第一篇：生物技術實驗心得

姓名：吳伙福

學號：11120222

班級：11（生）2

實驗心得體會

我覺得生物技術實驗它的目的在于鍛煉我們的實際動手能力，讓我們熟悉各種儀器的使用及實驗的各種規范操作。我認為要想學好這門實驗課，首先，在做實驗前，一定要事先對將要做的實驗進行預習，記下有疑問或不懂得地方，因為這是做實驗的基礎，否則，在老師講解時就會聽不懂，這將使你在做實驗時的難度加大,浪費做實驗的寶貴時間。比如做蛋白質的水解和氨基酸的紙層析法分離的實驗，你要清楚水解蛋白質的方法和紙層析的基本技術，如果你不清楚，在做實驗時才去摸索，這將使你極大地浪費時間,使你事倍功半。做實驗時，一定要親力親為，務必要將每個步驟，每個細節弄清楚，弄明白實驗后，還要復習思考，這樣你的印象才深刻，記得才牢固，否則，過后不久你就會忘得一干二凈，這還不如不做。做實驗時，老師還會根據自己的親身體會，將一些課本上沒有的知識教給我們，拓寬我們的眼界，使我們認識到這門課程在生活中的應用是那么的廣泛。

通過那些實驗，使我學到了不少實用的知識，更重要的是，做實驗的過程，思考問題的方法，這與做其他的實驗是通用的，真正使我們受益匪淺。在實驗的過程中我培養自己的獨立分析問題，和解決問題的能力。不在像以前做實驗那樣很隨便，總是抱著等老師教你怎么做，拿同學的報告去抄。盡管你成績也許會很高，但對將來是不利的。我覺得實驗課還是有必要認真去學的，很多東西也許你現在覺得沒用，但是它可能潛移默化的影響著你。

最后我覺得老師的指導也是很有必要的，學生們必然會有問題，老師偶爾的啟發就可能讓同學豁然開朗。但是更多的還是得靠我們自己，我們也要注意與老師互動，這樣才會使我們不僅能學好實驗課也能增進與老師的感情。

第二篇：生物技術實驗心得體會

生物技術實驗心得體會

基因克隆技術是分子生物學的核心技術，其目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，用于深入分析基因的結構與功能，并可達到人為改造細胞以及物種遺傳性狀的目的。本論文主要從以下幾個方面來介紹基因克隆技術：目的基因的獲得、目的基因和載體的連接、重組分子的擴增和鑒定。

可概括為∶分、切、連、轉、選。“分”是指分離制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特異的限制性內切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；“轉”是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細胞中進行復制和擴增；“選”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。

一.目的基因的獲得

目的基因是指所要研究或應用的基因，也就是將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是獲得目的DNA片段,。所需目的基因的來源, 不外乎是分離自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化學合成法、cDNA法及建立基因文庫的方法來篩選

PCR方法

PCR 是一種在體外快速擴增特定基因或DNA。聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。

化學合成法制備基因片段

采用DNA合成儀，對目的基因進行分段合成，然后進行連接，可以得到所需的目的基因。

二、重組質粒的構建

DNA體外重組是將目的基因在DNA連接酶作用下，連接到合適的載體DNA上，以便下一步轉化之用。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此采取折中的溫度，即12～16℃，連接12～16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。

三、重組分子的擴增和鑒定

重組DNA分子導入受體細胞

目的基因和載體在體外連接形成重組DNA分子后，需要被導入受體細胞中才能進行增殖和（或）表達。受體細胞是重組基因增殖的場所，所以對受體細胞也應具有幾點要求：①容易接納重組DNA分子；②對載體的復制擴增無嚴格限制；③不存在特異的能降解外源DNA的內切酶體；④不對外源DNA進行修飾。一般將重組DNA分子導入原核細胞的過程稱為轉化，而導入真核細胞的過程稱為轉染。將重組DNA分子和感受態大腸桿菌細胞相混合，使重組DNA分子進入大腸桿菌中，就可以實現重組DNA分子的轉化。

重組DNA分子的鑒定

重組DNA分子導入受體細胞后是否得到擴增，擴增后的重組DNA分子是否正確，導入的重組DNA分子是否含有正確的插入片段，重組DNA分子能否表達插入的目的基因，一般可以采用X-gal篩選的方法對重組DNA分子進行鑒定。

四、實驗中的注意事項

1、大腸桿菌液體培養基和固體篩選培養基制備：

1)接種過程中，試管或三角瓶口等，也可通過火焰灼燒滅菌。2)培養基、橡膠制品、塑料制品等不能使用干熱滅菌。

3)在加熱過程中應不斷攪拌，以防瓊脂粉沉淀糊底燒焦，并應控制火力，以免培養基起泡而溢出容器。

4)注意培養基分裝時避免其沾污三角瓶口、試管口。

5)嚴格按照高壓蒸汽滅菌的滅菌指標（溫度、壓力、時間）對培養基、器皿滅菌，確保滅菌徹底。

2、大腸桿菌工程菌平板培養：

1)劃線分離時，挑菌量要小，嚴格無菌操作，避免環境中的雜菌污染。2)畫線時接中環圈內不能有菌膜產生，會造成接種數過多，結果不明顯。

3、PCR擴增目的基因片段：

1)PCR體系所加成分的實際用量，應根據實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進行核算。2)加樣時要認真,吸頭垂直進入試劑管，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。

3)Taq聚合酶（置于冰盒上）應最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深，酶量不能過多。

4、回收目的基因與載體連接：

1)注意調轉速 2)敞開管蓋放置

3)向吸附膜中間位置懸空滴加30ul洗脫緩沖液TE（洗脫緩沖液TE需使用前60℃水浴預熱）

4)蓋好管蓋，靜置10min

5、大腸桿菌液體培養:

1)接種環節應嚴格進行無菌操作。

2)實驗中要注意細菌的生長狀態和密度，盡量使用對數生長期的細胞。密度過高或不足均會使轉化率下降。菌體密度與震蕩培養的轉速密切相關，根據測定的菌液OD值調整培養時間。

3)接種的試管、三角瓶等應做好標記，注明菌種、日期、組別、姓名等。

6、大腸桿菌感受態細胞制備及轉化: 1)所有操作均應在無菌條件和冰上進行。

2)所使用的器皿必須經過滅菌。并且要防止跡量的去污劑或其它化學物質、雜菌、DNA酶或雜DNA所污染，否則會大大降低細菌的轉化效率。

3)注意轉化的質粒 DNA 的質量和濃度。當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，大于30kb的重組質粒將很難進行轉化。

4)實驗所用的溶液最好用3次蒸餾水配制。

7、篩選重組轉化菌落:

1)在含有X-gal和IPTG的篩選培養基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。不是一開始就4℃，是等菌長出來之后。一般菌長出來就會有藍色的了，4℃之后會進一步顯色。2)當出現藍斑較大，白斑很小附在周圍，還有藍白鑲嵌的斑即衛星菌落的時候，可以小心挑取中間的那個菌落，有可能是陽性克隆。

3)要注意培養時間不宜過長，出現陽性菌落就及時處理，以12-16小時為宜。4)培養基中加抗生素的時候，溫度不能高了，不燙手為宜，防止抗生素失效。

8、菌液PCR分析: 注意移液槍正確的使用方法，各種量程的調試，一般以接近最大量程的為準。

9、取大腸桿菌重組質粒DNA和酶切分析

1)《質粒小量提取試劑盒》進行質粒的提取的第三步和第四步之間的時間，操作要流暢快速，決定了實驗成敗

2)禁止吸出沉淀

五、總結

在分子生物學中，基因克隆是一種常用的技術。其中關鍵技術是DNA重組技術，它利用酶學方法將不同來源的DNA分子進行體外特異性切割，重新拼接組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上將雜合DNA分子轉入一定宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程稱基因克隆。有目的地通過基因克隆技術，人為操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程總稱為基因工程。

基因工程是把雙刃劍。如果不加節制的使用基因工程，讓它去為你包治百病，那樣你的整體免疫系統也將發生錯亂，讓你完全可以抵擋的疾病訪問造成你的死亡。如果人們想造什么動物就造什么動物，讓這些動物急速的泛濫，動物的天敵關系，人類的生態平衡都將被破壞，動物也將超過人類，霸占我們賴以生存的地球。而且，若是誰都想起死回生，我想終有一天我們將因為人口泛濫而滅亡。

基因工程知識一種讓科技發展的手段，而不是我們的目的，我們要遵循自然規律，正確的對待基因工程，正確的對待生活。

第三篇：《園藝植物生物技術》實驗教案

實驗一 現代生物技術實驗室與實驗儀器

一、實驗目的

實驗室和實驗儀器是開展現代生物技術研究的基礎平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學生知識結構完整性的重要體現。通過現場參觀和老師講解加深同學們對現代分子生物學實驗室的規劃與布局及常用儀器設備的主要功能的認識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統等關鍵儀器的使用方法。

二、實驗場所選擇及實驗內容

園藝學院植物分子生物技術實驗室與開展現代生物技術研究直接相關的實驗室分工與布局和主要相關儀器：如與組織培養有關的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養室等；與分子生物學有關的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統等。

三、實驗方法與步驟

1、相關背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術如分子標記、細胞和組織培養等操作過程進行回顧，重要指出每個環節要用到的必備儀器的作用、性能指標、操作注意事項及儀器選購中應注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現代生物技術實驗室的布局及功能分區情況；針對每個分區的重要儀器進行講述，結束時對所有參觀內容進行簡要總結，并回答同學們的提問。

四、實驗注意事項

實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學們認真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據參觀內容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。

2、一個現代化生物技術實驗室應具備的基本功能的必備儀器有哪些？實驗二 質粒DNA的提取、純化及檢測

一、實驗目的

質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質粒的抽提過程，應掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實驗原理 在pH 12.0-12.6堿性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質粒DNA提取有關試劑。

液氮、及DNA提取有關試劑。

四、實驗方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實驗步驟

1、取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養基上劃線37℃過夜培養。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養基中，37℃搖床-250r/min過夜培養。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預冷的溶液I，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質充分沉淀（溶液III為中和液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存備用。

10、取制備的質粒DNA 1-2ul，加適當loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質，操作時應注意防護，盡量減少臺面污染。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

3、質粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型。

六、思考題

簡述質粒DAN提取的步驟。

實驗三 PCR技術

一、實驗目的

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統，是分子克隆技術中常用技術之一。PCR具有反應快速、靈敏、操作簡便等優點，已廣泛應用于分子生物學的各個領域。通過本實驗應掌握PCR原理，學習PCR操作過程。

二、實驗原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板結合的特異性。反應分為變性、退火、延伸三步，經過一定的循環，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質粒或轉基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關試劑。

四、實驗方法與步驟

1、調整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應循環條件設置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍，混勻，短暫離心，取15ul反應產物點樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實驗注意事項

1、引物設計應具有特異性，依靠引物設計軟件進行引物設計；引物分裝成多管，不宜反復凍融多次；

2、PCR反應的各種成分不能遺漏，操作應戴手套，冰上操作；

3、根據引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設定PCR循環條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產物時出現拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術的原理和步驟。

第四篇：《園藝植物生物技術》實驗教案

《園藝植物生物技術》實驗教案

實驗一 現代生物技術實驗室與實驗儀器

一、實驗目的

實驗室和實驗儀器是開展現代生物技術研究的基礎平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學生知識結構完整性的重要體現。通過現場參觀和老師講解加深同學們對現代分子生物學實驗室的規劃與布局及常用儀器設備的主要功能的認識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統等關鍵儀器的使用方法。

二、實驗場所選擇及實驗內容

園藝學院植物分子生物技術實驗室與開展現代生物技術研究直接相關的實驗室分工與布局和主要相關儀器：如與組織培養有關的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養室等；與分子生物學有關的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統等。

三、實驗方法與步驟

1、相關背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術如分子標記、細胞和組織培養等操作過程進行回顧，重要指出每個環節要用到的必備儀器的作用、性能指標、操作注意事項及儀器選購中應注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現代生物技術實驗室的布局及功能分區情況；針對每個分區的重要儀器進行講述，結束時對所有參觀內容進行簡要總結，并回答同學們的提問。

四、實驗注意事項

實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學們認真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據參觀內容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。

2、一個現代化生物技術實驗室應具備的基本功能的必備儀器有哪些？

實驗二 植物組織培養

一、實驗目的

植物組織培養是現代生物技術研究的重要技術手段，在原生質體融合、病毒脫除、離體快繁及遺傳轉化等領域發揮著不可替代的作用。胡蘿卜以其培養體系成熟、再生容易而被視為組織培養的理想外植體材料，本實驗通過胡蘿卜的組織培養使同學們掌握基本培養基的配制、滅菌及培養的基本技能。

二、實驗原理

基于1902年德國科學家哈勃蘭特（Haberlandt）提出植物細胞的全能性理論，即指已分化的細胞仍然具有分化發育成新個體的潛能。在適宜的培養條件下，植物的細胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。

三、主要儀器及試材

儀器：pH計、微波爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、培養室、三角瓶、封口膜、無菌濾紙、手術刀片、鑷子、酒精燈、記號筆等

試材：新鮮胡蘿卜，培養基配制所需相關試劑

四、實驗方法與步驟

（一）培養基母液的配制（小規模實驗應按比例減少，避免造成很大的浪費）：

1、大量元素(10倍液)：稱取下列藥品分別溶解定容到1升后，加到5升存儲瓶中。

KNO

395 g NH4NO3

82.5 g KH2PO

48.5 g MgSO4?7H2O

18.5 g CaCl2?2H2O

22.0 g 注意事項：

（1）配置母液前要仔細清洗存儲容器

（2）應按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動存儲瓶使其混合均勻；（3）溶解時最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產生；

（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因為水中帶菌量過大而產生沉淀，同時可以減緩綠藻的生成；

（5）沉淀的產生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時一定不要急；二是由于長菌而產生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。

2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)溫水依次加入下列藥品，每加一種藥品后攪拌溶解，最后定容到1L：

KI

0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O

0.86 g NaMoO4*2H2O

0.025 g CuSO4*5H2O

0.0025 g CoCl2*6H2O

0.0025 g

MnSO4*4H2O

2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室溫下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易產生結晶沉淀。配制過程中產生沉淀的原因有：1.前一個沒徹底溶解就加入了后一個藥品；2.蒸餾水pH 值過高，可加幾滴鹽酸校正。

3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：

甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L

4、鐵鹽的配制（100倍液）：

稱取EDTA 3.73 g，FeSO4·7H2O 2.78 g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

5、維生素B的配制（100倍液）：

VB組分 VB1(鹽酸硫氨素)VB6(鹽酸吡哆素)VB5(煙

酸)

改良MT 1g 1g 0.5g

MS 10 mg 50 mg 50 mg 分別稱取順序溶解在溫熱的蒸餾水中，定容到1L。

注: 需要溶解完一個再加另一個；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時可以加熱。

6、Vc的配制（100倍液）：

稱取Vc 0.5g 溶解在蒸餾水中，定容到1L即可。

7、其它溶液配制：

BA，NAA，IBA，GA3等激素類試劑可先用少量1N NaOH徹底溶解，再加水定容。配好后室溫放置一段時間，再放入冰箱中冷藏保存。有些試劑在乙醇或鹽酸中也可溶解，但比較而言，用堿溶解比較穩定，不易產生沉淀。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量較大，短時間內用不完，最好分裝一部分到小的細口瓶中，在制作培養基時使用。這樣不容易產生沉淀。

（二）培養基配制

母液配好后，按以下體種（或質量）量取，最后用蒸餾水定溶到1L,調節pH至5.8，用塑料燒杯放入微波爐中充分溶解后分裝滅菌。

大量元素(10倍液)

ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)

ml 鐵鹽（100倍）

ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）

ml 蔗糖

g 瓊脂

7.5 g

（三）接種與培養

在超凈臺上接種后，用記號筆做好標簽，放置到光照培養室中進行培養。

五、實驗注意事項

1、實驗中涉及到酒精及砷汞等危險品，注意人身安全的環境安全，廢液不要隨意亂倒。

2、外植體消毒及接種操作要規范，注意超凈臺的衛生，養成良好的實驗習慣。

六、實驗結果處理

一星期后，統計污染率，并對未污染材料的生長狀況進行觀察，并分析產生污染的可能原因。

七、思考題

影響植物組織培養的因素有哪些？

主要參考文獻

1.張婭，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。胡蘿卜組織培養和高效遺傳轉化體系的建立。植物學通報,2005，22:37-42。

2.華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料）。實驗三 植物DNA的提取、純化及檢測

一、實驗目的

DNA 提取是開展分子生物學的重要前提之一，高質量的DNA直接關系到分子標記、基因克隆、圖譜構建及功能基因組研究等工作的成敗。通過本實驗應了解常用DNA提取方法的原理和技術，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA檢測技術，為將來從事園藝植物生物技術研究奠定基礎。

二、實驗原理

植物的遺傳物質是DNA，植物細胞內含有豐富的遺傳物質。在機械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細胞破裂，DNA從細胞核釋放到提取緩沖液中。經蛋白質強變性劑處理結合離心，除去蛋白質和色素等雜質，再用乙醇沉淀便可獲得高純度的DNA。

DNA電泳是依據DNA帶負電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場的作用下DNA由負極向正極移動，分子量小的移動快而分子量大的移動慢，最終達到不同分子量大小的DNA分離的目的。

三、主要儀器及試材

水浴鍋、離心機、移液槍、研缽、離心管、核酸電泳系統等；新鮮健康植物葉片，液氮、及DNA提取有關試劑。

四、實驗方法與步驟 1.藥品的配制: CTAB提取液：

(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。使用前要在65℃溫浴一會兒，然后加入1-4%巰基乙醇，混均勻。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：

重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫熱的蒸餾水，加入少許8-羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力攪拌器上攪拌1.5 h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲存備用。2.DNA的粗提

在裝有葉片的離心管中加入石英砂少許（約0.07克），用尖頭玻棒將材料研細后加入600 ul CTAB提取液，再繼續研磨一會兒使其懸浮均勻，然后在65℃水浴鍋中溫浴60分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒幾次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下晃動10分鐘以上，其間置于37℃水浴鍋中溫浴一會（冬季），使之充分混勻，然后10000-12000 rpm離心5-10分鐘，吸取上清液轉至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰凍無水乙醇1 ml，輕輕顛倒數次，混合均勻后冰凍30分鐘沉淀DNA，然后8000-10000 rpm離心5分鐘，棄上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小時或過夜，8000 rpm離心5分鐘,棄酒精之后在工作臺上風干DNA，注意不要過干，否則會使以后溶解困難。3.DNA的純化：

向風干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時，然后加入700 μl苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，10000-12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入700 μl氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 μl 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在-20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，8000-10000 rpm離心2-3分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時后換一次，后浸泡過夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風干，加50-100 μl TE充分溶解備用。

4、DNA檢測

（1）取DNA原液15 μl稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計測定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高質量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7

（3）向一定量的DNA中加入限制性內切酶EcoR I至4-5 U/μg DNA，37℃消化過夜，用0.5×TBE，0.8%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳3 h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險或有毒物質，操作時要戴手套，并在專門區域操作。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

六、思考題

簡述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。

主要參考文獻

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料）。實驗四 質粒DNA的提取、純化及檢測

一、實驗目的

質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質粒的抽提過程，應掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實驗原理 在pH 12.0-12.6堿性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質粒DNA提取有關試劑。

液氮、及DNA提取有關試劑。

四、實驗方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實驗步驟

1、取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養基上劃線37℃過夜培養。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養基中，37℃搖床-250r/min過夜培養。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預冷的溶液I，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質充分沉淀（溶液III為中和液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存備用。

10、取制備的質粒DNA 1-2ul，加適當loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質，操作時應注意防護，盡量減少臺面污染。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

3、質粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型。

六、思考題

簡述質粒DAN提取的步驟。

主要參考文獻

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料）。

實驗五 PCR技術

一、實驗目的

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統，是分子克隆技術中常用技術之一。PCR具有反應快速、靈敏、操作簡便等優點，已廣泛應用于分子生物學的各個領域。通過本實驗應掌握PCR原理，學習PCR操作過程。

二、實驗原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板結合的特異性。反應分為變性、退火、延伸三步，經過一定的循環，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質粒或轉基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關試劑。

四、實驗方法與步驟

1、調整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應循環條件設置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍，混勻，短暫離心，取15ul反應產物點樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實驗注意事項

1、引物設計應具有特異性，依靠引物設計軟件進行引物設計；引物分裝成多管，不宜反復凍融多次；

2、PCR反應的各種成分不能遺漏，操作應戴手套，冰上操作；

3、根據引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設定PCR循環條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產物時出現拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術的原理和步驟。

主要參考文獻

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料

實驗六 PCR產物的TA克隆

一、實驗目的

采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果樹上常用的分子克隆方法。相對于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產物效率較低。目前，有兩種方法可以采用，一種是在特異引物設計時引入酶切位點，另一種是TA克隆。通過本實驗應掌握PCR產物TA克隆的原理，學習PCR產物純化及回收，以及PCR產物與TA克隆載體的連接。

二、實驗原理

TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校準活性，即在PCR產物的兩個3’末端加上未配對的單一A凸出尾，質粒載體提供線性3’末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產物高效連接。TA克隆技術比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

三、主要儀器及試材

PCR擴增產物、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Promega公司）、pMD18-T載體（TaKaRa公司）以及感受態大腸桿菌、高速冷凍離心機、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳等相關儀器及試劑。

四、實驗方法與步驟

1、PCR擴增片段純化回收

將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴增產物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進行。

2、連接反應 反應體系組成

pMD18-T

0.5-1.0 ul PCR fragment

1.0-4.5 ul ddH2O

0-3.0 ul Ligation Solution I

5.0 ul 混合后，置于室溫下放置數小時或過夜連接。

3、重組子轉化（熱激法）

1）在含適當濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；

2）冰上冷凍新滅菌的1.5 ml 離心管； 3）取出感受態大腸桿菌，冰上放置凍融；

4）取新滅菌的1.5 ml 離心管，加入50 ul感受態細胞和10 ul連接反應液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；

5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。請勿搖動離心管； 6）冰鎮：快速將離心管轉移至冰浴，1-2分鐘；

7）復蘇：每管加400 ul液體LB培養基，在37 ℃搖床溫和搖動45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均勻涂布于“1）”已制備好的LB平板上；

9）培養：在37 ℃下倒置培養12-16 h，即可觀察到藍白相間的菌落。白色菌落為含有外源插入片段的轉化子，藍色是載體自連的轉化子。轉化子可以在4 ℃下保持1個月；

10）單菌落培養：用滅菌的牙簽，挑選白色的單菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液體LB培養基的50 ml離心管中，在37 ℃搖床上培養過夜（12-16 h）。

4、質粒DNA的分離 參考有關文獻。

5、檢測

采用相同的引物對進行PCR再擴增，或質粒上根據插入片段兩端的酶切位點而進行限制性酶切，通過電泳可以檢測出片段是否克隆成功。

五、實驗注意事項

1、連接溫度不宜太高，連接溫度過高（>28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率；

2、熱激過程注意勿搖動離心管。

六、思考題

簡述PCR產物TA克隆的原理和步驟。

主要參考文獻

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料。

第五篇：生物技術有限公司實習心得

20XX年3月1日我們懷著欣喜的心情來到了裕通生物技術有限公司并進行為期3個月的實習生活，這次實習讓我們感受到了集團的企業文化。工作中有苦也有樂，但更多的是收獲，這次實習我們受益匪淺。古人云：“紙上得來終覺淺，要知此事必躬行”。這是一次理論與實踐相結合的實習，把理論應用到實踐當中并在實踐中積累更加豐富的理論知識。在公司領導和指導老師的幫助下我們圓滿的結束了實習。就3個月的實習我總結了如下幾點：

1、心態轉變。學校的生活養尊處憂，無需我們擔憂某些問題，學校三點一線的生活，學習跟得上就可以，而在工作當中就不然，工作中，我們要考慮如何提高工作效率，怎樣處理與上級領導、同事的關系，還有在工作當中的不盡人意等事情，這些都要我們以一顆平常心去對待，及時的轉變心態會讓我們工作更加順利。

2、計劃做事。有了明確的計劃，目標才清晰，以至于在工作中不會茫然。在合成部實習的三個多月中，我每天都寫工作日志，記錄下我要做的事情，然后再總結一下完成狀況，日志看似平常，但在無形中提高你做事的效率和工的有序程度。

3、不以事小而不為。做大事小事有不同的階段，要想做大事，小事情必須做好。我們正是實習的階段，做一些繁瑣的小事情，很有必要。工作中我們每個人干的最多的就是打水、拖地和擦桌子，但我并沒有感到煩，而是把它當作我素質培養的大講堂，正因為這些小事情改變了辦公室的環境。這些小事情值得我去做。事情雖小，可過程至關重要。

4、以上是我在實習中的一些體會，同時在實習的過程中我也發現自己還存在一些缺點，如：性子急、愿意推托等毛病，正確的對待自己的缺點和錯誤，才會使自己的能力提升的更快。

5、三個月的實習生活就要結束了，在理論與實踐的磨合中我們顯得比來時更加成熟和穩重，我們又多了一些實踐經驗。在一個競爭激烈，就業困難的環境中，我們先行的這一步已經為我們奠定了一定的基礎，在以后的職業實戰中，我們會打的更響、更漂亮!

6、一個多月的實習期很快就過去了，美好的東西總是稍縱即失。在此，我要感謝所有為我的實習提供幫助和指導的領導老師們，感謝你們這么多天的照顧和幫助。相信這次珍貴的實習經歷會一直伴隨著我以后的工作生活。千里之行，始于足下，我會通過這次實習，更加懂得知識和實踐的積累，不斷充實自己。