第一篇：豬圓環(huán)病毒疫苗應(yīng)用現(xiàn)狀

豬圓環(huán)病毒疫苗應(yīng)用現(xiàn)狀

摘要

目前在國外只有梅里亞動物保健公司生產(chǎn)全病毒滅活疫苗，使用于母豬免疫。

已經(jīng)注冊的國產(chǎn)圓環(huán)病毒疫苗均為全病毒滅活疫苗。分別由哈爾濱獸醫(yī)研究所用LG、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)用SH株研制而成。①哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；②上海海利生物藥品有限公司；③洛陽普萊柯生物工程有限公司；④江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司4家公司生產(chǎn)。國產(chǎn)疫苗亟待提高純化工藝。水性佐劑要比礦物油佐劑疫苗對機體的刺激性小，副反應(yīng)小。疫苗免疫保護期為3—4月，貯存有效期為12—18月。

FLEX系列茵格發(fā)豬圓環(huán)病毒疫苗，是具有純化蛋白抗原的水性佐劑的亞單位滅活疫苗。形成形態(tài)、大小與活病毒相同的、具有高度免疫原性的純化抗原。該產(chǎn)品是目前所有豬圓環(huán)病毒疫苗中唯一的單針疫苗，具有抗原緩解效果，應(yīng)用時不必加強免疫。

在應(yīng)用圓環(huán)病毒疫苗后滿意度調(diào)查中，進口圓環(huán)病毒疫苗滿意度最高。如何選擇疫苗、制定適合豬場實際的免疫程序、確定免疫時機適時免疫顯得尤為重要。

疫苗免疫哪些豬群？何時免疫？應(yīng)對豬場流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢變化、生產(chǎn)成績、病原和抗體的實驗室監(jiān)測進行評估后作出決定。豬場是否應(yīng)用疫苗，應(yīng)充分考慮本場發(fā)病情況、飼養(yǎng)管理狀況、生物安全、主要相關(guān)疫病免疫與控制狀況、藥物預(yù)防效果等因素基礎(chǔ)上綜合判斷。母豬是否需要免疫？倘若母豬群因PCV2感染而流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔的比例超出正常，或仔豬因PCV2感染在斷奶后1—2周發(fā)病，選擇母豬免疫就是正確的。進口的疫苗可普免2—3次/年，在國產(chǎn)疫苗應(yīng)用安全的情況下可免疫3—4次/年。研究表明免疫母豬所產(chǎn)仔豬和非免疫母豬所產(chǎn)仔豬接種疫苗后，其免疫效應(yīng)均未受到母豬免疫的負面影響，盡管這一結(jié)果令人鼓舞，但還需進行更多研究。

仔豬免疫的時間可據(jù)下游豬發(fā)病日齡確定。疫苗起效時間為2周，感染潛伏期約2周。當母源抗體在3—8周下降到較低水平而環(huán)境中野毒感染壓力較大時，對于保育豬特別是10周齡后肥育豬是否獲得足夠保護？一般12周齡開始感染。應(yīng)在豬群出現(xiàn)臨床癥狀至少4周前施行免疫注射。商品豬群只注射1次即可；1針免疫4個月后再進行第2次免疫。在第1次免疫2周后加強免疫一次；在加強免疫的3—4個月后再免疫。

新生仔豬3—4周齡首免，第一次免疫后間隔3周加強免疫一次。

在制定免疫程序時，還應(yīng)注意與其它免疫的相互干擾作用。至少7d的間隔；若PRRS弱毒疫苗免疫在前，最好有10d以上的間隔再免PCV2疫苗。

圓環(huán)病毒疫苗免疫效果通過常規(guī)的抗體檢測目前難以給出正確評價，可通過臨床癥狀、生產(chǎn)成績予以評估，免疫后對豬的健康狀況和增重改善明顯。圓環(huán)病毒疫苗應(yīng)用于PCV2急性感染，仔豬群呼吸困難、消瘦、皮炎，母豬群流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔等，可減少母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱仔的數(shù)量，可明顯降低保育及生長育肥豬發(fā)病率、死淘率；明顯提高日增重、豬群整齊度，降低料肉比，減少皮炎發(fā)病率，縮短出生至出欄時間；還有助于豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗、偽狂犬病疫苗免疫效果的正常發(fā)揮，降低機體對飼料霉菌毒素的敏感度。

第二篇：豬圓環(huán)病毒2型疫苗最新研究進展

豬圓環(huán)病毒2型疫苗最新研究進展

豬圓環(huán)病毒病是公認的免疫抑制病之一，造成豬場損失慘重，疫苗免疫成了救命的稻草。從2011年豬圓環(huán)疫苗上市至今，已有17家圓環(huán)產(chǎn)品先后上市，目前，出現(xiàn)嚴重供大于求的現(xiàn)象，同時，養(yǎng)殖場也面臨著幸福的煩惱，大量產(chǎn)品的上市，產(chǎn)品價格可能下降，但是，面對玲瑯滿目的產(chǎn)品，如何選擇疫苗成了養(yǎng)殖場一個重要的課題，針對這些煩惱，本文希望能夠為養(yǎng)殖場選擇疫苗帶來幫助，避免走彎路，為養(yǎng)殖場服務(wù)。

1.PCV-2國內(nèi)外最新流行動態(tài)

由PCV-2引發(fā)的疾病已成全球流行之勢，在加拿大首次報道該病原引起PMWS后[1]，學(xué)者通過調(diào)查本國包括SPF豬、部分散養(yǎng)豬以及育肥豬發(fā)現(xiàn)，豬群中PCV-2血清中抗體普遍存在，但目前該病在加拿大仍然只是散發(fā)。在英國和北愛爾蘭，豬群血清中PCV-2抗體陽性率分別為86％和92％。美國、法國、丹麥、意大利、西班牙、荷蘭、新西蘭、日本、韓國、墨西哥等國家也相繼報道豬群中存在PMWS。在我國豬群中PCV-2感染情況也不容樂觀。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山東、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22個豬群采集了559份血清，用ELISA方法檢測PCV-2抗體，其陽性率高達5l％，表明我國豬群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法對我國北京、山東、河北、深圳、山西、天津、廣東等省(市)的12個規(guī)模化豬場發(fā)病豬群進行豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明豬圓環(huán)病毒2型感染情況在我國豬群中相當嚴重。李超等[4]在2010年對安徽省PCV-2流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明安徽省14個市(縣)的PCV-2抗體陽性率平均為74.36％，表明安徽省豬群中普遍存在著PCV-2的感染。從上述報道表明PCV-2在我國豬群中廣泛存在。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，雖然豬群中PCV-2抗體陽性率較高，但很大比例的抗體陽性豬群并不表現(xiàn)出臨床癥狀。PCV-2與其他多種病原混合感染較為嚴重，調(diào)查發(fā)現(xiàn)沙門氏菌、大腸桿菌等細菌性病原與PCV-2混合感染率達到了20％[5]。陜西省PCV-2與PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陳義祥等對廣西地區(qū)197份組織病料檢測發(fā)現(xiàn)，PCV-2與PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占總病料數(shù)量的57.73％。2003年王文軍等[7]對黑龍江地區(qū)PCV-2陽性豬群的病料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，藍耳病和豬瘟的陽性率也較高。

哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長明[8]在2007年采用免疫過氧化物酶單層細胞染色試驗（IPMA）對來自與黑龍江、吉林、河北、上海、內(nèi)蒙古、云南、江西等地的健康豬群480份血清和發(fā)病豬群424份血清，抗體陽性率分別為79.2%和91.7%，表明PCV-2在豬群中感染率非常高。山東農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所吳家強博士檢測結(jié)果也證實PCV-2防控比較糟糕，PCV-2，2010年檢出率為34.66%（124/357），2011年檢出率為25.59%(174/588)；2012年檢出率為2

1.38%(147/683)，圓環(huán)病毒病依然嚴重，但有下降趨勢，這個和使用圓環(huán)疫苗免疫有關(guān)系。

第三篇：豬圓環(huán)病毒病 概述

豬圓環(huán)病毒病 概述： 本病由豬圓環(huán)病毒(PCV)引起。病原-----PCV

1、分類：1995 年列為圓環(huán)病毒科（Circoviridae)。在本科里還有其 他的病毒，如雞傳染性貧 血病毒（CAV）、鸚鵡喙羽病病毒（BFDV）。PCV、BFDV 列為圓環(huán)病毒屬，CAV 列為環(huán)形 病毒屬。2.核酸類型：DNA。其單鏈環(huán)狀 DNA 染 色質(zhì)有 1759 個堿基組成。且已克 隆測定了序列。11 個開放閱讀框架，有 編碼 11 種蛋白質(zhì)。引起 PMWS 的 PCV 和引起 PK-15 污染的 PCV，同屬于圓環(huán)病毒屬，且高度的同源，但抗原性及 DNA 序列方面有一定的差異。為了區(qū)別，日前將 PCV－PK15 稱為 PCV-1，而將 PMWS 稱為 PCV-2。

3、形態(tài)大小： 為無囊膜二十面體，大小約 4～26.5nm。

4、PCV 可在豬源細胞上復(fù)制，但 CPE 不明 顯。

5、存在：淋巴結(jié)，骨髓，血液。流行病學(xué)

1、PCV 易引起豬發(fā)病，一 般不與 CAV 和 BFDV 發(fā)生交叉感染，但用 ELISA 證實人血清有 30%、小鼠血清 12%~69%、牛血清 35%抗體陽性。

2、血清學(xué)調(diào)查表明：豬的陽性為 20%~80%，且分布極其廣，幾乎世界各處都有。

3、周齡的豬多發(fā)，PRRS 陽性豬群中更易繼發(fā)本病。6~8 在

4、發(fā)病率高，病死率有高有低，但即使不死，亦誘發(fā)其它疾病的發(fā)生。癥狀 ①仔豬 斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥； ②豬皮炎腎病綜合癥； ③相關(guān)性繁殖障礙綜合癥； ④相關(guān)性肺炎； ⑤相關(guān)性腸炎； ⑥相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)病。體重減輕，漸進性消瘦，虛弱。呼吸困難，過速，偶有咳嗽。皮膚蒼白，結(jié)膜黃染。下痢、腹瀉。中樞神經(jīng)紊亂。病 變： 全身淋巴結(jié)腫大，尤以腹股溝淋巴結(jié)為最，腫大達 3~4 倍，切面充血、出血。肺 彌漫性病變，比重增加，堅實成橡皮樣，表面呈花斑狀。肝花斑狀，萎縮。脾腫 大，切面呈肉狀。腎被膜有白色病灶，腫大。回腸有花斑狀。診斷：

一、臨診 腹股溝淋巴結(jié)腫大，脾、腎腫大，肝萎縮，漸進性消瘦，有診斷價值。

二、實驗

1、原代腎細胞或 PK-15 可用作培養(yǎng) PCV-2，但在細胞培養(yǎng)物上還不能判是否有 病毒存在。需要特異抗體用免疫熒光或直接免疫過氧化物酶染色確認。

2、用 PCR 擴 增病毒。

3、待檢材料做組織切片，觀察有否包涵體。

4、ELISA 測定抗體。防 治

1、預(yù)防：圓環(huán)病毒-繁殖障礙與呼吸綜合癥二聯(lián)苗。首免：10-15 日齡。二免： 30-35 日齡。

2、發(fā)病后的處理： 1）在飼料中添加呋喃妥咽或病毒靈或病毒唑，多維。2）注射圓環(huán)·藍毒康或圓環(huán)抗毒殺。3）注射豬用干擾素

第四篇：豬圓環(huán)病毒病相關(guān)知識問答

1.什么是豬圓環(huán)病毒病？

豬圓環(huán)病毒病是指以2-型圓環(huán)病毒為主要病原、單獨或繼發(fā)/混合感染其它致病微生物的一系列疾病的總稱。

2．豬圓環(huán)病毒病具體有哪些發(fā)病類型？

主要有豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、先天性震顫、腸炎等。

3．請介紹一下豬圓環(huán)病毒病的流行情況。

本病最早發(fā)生于加拿大（1991），此后很快在世界各地（大洋洲除外）流行，亞洲及我國各地有關(guān)的報道也越來越多。朗洪武（2000，2001），曹勝波（2001）先后通過血清學(xué)方法和PCR技術(shù)在河北、北京、天津、山東、吉林、江蘇、上海、河南、湖北和廣東、廣西檢測到了PCV-2。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授等對北京、天津、廣東、山西等12個規(guī)模大豬場病原檢測和流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)11個豬場存在PMWS的感染，一個豬場存在PDNS的問題，可見PCV-2在我國的普遍性。

4．豬圓環(huán)病毒病的病原體是什么？

是2-型圓環(huán)病毒，圓環(huán)病毒有兩個血清型，1-型沒有致病性。

5．發(fā)病越來越多的原因是什么？

（1）集約化養(yǎng)豬的出現(xiàn)，導(dǎo)致管理及操作體系的巨大變動；2）宿主遺傳性狀的改變與世界范圍內(nèi)的流動；3）藍耳病病毒和細小病毒等病原體的混合感染。

6．豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的臨床癥狀、解剖病理變化有哪些？

豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征確診往往需要有一群豬的一組特征性的臨床癥狀和顯微病變，其臨床癥狀有：僵豬比例明顯增多、生長不良或停滯、消瘦、呼吸困難、淋巴結(jié)腫大、腹瀉、蒼白、部分豬出現(xiàn)黃疸。但在同一頭豬中，不表現(xiàn)出以上全部癥狀。同時亦有部分豬出現(xiàn)咳嗽、肺炎、發(fā)熱、胃潰瘍、中樞神經(jīng)癥狀及突然死亡。其中有些癥狀與繼發(fā)感染有關(guān)。其特征性顯微病理變化表現(xiàn)為淋巴器官的肉芽腫炎癥和不同程度的淋巴細胞缺失。病理解剖可見肺斑點狀出血，全身淋巴結(jié)腫脹，尤其是腹股溝淺淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和支氣管淋巴結(jié)明顯腫大，切面浸潤，呈土黃色，有的淋巴結(jié)皮質(zhì)出血，使整個淋巴結(jié)呈紫紅色外觀。心臟變形、質(zhì)地柔軟、心冠脂肪萎縮，腎腫脹，皮質(zhì)變薄，有時有出血點或灰白色病灶。不同豬場所表現(xiàn)的臨床癥狀和病理變化的嚴重程度不同，這與混合/繼發(fā)感染的類型以及豬場的飼養(yǎng)管理有關(guān)。

7、什么階段的豬最易感斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征？

不同豬場由于飼養(yǎng)管理、母源抗體水平及繼發(fā)/混合感染的差別，發(fā)病年齡和嚴重程度不同。主要易感階段有斷奶前后（即3-6周）、12-16周齡。如遇轉(zhuǎn)群運輸?shù)葢?yīng)激也可出現(xiàn)發(fā)病高峰。

8、豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）/豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）是同一個病嗎?不是，豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原是２－型圓環(huán)病毒，有或沒有其它致病菌都可發(fā)生ＰＭＷＳ。當ＰＭＷＳ病豬繼發(fā)一些呼吸道病的病原時，可以出現(xiàn)呼吸困難等癥狀。豬呼吸道疾病綜合征是指多病原引起的呼吸道疾病征候群，其病原不一定包含圓環(huán)病毒。

9、抗生素對圓環(huán)病毒病有治療效果嗎？

無論是多系統(tǒng)衰竭綜合征、呼吸道疾病綜合征還是其它的復(fù)合感染，其病原均有病毒、細菌等多種致病微生物引起。抗生素對大多數(shù)細菌、支原體、原蟲有療效，只要能查清繼發(fā)感染的病原種類、選用敏感藥物，能有效降低發(fā)病嚴重程度，減少死亡率。但由于病毒往往是原發(fā)性致病因素，抗生素對病毒無效。所以抗生素的療效并不理想，一旦停藥，往往復(fù)發(fā)。

10、Ｐ－特產(chǎn)品特點是什么？療效如何？

Ｐ－特是中藥復(fù)方制劑，為中藥提取后精制而成，易吸收、療效穩(wěn)定、用量省、適口性特好，治愈后不會復(fù)發(fā)。中藥的抗病毒作用是早有定論的，正因為Ｐ－特針對原發(fā)性病毒直

接起作用，其療效是目前同類產(chǎn)品屈指可數(shù)的．而且Ｐ－特內(nèi)含免疫增強因子，能迅速恢復(fù)病豬被抑制的免疫機能，有效防止復(fù)發(fā)，使用得當，療效非常明顯。

11、Ｐ－特應(yīng)如何使用？

因為一旦發(fā)病，損失是不可避免的，所以最好是預(yù)防用藥，可以按每１０００kg飼料添加１kgＰ－特，連用１周的方法使用。早期斷奶仔豬由于采食量很低，可以適當增加用量。豬呼吸道疾病的傳染性很強，所以在治療時應(yīng)對尚未發(fā)病的豬進行預(yù)防，以防病情蔓延。病豬應(yīng)及時隔離，治療可采用飲水給藥，為了保證病豬都能有足夠的藥量可采取喂服。鑒于豬呼吸道疾病的復(fù)雜性，一旦形成內(nèi)臟病變，則需要漫長的恢復(fù)期，所以防治重點是預(yù)防和早期用藥。

12、Ｐ－特能否與抗生素合用？

Ｐ－特是中藥制劑，與化藥有協(xié)同作用，可以降低抗生素的用量，提高抗生素的療效。如果和抗生素混合在一起使用，則應(yīng)根據(jù)藥物的性質(zhì)決定，Ｐ特是酸性藥，應(yīng)避免與堿性藥物和喹諾酮類混合使用。

13、Ｐ－特使用過程中還應(yīng)注意哪些問題？

由于豬病的復(fù)雜性，在使用前應(yīng)注意對繼發(fā)／混合感染的診斷，專家建議，下列病豬可按如下治療方案：混合感染、弓形體、附紅細胞體時，則應(yīng)同時使用對弓形體、附紅細胞體有效的藥物，如長效土霉素、914A、磺胺六甲氧嘧啶；如果氣喘病很嚴重，則應(yīng)同時用強力霉素控制支原體；胸膜肺炎放線桿菌、副嗜血桿菌、巴氏桿菌等可選用氟苯尼考。一般來說，呼吸困難、咳嗽越明顯、鼻涕呈黃色、體溫越高、病程越短、死亡率越高表明繼發(fā)／混合感染越嚴重，為提高療效，宜配合抗生素同時使用。而以消瘦、生長不良等為主要癥狀的，無需使用抗生素。臨床應(yīng)用表明，對呼吸道疾病綜合征，與氟苯尼考、替米考星、阿奇霉素等配合使用，療效十分顯著。

14、為什么有的豬場使用Ｐ－特效果不是很好？

原因有：１）有豬瘟等高致死性的疫病存在；２）存在弓形體、附紅細胞體等混合/繼發(fā)感染；３）發(fā)病晚期，機體已形成無法逆轉(zhuǎn)的病變，如壞死、粘連等。

15、Ｐ－特是否應(yīng)與退熱藥同時使用？

不需要，Ｐ－特本身含清熱解毒成份，退熱藥不能抗菌、抗病毒，盲目退熱只會使機體抗病力下降，病情復(fù)雜化。使用Ｐ－特一個療程后，病豬體溫自然下降，表明病豬已經(jīng)康復(fù)。

16、圓環(huán)病毒病有疫苗嗎？

到目前為止，尚無商品疫苗供應(yīng)，現(xiàn)有圓環(huán)病毒－藍耳病病毒二聯(lián)苗中試產(chǎn)品，效果和安全性有待評價。有些豬場應(yīng)用自家苗，其效果的往往因抗原濃度不足而欠佳。

17、為什么有的病豬治療后體溫和精神都正常，而食欲不佳，應(yīng)如何處理？

這部分豬主要是重病豬，病程較長，造成機體腸道菌群失調(diào)，脾胃虛弱及病原體內(nèi)毒素引起的。飼養(yǎng)管理方面可以補充電解質(zhì)或電解多維，以及給予優(yōu)質(zhì)易消化飼料和青飼料調(diào)理。

18．除治療外，還應(yīng)注意些什么？

在積極治療的同時，應(yīng)注意：１）全進全出的飼養(yǎng)方式；２）限制寄養(yǎng)和合群；３）盡可能減少應(yīng)激因素；４）合理按排免疫程序；５）降低飼養(yǎng)密度和增加空氣流通；６）及時隔離和淘汰。配圖文字：

1、皮炎腎病綜合癥：病豬后軀密布圓形成不規(guī)則丘疹，可見中間呈黑色外周紫紅色的病灶。

2、皮炎腎病綜合癥腎臟腫大，呈土黃色，表面散布大小不一的灰白色壞死點。

3、圓環(huán)病毒感染，圖為同窩健康豬及病豬體重差異懸殊。

4、典型的多系統(tǒng)衰竭綜合癥：病豬消瘦、拱背、蒼白、生長不良。

5、PCV-2感染心臟變形，心肌松軟，冠狀溝脂肪萎縮黃染。

6、腹股溝線淋巴結(jié)顯著腫大、蒼白、切面多汁。

7、繼發(fā)副嗜血桿菌引起的胸膜炎、心包炎、肝周炎。

8、混合感染的肺出現(xiàn)肉樣變。

9、圓環(huán)病毒引起的相關(guān)性腸炎。

10、購入豬出現(xiàn)圓環(huán)病毒混合多種病原感染出現(xiàn)的綜合癥：消瘦、肺炎、腸炎、生長不良。

11、圓環(huán)病毒與細菌混合感染：淋巴結(jié)腫大，皮質(zhì)出血。

12、混合感染豬瘟：腎臟腫大、瘀血，散在針尖狀出血，表面于溝回狀。更多請訪問http:///

第五篇：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)衣殼蛋白表達綜述

PCV2是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員，為單股環(huán)狀負鏈無囊膜的DNA病毒, 為已知的最小動物病毒之一，約17~ 20nm, 二十面體對稱。根據(jù)病毒的抗原性和基因組成不同，可分為2種基因型或稱血清型, 即PCV1型和PCV2型。PCV1無致病性。PCV2具有致病性，基因組全長1767bp或1768bp，包括11個讀碼框，其中ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白)核衣殼蛋白(Cap)，其N端包含一個由41個氨基酸殘基組成的的核定位信號(Nuclear location signal，NLS)，與PCV2在細胞核內(nèi)定位有關(guān)。Mahe和Liu等分別在sf 9真核細胞及大腸桿菌中進行了PCV2Cap蛋白的表達, 但Cap蛋白的表達量較低。為了提高Cap蛋白的表達量, 本實驗成功構(gòu)建去除NLS的重組質(zhì)粒, 并對其進行表達、純化、鑒定。

1材料和方法

1.1pcv-581重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.1.1PCR擴增去除NLS基因的pcv-581

1.1.1.1引物的設(shè)計與合成: 根據(jù)本實驗室保存毒株的測序結(jié)果, 用Oligo6.0設(shè)計刪除核定位信號特異引物(由大連寶生物工程公司合成), 并引入限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII(加下劃線表示)。上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;產(chǎn)物長度581bp。

1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接種PCV2病毒的PK-15細胞懸液500uL, 常規(guī)方法提取, 最后加20uL滅菌去離子水溶解,-20度保存。

1.1.1.3PCR擴增: PCR的反應(yīng)體系總體積25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去離

子水補到25LL。反應(yīng)參數(shù)為: 95e , 5min;94e, 45

s;55.9e, 45s;72e, 45s;30個循環(huán);72e , 7min。

取5LLPCR產(chǎn)物進行電泳分析(見圖1)。

1.1.1.4PCR擴增產(chǎn)物的酶切、回收: 醇沉淀PCR

擴增產(chǎn)物、酶切、回收。具體操作方法如下: PCR

產(chǎn)物補到100LL, 加入等體積異丙醇, 置-20e 靜

止過夜, 13 000r/ min離心15min棄上清, 加入

600LL75%乙醇, 7000r/min離心5min, 倒掉上清,晾干, 加入10LL滅菌去離子水溶解。將醇沉產(chǎn)物

進行BamHI酶切, 體系為20LL: 10@buffer K2LL,BamHI 1LL(15U/ LL , TaKaRa), 醇沉產(chǎn)物10LL,H2O7LL, 37e 酶切1h。將酶切產(chǎn)物繼續(xù)醇沉淀

(方法步驟同上)后進行HindIII(15U/ LL, TaKaRa)

單酶切, 酶切體系同上, 回收目的片段。

1.2pQE-pcv581重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定: 將載

體pQE-32(QIAGEN)質(zhì)粒用BamHI 和HindIII雙

酶切, 做100LL 酶切體系: 10@ buffer K10LL,BamHI2LL, HindIII 2LL, pQE-32質(zhì)粒70LL, H2O

16LL。37e 酶切2h15min, 用膠回收試劑盒回收

(TIANGEN, 操作按照說明書進行), 目的片段和載

體常規(guī)方法連接、轉(zhuǎn)化M15、篩選陽性重組質(zhì)粒

pQE-pcv581。酶切鑒定(見圖2)。

1.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

從含有氨芐抗性的瓊脂平板上挑取單個陽性

菌落接種到5mL氨芐抗性(100Lg/ mL)的LB液體 培養(yǎng)基中, 37e 過夜振蕩培養(yǎng)、活化, 取過夜活化 的培養(yǎng)物按照的比例接種到5mL含氨芐抗性的液 體LB培養(yǎng)基, 37e 振蕩培養(yǎng), 培養(yǎng)至OD600nm達 0.4-0.6, 然后加入IPTG(TaKaRa)至終濃度為0.2mmol/ L、0.4mmol/ L、0.6mmol/ L、0.8mmol/ L、1.0mmol/L、1.2mmol/L繼續(xù)培養(yǎng), 分別在誘導(dǎo)前、誘 導(dǎo)1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取樣, 取1mL菌液離心