍繞客戶的要求制定的13、挑剔型

? 這類客戶看好信息可能也不會說OK，因為至少他要與你討價還價，還會提出一些不滿意，實際上，他需要你的東西才會花精力與你談判，你必須強調(diào)信息的好處,后期的增值服務(wù),證明我們的信息值這個價錢，而且不要把你能守住的底價過早地報出來，留有還價的余地。再有，做讓步的時候要讓對方感到，你的每次讓步都是不容易的。而且可以讓對方付出一些代價，例如你答應(yīng)客戶提出的優(yōu)惠的價格，但要讓對方介紹幾個客戶等。

14、沖動型

這類客戶很容易下結(jié)論，談判的節(jié)奏也比較快。見面要直接步入正題，不要繞圈子，可以提出建議，通過這個建議客戶就能直接提出結(jié)果。就是說結(jié)論要從客戶的嘴里說出來。你要注意的是把合同帶上，能簽就簽，不往后拖。

15、分析型

? 這類客戶喜歡數(shù)據(jù)、事實和詳盡的解說，這種客戶富有條理，如果對客戶提案需要做些數(shù)據(jù)支持的準(zhǔn)備，在提案過程中注意你的條理性，給客戶的信息越多越好。結(jié)論最好是清楚的，不要模棱兩可。(一般在和市場部策劃部負(fù)責(zé)人談判時會遇到這樣的問題,特別是一些大企業(yè))

16、感情型

? 這類客戶對個人感情看得極重，你應(yīng)該和這類客戶逐漸熟識，每次通話都帶給他一個好消息或提到一個好消息，讓他能高興起來。全身心地投入談話并且保持你對他的專注。和他建立日常聯(lián)系，建立私人友誼對工作深有益處。

17、固執(zhí)型

這類客戶總是裝出很重要的樣子，擺老大的派頭。他如果對方案明顯地表示出錯誤和不專業(yè)也不要指出來，向客戶表明你是極尊重他的，抬高客戶，同時也抬高你自己，有可能的話向他致以真摯的夸獎。注意他流露出來的意向，抓住他的意思，把你的主意變成是他的主意通過的可能性就會大大提高。

? 一流的公司賣標(biāo)準(zhǔn)

? 二流的公司賣品牌

? 三流的公司賣服務(wù)

? 四流的公司賣產(chǎn)品差導(dǎo)化

? 五流的公司在同質(zhì)化的產(chǎn)品下打價格戰(zhàn)

只要用心,一切皆有可能

銷售是一份靈活的工作,只要用心去分析和維護每一位新老客戶,那么一定可以做出卓越的成績