第一篇：江蘇省54家PCR技術(shù)驗(yàn)收合格單位名單

江蘇省54家PCR技術(shù)驗(yàn)收合格單位名單

發(fā)布時(shí)間：2006-12-1

根據(jù)衛(wèi)生部下發(fā)的《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2002〕10號(hào)）和《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》（衛(wèi)檢字〔2002〕8號(hào)）規(guī)定，省臨檢中心對(duì)全省開展PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了驗(yàn)收，截止2005年底，共有54個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)驗(yàn)收。現(xiàn)將通過(guò)驗(yàn)收的醫(yī)療機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室名單公布如下：

江蘇省54家PCR技術(shù)驗(yàn)收合格單位名單 江蘇省人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科 PCR實(shí)驗(yàn)室 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院放免中心 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

南京市鼓樓醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 基因診斷實(shí)驗(yàn)室

東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院免疫科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

南通大學(xué)附屬醫(yī)院酶學(xué)研究室 基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室 連云港第一人民醫(yī)院腫瘤生物治療中心 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

南京市兒童醫(yī)院兒科研究所 基因擴(kuò)增室 南京市婦幼保健院遺傳診斷研究室 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

鹽城市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院放免中心 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

昆山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

常州市第一人民醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)室 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

常州市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

常州市武進(jìn)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

溧陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

無(wú)錫市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 臨床基因擴(kuò)增室

無(wú)錫市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 中心實(shí)驗(yàn)室 無(wú)錫市第三人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 臨床基因擴(kuò)增室

無(wú)錫市第四人民醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室 臨床基因擴(kuò)增室

宜興市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

揚(yáng)州市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 南京市第二醫(yī)院肝病研究室 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室

蘇州市立醫(yī)院總部檢驗(yàn)科 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

淮安市楚州醫(yī)院檢驗(yàn)科 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 32 常熟市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 33 張家港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 34 無(wú)錫市婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 35 江陰市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 PCR實(shí)驗(yàn)室

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院（所）性病參比實(shí)驗(yàn)室 PCR實(shí)驗(yàn)室 37 南京醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 38 淮安市第四人民醫(yī)院肝病研究所 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 39 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

蘇州市第五人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室 41 常熟市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 42 常州市紅十字中心血站 HLA配型實(shí)驗(yàn)室

無(wú)錫市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室 44 南京揚(yáng)子醫(yī)院傳染科 PCR實(shí)驗(yàn)室 45 寶應(yīng)縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 PCR實(shí)驗(yàn)室

淮安市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 分子生物學(xué)室 47 常州市婦幼保健院臨床實(shí)驗(yàn)室 PCR實(shí)驗(yàn)室 48 鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 PCR實(shí)驗(yàn)室 49 江蘇省血液中心 分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室

徐州中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室 51 徐州第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室

大屯煤電（集團(tuán)）公司中心醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 53 蘇州木瀆人民醫(yī)院、吳中中醫(yī)院檢驗(yàn)科 臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 54 無(wú)錫市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室

第二篇：pcr檢測(cè)技術(shù)

《食品安全學(xué)》綜述

PCR快速檢測(cè)技術(shù)綜述

1．前言

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾個(gè)星期才能做到的事情，用PCR幾個(gè)小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

該酶促反應(yīng)最基本的3個(gè)環(huán)節(jié)是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA；[2]引物與模板鏈的特異性復(fù)性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)建立以來(lái)，定性技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，可以達(dá)到檢測(cè)單個(gè)靶序列的水平、但實(shí)際工作中常需要定量檢測(cè)標(biāo)本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對(duì)基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。定量PCR旨在評(píng)估樣品中靶分子數(shù)，此測(cè)定可以是絕對(duì)的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對(duì)定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個(gè)，即對(duì)PCR產(chǎn)物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴(kuò)增、競(jìng)爭(zhēng)性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對(duì)其選擇取決于靶基因的特性、對(duì)PCR產(chǎn)量的期望值、對(duì)準(zhǔn)確度的要求、需要相對(duì)還是絕對(duì)定量。

人類對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟，對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動(dòng)合成階段，這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。

1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過(guò)兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

但是，最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過(guò)對(duì)所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué) 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。3.國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

3.1.基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用

目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說(shuō)幾乎沒有一個(gè)分子生物學(xué)家沒有使用過(guò)PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，可用于達(dá)到以下目的：

[1] 擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究； [4]基因組測(cè)序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應(yīng)用[2]

[1]在遺傳學(xué)上的應(yīng)用：人類的遺傳性疾病是因?yàn)槟骋粔A基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，通過(guò)PCR結(jié)合限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對(duì)遺傳性疾病進(jìn)行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個(gè)外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個(gè)新的PstI酶切點(diǎn)，因此可以使用PCR-RFLP對(duì)血友病進(jìn)行診斷。PCR還可以用來(lái)檢測(cè)遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。

[2]在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對(duì)不同腫瘤尋找其特異而敏感的標(biāo)志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及療效評(píng)估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時(shí)可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測(cè)微小殘留病灶，以進(jìn)一步改進(jìn)治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個(gè)細(xì)胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細(xì)胞PCR技術(shù)對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。[3]在基因分型中的應(yīng)用：當(dāng)進(jìn)行器官移植時(shí)并須先組織配型工作，此時(shí)常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對(duì)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進(jìn)行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性也可以用于對(duì)HLA的分型。3．3.在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[3]

例如：最早應(yīng)用DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性結(jié)合PCR-RFLP來(lái)進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復(fù)PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。使用PCR技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小并且適于對(duì)高度降解材料的檢測(cè)。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面。可以說(shuō)，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。21世紀(jì)是生物工程的世紀(jì)。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會(huì)不斷地得到擴(kuò)充和完善，PCR技術(shù)也將4.相關(guān)檢測(cè)技術(shù) 4.1.技術(shù)原理

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。4.2.工作原理

類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍 4.3.工作步驟

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度 5.研究方案

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。5.1研究方法

① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無(wú)法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過(guò)程中通過(guò)監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無(wú)法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽(yáng)性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無(wú)線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問(wèn)題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術(shù)路線

PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡(jiǎn)便、可擴(kuò)增RNA或cDNA、對(duì)起始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設(shè)計(jì)的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時(shí)可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設(shè)計(jì)引物鏈時(shí)應(yīng)充分考慮引物特異性。引物長(zhǎng)度一般為15-30個(gè)堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長(zhǎng)可能導(dǎo)致非特異DNA擴(kuò)增。模板DNA：應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲(chǔ)存液pH應(yīng)為7.0，在反應(yīng)體系中，4種dNTP的濃度應(yīng)相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應(yīng)體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究?jī)?nèi)容

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫(kù)中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。6．1.檢測(cè)對(duì)象

常見的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。[4]乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能 6．2檢測(cè)內(nèi)容

PCR反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)循環(huán)擴(kuò)增后，所需做的工作就是檢測(cè)反應(yīng)液中是否存在預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測(cè)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析、核酸序列分析。

PCR技術(shù)類型[5]

免疫PCR技術(shù) 原位PCR技術(shù) 不對(duì)稱PCR技術(shù) 巢式PCR技術(shù) 反向PCR技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

復(fù)合PCR技術(shù)

彩色PCR技術(shù)

抗原捕獲PCR技術(shù) 增敏PCR技術(shù)

酶標(biāo)PCR技術(shù)

二溫式PCR技術(shù)

錨定PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)

毛細(xì)管PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)

巢式或套式PCR技術(shù) 7.預(yù)期目標(biāo)PCR 技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中

（1)簡(jiǎn)單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應(yīng)用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測(cè)時(shí)間為3h。Thomas等用PCR擴(kuò)增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測(cè)定,檢測(cè)時(shí)間為ld。

徐建國(guó)等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設(shè)計(jì)了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡(jiǎn)單PCR,近年來(lái)國(guó)外學(xué)者對(duì)多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價(jià)值方面進(jìn)行了研究。Meng等同時(shí)擴(kuò)增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長(zhǎng)度分別為633、210、484bp。此引物設(shè)計(jì)可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質(zhì)粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1087、227、224、166bp。嚴(yán)笠選用針對(duì)大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對(duì)引物,在同一擴(kuò)增體系中進(jìn)行PCR,檢測(cè)12株不同來(lái)源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結(jié)果復(fù)合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽(yáng)性結(jié)果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中的應(yīng)用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養(yǎng)過(guò)程,直接用原位PCR技術(shù)結(jié)合落射顯微鏡,在單細(xì)胞水平快速檢測(cè)O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測(cè)中

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類方法主要依賴于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，微生物檢測(cè)進(jìn)入了基因時(shí)代，以核糖體核糖核酸序列為基礎(chǔ)的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學(xué)方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡(jiǎn)便、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光;檢測(cè)HIV-1載量的熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的建立及其應(yīng)用[J];中國(guó)病毒學(xué);2001年02期

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第三篇：PCR技術(shù)原理及心得.

PCR技術(shù)原理與心得體會(huì)

PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi),有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè),大于48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。

一.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過(guò)程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無(wú)條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。

物理原因:變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

二.假陽(yáng)性,出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 1.假陽(yáng)性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決:①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片

段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

2.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低,及PCR 循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn),酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸。

3.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過(guò)高,Mg2+濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低,循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有:①減少酶量,或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。

三.PCR污染與對(duì)策

PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛 的問(wèn)題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因

(一標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。

(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問(wèn)題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。

還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題.(四實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問(wèn)題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

四.對(duì)照試驗(yàn)

1.陽(yáng)性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下,但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本,其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí),在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3.重復(fù)性試驗(yàn)

4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 五.防止污染的方法

(一合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板

核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。(三預(yù)混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR 產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(四防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使 用。(五設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最 低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一 管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。(六減少 PCR 循環(huán)次數(shù)，只要 PCR 產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。(七選擇質(zhì)量好的 Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。呵呵 其實(shí) DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的質(zhì)量也很關(guān)鍵 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 與 RNA 的 PCR 結(jié)果有很大的差異的。呵呵。

第四篇：pcr室驗(yàn)收整改措施（共）

pcr室驗(yàn)收整改措施（共7篇）

第1篇：供應(yīng)室整改措施供應(yīng)室整改措施

篇1：消毒供應(yīng)室室質(zhì)量檢查存在的問(wèn)題及整改措施

消毒供應(yīng)室質(zhì)量檢查存在問(wèn)題及整改措施

檢查人:

日期：

篇2：縣中醫(yī)院消毒供應(yīng)室驗(yàn)收整改報(bào)告

甕安縣中醫(yī)院

關(guān)于消毒供應(yīng)室驗(yàn)收整改報(bào)告

縣衛(wèi)生食品藥品監(jiān)督管理局：

按照《貴州省醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒供應(yīng)室驗(yàn)收評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》的要求，州、縣主管部門及評(píng)審專家組于20XX年3月22日對(duì)我院遷建的消毒供應(yīng)室進(jìn)行了認(rèn)真、嚴(yán)格的現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)收、評(píng)審，結(jié)果我院以950分通過(guò)了消毒供應(yīng)室的評(píng)審驗(yàn)收，但在建設(shè)中已存在不足。專家組在評(píng)審會(huì)議上提出了以下六個(gè)方面的問(wèn)題：

1、供應(yīng)室未相對(duì)獨(dú)立，自然通風(fēng)條件欠佳。

2、無(wú)輔助區(qū)域，回收間無(wú)負(fù)壓。

3、器械消毒時(shí)還存在完全閉合消毒的現(xiàn)象。

4、單包裝的尖銳器械未上保護(hù)套。

5、回收區(qū)域無(wú)專用感染物品的沖洗池。

6、無(wú)菌物品無(wú)追溯記錄登記本。

我院針對(duì)專家提出的建議，高度重視，專題會(huì)議研究和部署，迅速組織相關(guān)人員在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成，及時(shí)制定了相應(yīng)的整改措施，逐條落實(shí)，現(xiàn)將整改情況匯報(bào)如下：

1、針對(duì)第1、2個(gè)問(wèn)題，我院目前屬部分搬遷，現(xiàn)新建的供應(yīng)室是在原縣醫(yī)院用地上建設(shè)的，因受地理?xiàng)l件的限制，自然通風(fēng)條件欠佳，無(wú)輔助區(qū)域，待醫(yī)院整體搬遷后再行改擴(kuò)建。

2、我院根據(jù)《醫(yī)院消毒供應(yīng)中心清洗技術(shù)規(guī)范》及相關(guān)制

度，打包滅菌時(shí)器械已采用不完全鎖扣消毒，并定期加強(qiáng)督查。

3、根據(jù)《醫(yī)院消毒供應(yīng)中心清洗技術(shù)規(guī)范》單包裝的尖銳器械已上保護(hù)套，并定期加強(qiáng)督查。

4、回收區(qū)已于20XX年3月25日安裝專用感染物品的沖洗池。

5、按照相關(guān)制度及要求已建立無(wú)菌物品追溯登記本。

總之，我院按照評(píng)審專家組整改意見，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，逐條落實(shí)，已于20XX年3月25日整改完畢。

甕安縣中醫(yī)院

20XX年3月26日

篇3：供應(yīng)室等級(jí)驗(yàn)收中存在問(wèn)題與整改措施

供應(yīng)室等級(jí)驗(yàn)收中存在問(wèn)題與整改措施

一、布局、流程有欠合理

二、未做到全院集中回收、供給

三、未做到密閉下送、回收

四、人員配置欠合理，壓力容器上崗證不能做到人人持有。

整改措施：

一、內(nèi)部還可稍做改建，但改建后依然不符合規(guī)范中供應(yīng)室布局的要求。

二、供應(yīng)室去污區(qū)使用面積太小，已沒有地方可放置浸泡呼吸管道

容器，只有等清洗管道的清洗架到了進(jìn)行機(jī)洗，同時(shí)解決供應(yīng)

室人員配置問(wèn)題，才能共同解決第三、第四問(wèn)題。

三、人員配置問(wèn)題解決了，就可以做到密閉下收下送。

四、供應(yīng)室合理人員配置應(yīng)是：專業(yè)人員6＋工勤2。

按照人力資源

管理理念，專業(yè)人員應(yīng)做專業(yè)的事（準(zhǔn)備用物、清洗打包）工

勤人員應(yīng)擔(dān)任消毒（培訓(xùn)、拿證），密閉下送，回收手術(shù)室器械。

又能保證消毒人員都持有壓力容器上崗證，又符合規(guī)范中供應(yīng)

室管理要求，既做到專業(yè)人員合理應(yīng)用，有節(jié)約因人員

應(yīng)用不

合理，造成人人上崗必培訓(xùn)拿證所付出資本投入。

供應(yīng)室

20XX年8月1日

第2篇：供應(yīng)室等級(jí)驗(yàn)收中存在問(wèn)題與整改措施供應(yīng)室等級(jí)驗(yàn)收中存在問(wèn)題與整改措施

一、布局、流程有欠合理

二、未做到全院集中回收、供給

三、未做到密閉下送、回收

四、人員配置欠合理，壓力容器上崗證不能做到人人持有。

整改措施：

一、內(nèi)部還可稍做改建，但改建后依然不符合規(guī)范中供應(yīng)室布局的要求。

二、供應(yīng)室去污區(qū)使用面積太小，已沒有地方可放置浸泡呼吸管道

容器，只有等清洗管道的清洗架到了進(jìn)行機(jī)洗，同時(shí)解決供應(yīng)室人員配置問(wèn)題，才能共同解決第三、第四問(wèn)題。

三、人員配置問(wèn)題解決了，就可以做到密閉下收下送。

四、供應(yīng)室合理人員配置應(yīng)是：專業(yè)人員6＋工勤2。按照人力資源管理理念，專業(yè)人員應(yīng)做專業(yè)的事（準(zhǔn)備用物、清洗打包）工勤人員應(yīng)擔(dān)任消毒（培訓(xùn)、拿證），密閉下送，回收手術(shù)室器械。又能保證消毒人員都持有壓力容器上崗證，又符合規(guī)范中供應(yīng)室管理要求，既做到專業(yè)人員合理應(yīng)用，有節(jié)約因人員應(yīng)用不合理，造成人人上崗必培訓(xùn)拿證所付出資本投入。

供應(yīng)室

年8月1日

第3篇：檔案室整改措施[推薦]xx鎮(zhèn)檔案工作按照上級(jí)相關(guān)部門的要求，結(jié)合學(xué)_實(shí)踐科學(xué)發(fā)展觀活動(dòng)適應(yīng)新形式的總體部署要求，通過(guò)廣泛征求各部門、單位的意見建議。經(jīng)整理得出以下幾個(gè)不足之處：

1、檔案庫(kù)房管理現(xiàn)代化手段落后，還沿用以前的老方法，科學(xué)創(chuàng)新不夠，需加快檔案現(xiàn)化化管理。

2、服務(wù)形式單一，無(wú)法滿足查閱者諸多方面的需要，服務(wù)質(zhì)量仍有待進(jìn)一步提高。

3、查閱室設(shè)施簡(jiǎn)單，需進(jìn)一步優(yōu)化查檔利用環(huán)境。

結(jié)合自身實(shí)際,針對(duì)以上3條意見建議，經(jīng)過(guò)鎮(zhèn)黨委、政府領(lǐng)導(dǎo)討論研究，提出了促進(jìn)科學(xué)發(fā)展的主要思路和措施，現(xiàn)制定如下整改措施：

(一)加強(qiáng)檔案庫(kù)房現(xiàn)代化管理。

1、繼續(xù)做好經(jīng)常性的日常維護(hù)管理工作。

2、重新制訂修改相關(guān)制度，進(jìn)一步明確管理人員的崗位職責(zé)。

(二)做好窗口服務(wù)工作，做到熱情周到、文明高效，方便老百姓查檔。

1、根據(jù)檔案查閱利用的相關(guān)法律法規(guī)規(guī)定，從方便群眾查閱利用出發(fā)，制訂便民措施。

2、做到文明用語(yǔ)，熱情周到。

3、結(jié)合政務(wù)公開，公開辦事程序，方便群眾查閱利用。

4、提供熱情周到優(yōu)質(zhì)服務(wù)，真正做到查檔、閱檔人員高興而來(lái)，滿意而歸。

第4篇：叉車充電室整改措施叉車充電室整改措施

一、建立叉車充電室衛(wèi)生崗位責(zé)任制。

二、在叉車充電室門框里側(cè)和外側(cè)粘貼警示帖。

三、在叉車充電室內(nèi)墻內(nèi)側(cè)粘貼叉車防撞警示貼。

四、對(duì)叉車充電室內(nèi)充電設(shè)備進(jìn)行清理并碼放整齊。

五、對(duì)叉車充電室內(nèi)消防設(shè)備及叉車零部件進(jìn)行整理并規(guī)

化碼放位置。

物流配送-09-02

第5篇：中支驗(yàn)收整改措施籌建工作整改情況的匯報(bào)

12月2日山東保監(jiān)局對(duì)合眾人壽淄博中心支公司的籌備工作進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)收，保監(jiān)局領(lǐng)導(dǎo)對(duì)籌備工作提出了一些須改善的問(wèn)題和對(duì)公司今后發(fā)展有益的建議。針對(duì)保監(jiān)局領(lǐng)導(dǎo)提出的問(wèn)題和建議，分公司和淄博中支籌備組十分重視，進(jìn)一步自查了籌備工作中存在的問(wèn)題，并用一個(gè)月的時(shí)間對(duì)存在的問(wèn)題進(jìn)行了整改，使各項(xiàng)籌備工作更加完善，中支公司的今后發(fā)展打下了良好的基礎(chǔ)。現(xiàn)把整改的主要工作匯報(bào)如下：

一、對(duì)中支班子成員及相關(guān)管理人員進(jìn)行了調(diào)整。

進(jìn)一步明確薛立志同志為籌備負(fù)責(zé)人兼團(tuán)代部經(jīng)理，分管團(tuán)銀業(yè)務(wù)；團(tuán)銀部設(shè)立團(tuán)險(xiǎn)業(yè)務(wù)管理崗和銀保業(yè)務(wù)管理崗分別由張斌、馬建華兩位同志擔(dān)任；王勇同志擔(dān)任助理分管個(gè)險(xiǎn)業(yè)務(wù)。年昕同志調(diào)分公司營(yíng)銷部擔(dān)任總督導(dǎo)長(zhǎng)，負(fù)責(zé)各中支的業(yè)務(wù)推動(dòng)和籌建指導(dǎo)，其余人員崗位不變，目前中支各管理崗位定位清晰，隊(duì)伍穩(wěn)定。鑒于淄博籌建初期年昕同志直接參與籌建，對(duì)當(dāng)?shù)厍闆r和隊(duì)伍狀況都較了解，為保證隊(duì)伍開業(yè)初期順利發(fā)展，近期將協(xié)助淄博中支工作一段時(shí)間。

二、充分做好一線隊(duì)伍的建設(shè)，使中支公司三條業(yè)務(wù)線的隊(duì)伍建設(shè)更加壯大。

對(duì)業(yè)務(wù)隊(duì)伍進(jìn)行了系統(tǒng)的培訓(xùn)和學(xué)_，使一線人員的業(yè)務(wù)技能得到了提高。另外還加強(qiáng)了代理人資格的培訓(xùn)和考試，持證人力由一個(gè)月前的40多人達(dá)到目前的約200人，為開業(yè)后的人力規(guī)模和100%持證率的達(dá)標(biāo)打下了良好的基礎(chǔ)。

三、強(qiáng)化了保險(xiǎn)法律法規(guī)的學(xué)_。

為了在今后的經(jīng)營(yíng)中更加規(guī)范，在分公司的組織下對(duì)管理人員進(jìn)行了法律法規(guī)的系統(tǒng)學(xué)_，制定了學(xué)_內(nèi)容和學(xué)_時(shí)間，并進(jìn)行考試，平均成績(jī)82分，保證了學(xué)_的效果，在學(xué)_中也得到了保監(jiān)局領(lǐng)導(dǎo)的指導(dǎo)和學(xué)_內(nèi)容的提供。今后分公司將把法律法規(guī)的學(xué)_納入制式學(xué)_的內(nèi)容，讓所有管理人員掌握制度，在今后的工作中更好的貫徹。

四、加強(qiáng)了對(duì)口業(yè)務(wù)的指導(dǎo)。

為保證各業(yè)務(wù)系列明確06年的發(fā)展方向和總分公司的經(jīng)營(yíng)思路保持一致，分公司各系列負(fù)責(zé)人前往淄博溝通座談，大家進(jìn)一步統(tǒng)一了思想、明確了業(yè)務(wù)拓展的方向和市場(chǎng)的主攻目標(biāo)，結(jié)合總公司提出的“主體跟隨、重點(diǎn)突破、局部超越”的戰(zhàn)略部署制定了各系列的06年的目標(biāo)和計(jì)劃。

五、進(jìn)一步加強(qiáng)了基礎(chǔ)管理和團(tuán)隊(duì)文化的建設(shè)。

新公司各項(xiàng)工作都要從無(wú)到有逐步完善，只有團(tuán)隊(duì)文化的真正形成才能更好的提升團(tuán)隊(duì)的凝聚力和戰(zhàn)斗力，為此我們充分利用開業(yè)前有足夠培訓(xùn)時(shí)間的機(jī)會(huì)加強(qiáng)了公司介紹、公司文化的學(xué)_，中支公司在管理制度的制定、日常的行為的規(guī)范、職場(chǎng)的布置等多方面做好文化的建設(shè)，中支管理文化初步形成。

六、元月4日分公司王總親自帶領(lǐng)分公司一行人員對(duì)淄博中支進(jìn)行了再次內(nèi)部檢查，各項(xiàng)工作均已落實(shí)到位，達(dá)到了預(yù)期的目的。

我們將在此次籌備的基礎(chǔ)上總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，不斷完善各項(xiàng)管理工作，不僅把淄博中支建設(shè)好，還要把過(guò)程中的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)總結(jié)好，為其他中支的建立和成長(zhǎng)做好借鑒，使合眾人壽在山東的發(fā)展真正做到健康、穩(wěn)健、快速發(fā)展。

合眾人壽山東分公司

年1月10日

第6篇：換藥室整改措施.3.24換藥室整改措施

年3月24日，我院懷疑換藥室被污染，立即通知換藥室人員對(duì)換藥室進(jìn)行封閉整頓。具體措施如下：

1.換藥室所有懷疑被病人污染的不在有使用價(jià)值的物品集中進(jìn)行焚燒處理。

2.換藥室所有器械、物品凡能用1%過(guò)氧乙酸浸泡的一律浸泡30分鐘，再清洗、打包、高壓滅菌。

3.所有無(wú)菌物品一律送供應(yīng)室重新高壓鍋滅菌。

4.換藥室內(nèi)各種用物用1%的過(guò)氧乙酸擦拭

5.換藥室三間物用40%的甲醛加熱熏蒸，密24小時(shí)后通風(fēng)。

具體：換藥室每間房子面積約70m3,每m3用40%的甲醛12ml,每間房屋用85ml，房屋內(nèi)溫度開空調(diào)保持在18℃以上，濕度保持在60%以上，加熱熏蒸密24小時(shí)后通風(fēng)。

注：換藥室在未徹底整頓之前任何人不得換藥。

第7篇：急診科門診輸液室整改措施關(guān)于地區(qū)對(duì)阿克蘇市醫(yī)院急診科免疫規(guī)范化管理專項(xiàng)整治活動(dòng)督察反饋意見整改措施

一、存在問(wèn)題

1、門診輸液室含氯消毒劑濃度監(jiān)測(cè)日期記錄到.2.3

二、改進(jìn)措施：

1、護(hù)士長(zhǎng)對(duì)科室工作質(zhì)控力度不夠，未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)科室存在的問(wèn)題，對(duì)各項(xiàng)護(hù)理工作及制度落實(shí)情況未檢查監(jiān)督。

2、個(gè)別護(hù)士對(duì)消毒隔離管理未按要求執(zhí)行，科室院感監(jiān)控員未盡到應(yīng)有的責(zé)任。

三、改進(jìn)措施：

1、護(hù)士長(zhǎng)對(duì)本次檢查出的問(wèn)題及時(shí)反饋，并跟蹤檢查做到及時(shí)整改。

2、科室加強(qiáng)護(hù)士工作責(zé)任心，嚴(yán)格執(zhí)行各項(xiàng)護(hù)理操作規(guī)程及消毒規(guī)范要求，保證患者安全。

急診科

.3.2

實(shí)驗(yàn)室整改措施

檢驗(yàn)室整改措施

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室整改措施（共7篇）

化驗(yàn)室整改措施（共19篇）

收費(fèi)整改措施

第五篇：江蘇省2011二級(jí)注冊(cè)建造師繼續(xù)教育單位名單

江蘇省二級(jí)建造師繼續(xù)教育培訓(xùn)單位公示

根據(jù)住房和城鄉(xiāng)建設(shè)部《注冊(cè)建造師繼續(xù)教育管理暫行辦法》(建市【2010】192號(hào))及《江蘇省二級(jí)注冊(cè)建造師繼續(xù)教育管理辦法》(蘇建規(guī)字【2010】8號(hào))的規(guī)定，經(jīng)各省轄市建設(shè)主管部門推薦，由省廳對(duì)各市推薦的培訓(xùn)單位進(jìn)行了認(rèn)真考核。經(jīng)研究，擬確定南京市城建中等專業(yè)學(xué)校等25家培訓(xùn)機(jī)構(gòu)為我省二級(jí)注冊(cè)建造師繼續(xù)教育培訓(xùn)單位，現(xiàn)予以公示。

公示時(shí)間為2011年5月10日-16日。期間，如對(duì)公示單位有異議，請(qǐng)與省廳建管處聯(lián)系。電話：025-51868657，聯(lián)系人：房福亮。

二級(jí)注冊(cè)建造師繼續(xù)教育單位名單

南京市城建中等專業(yè)學(xué)校 江蘇省南京工程高等職業(yè)學(xué)校 江蘇省建設(shè)集團(tuán)公司培訓(xùn)中心 江蘇建科建筑技術(shù)培訓(xùn)中心 南京工業(yè)大學(xué)土木工程學(xué)院 無(wú)錫市建設(shè)培訓(xùn)中心 無(wú)錫市江大培訓(xùn)服務(wù)中心 江蘇建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院（徐州）徐州工程學(xué)院

江蘇省常州建設(shè)高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 常州市建筑職工大學(xué) 蘇州市建設(shè)職業(yè)培訓(xùn)中心 蘇州市智信建設(shè)職業(yè)培訓(xùn)學(xué)校 蘇州科技學(xué)院成人教育學(xué)院 南通建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)校

南通市通州建筑職工中等專業(yè)學(xué)校 連云港市建設(shè)培訓(xùn)中心 淮安市建筑職工教育培訓(xùn)中心

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