第一篇：實時熒光定量PCR檢測限的統計推斷

實時熒光定量PCR檢測限的統計推斷

來源：中國論文下載中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭長華，常武

【摘要】 檢測限是檢測方法的重要性能指標，用Poisson分布的概率函數分式計算一次抽樣檢測出現的結果推論總體出現該結果的概率。以實時熒光定量PCR(FQPCR)檢測乙型肝炎病毒DNA結果為例，計算可知，一次抽樣反應管的檢測結果≥4時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而檢測血清中病原體時擴增反應管中的檢測限是4拷貝/ul計算也可知，1拷貝/ul表示一次抽樣的結果為0的概率可達0.368，結果在0拷貝/ul～4拷貝/ul的概率為0.996，而1000拷貝/ml表示一次抽樣結果為0的概率為0。結果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997；而100 000拷貝/L表示一次抽樣結果在997 000拷貝/L～1 003 000拷貝/L的概率為0.997。抽樣單位ul不能隨意放大為ml甚至L。

【關鍵詞】 實時熒光定量PCR；檢測限；統計推斷

Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR

Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation;Statistical conclusion

檢測限是檢測方法的重要性能指標，只有在檢測報告中明確表達了檢測方法的檢測限，該檢測報告在各實驗間及同一項目的各種檢測方法間才可進行比較。能檢測到的最低分析物濃度為檢測系統的檢測限。當前，檢測限術語混亂，如：靈敏度(sensitivity)、分析靈敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每個詞語的實際含義中包含有各自的實驗方式、數據處理方式及由數據作出的推論等。我們采用統計學方法，以期得到一致的實時熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)檢測限，現介紹如下。

文獻中FQPCR檢測限的描述

檢測乙型肝炎病毒DNA的文獻中檢測限使用了“最低檢出量”［2，3］、靈敏度［5～7］等術語，它等于已知的高拷貝HBV DNA血清10倍系列稀釋后能檢測到擴增曲線的最大稀釋倍數管濃度。表述有：陰性HBV DNA≤106拷貝/升［4］；熒光定量PCR法檢測靈敏度102拷貝/ml［5］、104拷貝/ml［6］、8.6×102拷貝/ml［7］；HCⅡ法檢測靈敏度1.4×105拷貝/ml［7］；103 Eq/ml理論值時到達檢測極限［3］；PCRFP檢測HBV DNA的最低檢測出量1×101拷貝［2］；bDNA在105 Eq/ml時到達檢測極限［3］。以上檢測限術語各不相同，且同一方法檢測HBV DNA在上述各實驗室發出同樣的“HBV DNA低于檢測下限”的報告時其實際HBV DNA拷貝數相差可達100倍。

FQPCR檢測過程簡介

以測定血清乙型肝炎病毒DNA為例：將40 μl血清樣本加40 μl DNA提取液處理后，將其中2 μl（相當于1 μl血清）加入主反應液（含DNA引物、酶、DNA構件分子dNTP等）管中，在自動熱循環上進行溫度循環，自動熱循環儀記錄每一反應管在每一次溫度循環的熒光強度，記30次溫度循環后結束。在PCR循環過程中，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數稱為Ct值（Cyclethreshold),它與反應管中DNA起始拷貝數的對數值（lgN)呈非常顯著的直線相關關系。自動熱循環儀對標準樣品自動生成一條Ct值對于起始拷貝數值（lgN)的工作曲線，并通過該工作曲線來確定待測未知樣品反應管的起始拷貝數（N）。當30次循環后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號時，儀器默認Ct值為30，不計算起始拷貝。確定FQPCR檢測限的統計學原理

如果被檢物的含量和檢測方法的空白響應量的波動服從正態分布規律，則檢測限可用多次檢測空白的方法來確定。可信限為95%時檢測限＝x空白+2.s空白；可信限為99.7%時檢測限=x空白+3.s空白。這是目前多數檢測限的確定方法。對核酸檢測方法的檢測限的理解可能與此有差別，但是原理應是一致的［1］，FQPCR檢測限也應是推論總體與空白有統計學差異的最小抽樣結果。

FQPCR檢測限的統計推斷

假設病原體在血液等體液中的分布是隨機的，則單位體積中(如1.0 μl)病原顆粒數的分布服從Poisson分布。以Poisson分布的概率函數公式計算一次抽樣檢測出現的結果推論總體概率。從理論上來說，使用PCR測定技術測定病原體核酸序列的量可低至1個拷貝［2］。例如：血清標本中加入等量的DNA提取液，于離心管中煮沸，4 ℃放置，離心，吸取上清液2 μl作模板 進行擴增檢測(2 μl上清液相當于抽樣1 μl血清)［2］，其中至少有1個拷貝的HBV DNA才能有典型擴增反應，這時檢測結果是1拷貝/μl。由Poisson分布的概率函數公式可計算出1次抽樣檢測結果出現0時，推斷總體為1～9的概率見表1。

表1 總體為1～9時抽樣為0的概率及總體（略）

在FQPCR檢測HBV DNA中，當30次循環后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號(即當Ct≥30)，反應管檢測結果為0時，推論總體拷貝數為1～9的概率之和>0.581 92，總體為其他的概率之和<0.5(此時報告0拷貝的可信限度低于50%)。總體為1時一次抽樣結果分別為1～9時的概率見表1。當一次抽樣結果≥4時，推論總體為1的概率≤0.015 33，所以對于病原體的檢測，一次抽樣反應管檢測結果≥4拷貝時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而上述檢測血清中病原體時一次抽樣反應管的檢測限是4拷貝/μl。當總體為1、2、3時一次抽樣結果為0的概率分別是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室間質量評價樣本靶值選擇1拷貝/μl、2拷貝/μl、3拷貝/μl時，無論實驗室實際檢測質量如何高，都將有36.79%、13.53%、4.98%的實驗室檢測結果為0而被判為不符合［按靶值的對數值GM±0.5 log(10)［9］作為可接受的定量范圍］。2005年衛生部室間質量評價中靶值為1.51拷貝數/μl的樣本符合率僅35.2%；Mancini C 等［9］報道一些實驗室對檢測下限附近的樣本(3.00 log IU/ml)準確定量有困難；Raggi CC等［10］也報道28.6%的實驗室(12/42)對最低濃度的樣本不能定量。這些都是因為檢測下限附近的樣本一次抽樣結果為0的概率太大所致，對此我們將另文詳細討論。造成上述文獻中檢測限差異較大的可能原因如下：用于10倍系列稀釋的已知高拷貝HBV DNA血清本身拷貝數的差異；對檢測限的理解差異，由一次抽樣沒能檢測到典型擴增的稀釋血清管推論總體濃度為0的可信度太低(<50%)；抽樣單位的任意放大：在上述HBV DNA檢測中，抽樣單位是1 μl血清［如血清前處理過程中有抽提(濃縮)過程，取2 μl上清液相當于實際含12.5 μl血清，則抽樣單位也只是12.5 μl］，而報告結果的單位是ml甚至L。當總體為1拷貝/μl時表示一次抽樣結果為0的概率達0.368，結果在0拷貝/μl～4拷貝/μl的概率為0.996；而總體為1 000拷貝/ml時表示一次抽樣結果為0的概率為0，結果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997(Poisson分布總體>50時近似正態分布，范圍是X±uα*√X，可信限為99.7%時uα=3);總體為100 000拷貝/L時表示一次抽樣結果在997 000拷貝/L～1 003 000拷貝/L的概率為0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR檢測為例，其他病源體核酸的FQPCR檢測也與其相同，檢測限是抽樣反應管的檢測限4拷貝/反應管；如反應管中加入模板量相當于12.5 μl血清則檢測限相當于0.32拷貝/ μl。此推斷僅是針對FQPCR技術本身的檢測限度，未就臨床上有意義的最小病源體核酸的拷貝數進行討論。【參考文獻】

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第二篇：熒光定量PCR的應用

熒光定量PCR 的原理及應用

熒光定量PCR 是一種新的實時定量檢測特定核酸技術,它是核酸探針技術、熒光共振能量傳遞技術和PCR 技術的有機結合，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等特點,是對原有PCR 技術的革新,擴大了PCR 的應用范圍。

實時熒光定量PCR（FQ-PCR）作為熒光定量PCR技術的一種，是基于熒光能量傳遞技術,通過受體發色團之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發色基團轉移到受體發色基團,受體熒光染料發射出的熒光信號強度與DNA產量成正比,檢測PCR 過程的熒光信號便可得知靶序列的初始濃度。它融匯PCR 技術的核酸高效擴增、探針技術的高特異性、光譜技術的高敏感性和高精確定量的優點,直接探測PCR 過程中熒光信號的變化以獲得定量的結果。目前已在眾多領域有廣泛的應用。

1、FQ-PCR 在預防獸醫學中的應用

PCR 技術的應用有許多局限,不能準確定量,假陽性率太高,只要有微量病原體存在就可以得到陽性結果,這不能完全作為診斷依據,只有當一定數量的病原體存在時才有臨床意義。FQ-PCR實現了PCR 從定性到定量的飛躍,有效解決PCR 污染和對模板定量不準確等問題。

1.1在動物病原菌檢測和鑒定中的應用

炭疽桿菌作為人獸共患病的病原,尤其炭疽桿菌的芽胞可作為生物武器的病原。科學家在100 L 純化空氣中加入炭疽桿菌芽孢,進行FQ-PCR檢測,1 h 內炭疽桿菌的單個芽孢就被檢測到。

1.2在動物病毒檢測和鑒定上的應用

FQ-PCR已應用于許多病原體的檢測,如對艾滋病病毒、乙型肝炎病毒DNA、尖銳濕疣皮損中HPVD-NA、與鼻咽癌關系密切的EB 病毒、結核分支桿菌、巨細胞病毒、A 型和B 型流感病毒等病原體的檢測。

3.3在動物寄生蟲檢測和鑒定中的應用

常用TaqMan 探針。如在被感染豬和鼠組織、全血、羊水以及腦脊髓液中的弓形蟲定量,其檢測極限相當于套式PCR , 但準確率大大提高。

2、FQ-PCR在畜牧業中的應用

科學家采用TaqMan 探針檢測雞γ干擾素、采用RT-FQ-PCR 證明中國黃牛背最長肌中cap nl mRNA 表達量與宰后3 d 的牛肉嫩度高度相關等。

3、FQ-PCR在其他方面的應用

3.1在動物檢疫領域的應用

FQ-PCR 可對動物源性飼料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量檢測。

3.2細胞因子表達定量檢測

常用FQ-PCR 測定細胞因子mRNA 表達情況,分析機體免疫狀態。利用FQ-PCR 測定雞、豬在注射疫苗、免疫增強劑以及在感染某種疾病情況下體內細胞因子的mRNA 表達水平。

3.3環境監測

應用FQ-PCR 對水資源及居家、辦公環境中的大腸埃希菌、藻青菌和一些寄生蟲進行監測。

3.4轉基因生物中的應用

用一個已知拷貝數的內源基因作為參照,同時對樣品作內源基因和外源基因的FQ-PCR。兩者達到熒光閾值時的Ct 值可得到外源基因的拷貝數;FQ-PCR 還可用于轉基因動物的純合性鑒定及對轉基因后外源基因表達情況進行監測。

第三篇：關于購買實時熒光定量PCR儀申請報告

關于購買實時熒光定量PCR儀申請報告

尊敬的校領導：

自我校2012年提出“五大工程”以來，人才隊伍實力與水平得到顯著提升，同時我們也清醒地認識到現在高校所面臨的生存危機，應對危機唯有發展壯大我校的軟實力：大力發展特色學科、特色專業；大力開發研究秦巴山區優勢生物資源，立足于秦巴山區，服務于全國。然而，我校在科研儀器設備配置方面還有待提高，我學科現需購置實時熒光定量PCR儀，申購理由如下：

高通量的檢測和定量核酸序列的實時定量PCR系統，在PCR反應體系中加入熒光集團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。廣泛應用于腫瘤的分子診斷，新藥篩選，基因表達研究，轉基因研究，單核苷酸多態性（SNP）及突變分析，病原體的分子檢測，遺傳分析等。

關于實時熒光定量PCR儀功能介紹：我校位于秦巴山區，秦巴山區素有“天然藥庫”之稱，有著豐富的生物資源。隨著世界科研水平的發展，目前我校的儀器設備已不能滿足科研工作的要求。在對秦巴山區優勢中藥材功能基因的研究中：（1）對功能基因的發育階段表達、組織表達情況分析；（2）檢測功能基因RNAi干擾效率：功能基因的作用研究中，要對功能基因沉默表達（RNAi）分析，檢測RNAi的干擾效率要用到實時熒光定量。（3）對功能基因相關基因表達模式分析。

作為一所

院校，擁有一臺性能良好的實時熒光定量PCR儀，是學校發展和從業教師的需求。可行新分析：

（1）研究功能基因，實時熒光定量PCR儀是必不可少的儀器設備；（2）實時熒光定量PCR儀操作簡單，經過簡單培訓即可學會；（3）試劑耗材費

（4）應用廣泛

科研領域都在用 主要技術指標：

熱循環系統

新型半導體

96/384孔

可升級選配低密度芯片 光學系統

氬離子激光器 全波長光柵 冷CCD 掃描模式

全程掃描

軟件系統

Primer Express 3.0探針引物設計軟件 SDS 軟件 絕對定量 相對定量 等位基因分析 陰陽性結果自動判斷

反應系統

最低可在35分鐘內完成PCR實驗

5ul反應體積（選配低密度芯片可至1ul）

配套試劑盒

30萬基因表達試劑盒 200萬SNP試劑盒 可代客定做引物模板 專業轉基因 致病菌篩選試劑盒 主要性能：

全波長光柵分光，添加新染料無需更換濾光片，同時檢測8種以上熒光染料，最大限度實現多重定量，SNP分析等應用。

完備，多樣，專用的軟件，無需人工計算，完成定量實驗

多組份熒光校正軟件，一體化硬件設計，輔助ROX熒光，保證定量結果的準確性和高分辨率（裝機指標，5000和10000達到2倍的拷貝數）

齊備的試劑盒 幫助客戶完成高要求的實驗

9、可為客戶提供安裝操作鑒定（IQ/OQ）驗證文件服務，以符合GLP/GMP對生產設備的要求。

技術參數：

（1）色熒光，可用于多重PCR檢測（2）激發光源壽命

（3）檢測器：

成像系統，無時間差，保證結果的準確（4）溫度控制系統：半導體控溫（5）溫度準確性≤±0.05℃（6）溫度控制范圍：

（7）動力學線性范圍：

個數量級，區分

拷貝兩倍差異濃度的樣本，其致信度高達多少99.7%（8）支持ROX或其它染料用做參比熒光，同時，軟件支持無參比染料設置（9）試劑開放，耗材開放，（10）儀器性能有原廠裝機試劑盒驗證（11）靈敏度：

（12）激發/發射濾光片：是否支持客戶自行添加染料。（13）可檢測450～750nm連續波長

（14）數據分析：可同時分析

色熒光PCR數據；有無絕對定量、相對定量功能；可否選擇多個看家基因進行數據處理；可否自動根據擴增效率對數據進一步處理，得到更加準確可靠的結果；軟件支持分析無限制數量的數據文件，增大反應通量；具有等位基因、熔解曲線分析功能；軟件支持進行加樣重復及生物學重復結果的統計。

（15）配置專業引物探針設計軟件，用于基因引物探針設計，并且保證退火溫度一致性。

第四篇：熒光PCR檢測原理

實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，利用熒光信號來實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。其特點有：

(1)用產生熒光信號的指示劑顯示擴增產物的量，進行實時動態連續的熒光監測，避免終點定量的不準確性，并且消除了標本和產物的污染，且無復雜的產物后續處理過程。

(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。Real-time O-PCR可以應用于mRNA表達的研究、DNA拷貝數的檢測、單核苷酸多態性的測定、細胞因子的表達分析、腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監測。實時熒光定量PCR技術的基本原理

在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監測整個PCR進程，在PCR循環中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標。并且引入一個——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產生可被檢測到得熒光信號所需的最小循環數，是在PCR循環過程中熒光信號由本底開始進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。熒光閾值相當于基線熒光信號的平均信號標準偏差的10倍。一般認為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號，可以用于定義一個樣本的Ct值。通常用不同濃度的標準樣品的Ct值來產生標準曲線，然后計算相對方程式。

方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標準曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關系數（R2＞0.99），這樣才能認為實驗的過程和數據是可信的，使用這個方程式計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標準曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量PCR技術的應用 1.基因工程研究領域

① 基因表達研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行檢測，其結果特異性強、定量準確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數據。

② 轉基因研究：利用兩種發光探針及適當的循環閾值，擴增一個轉移后的基因和一個對照基因，以分析轉基因老鼠接合性。該方法為45個轉基因動物的同型結合及異質結合提供了明確的鑒定結果。通過實時定量PCR檢測，同型結合的異質接合動物交配后其子代中轉基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規律。這項技術在轉基因動物繁育及基因劑量功能效應實驗中將有很大的用途。③ 單核苷酸多態性（SNP）及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩定性。基因突變基于兩條探針，一條探針橫跨突變點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體得穩定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態性進行分析。2.醫學研究領域

① 病原體檢測：由于實時熒光定量PCR方法可靠性和重復性好，并且操作簡便、快速、結果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結核桿菌、巨細胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關病原體核酸量與感染性疾病發生、發展和預后之間關系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標準。

② 藥物療效考核：利用實時熒光定量PCR技術檢測臨床樣品中與抗藥性相關的基因的表達。結果證明，實時熒光定量PCR系統是定量檢測抗藥基因表達的可靠方法，應用這種技術可以預測化療將引起的反應。

③ 腫瘤基因檢測：腫瘤的本質是細胞內基因發生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實時熒光定量PCR方法都可以檢測出來。

目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現。熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。3.其他領域

用實時熒光定量PCR方法對免疫組分進行分析是其應用的重要方面。

所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。檢測方法

1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖

PCR產物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產物的單一性）2.TaqMan探針法：

探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。服務流程

1.客戶認真寫好訂單，提供待檢基因相關信息； 2.簽訂技術服務合同，支付預付款（30-50%)；

3.設計合成定量PCR引物（或客戶提供文獻引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉錄；

5.PCR預實驗，主要檢測引物的特異性和擴增效率； 6.正式定量實驗：對所有樣品上機檢測； 7.實驗結果和數據分析，形成報告。收費標準

優惠包干價：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對定量）

（含RNA提取，反轉錄，引物合成費用，上機測試費用（3個重復）；一個內參免費（內參3個重復）Ct值（Cycle threshold，循環閾值）的含義為：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數

（如圖1所示）。

1.熒光閾值（threshold）的設定

PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認）設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值與起始模板的關系

每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為擴增反應的循環次數，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。

起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下： 1.TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。

2.SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。3.分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光。1．傳統定量PCR方法簡介

1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。2．內標在傳統定量中的作用

由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內標對定量PCR的影響

若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的： 1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。

由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優勢。

第五篇：乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)

乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒

樣本要求

1.適用標本類型：血清或血漿 2.標本采集

1）血清：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫放置30—60min，血標本可自發完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機，1500 rpm離心5分鐘，吸取上層血清，轉移至1.5ml滅菌離心管

2）血漿：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA-2K或枸櫞酸鈉的玻璃管，立即顛倒玻璃管混合5—10次，使抗凝劑和靜脈血充分混勻，5—10分鐘后即可分離血漿，轉移至1.5 ml滅菌離心管

3.標本保存與運送：所采集的標本可立即用于測試，也可以保存在—20℃待測，保存期為6個月，標本運送采用0℃冰壺。檢驗方法

1.DNA提取（樣品制備區）

將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質控品、HBV 強陽性質控品、HBV臨界陽性質控品進行同步處理。1）取200μl樣品，加入450μlDNA提取液I和4μl的內標溶液，用振蕩器劇烈混勻15秒，瞬時離心數秒。100℃恒溫處理10±1分鐘 2）12000rpm離心5分鐘，備用 2.PCR試劑準備（試劑準備區）直接使用HBV-PCR反應管 3.加樣（樣品制備區）

往上述HBV反應管中用帶濾芯吸嘴分別加入待測樣本、陰性質控品、HBV 強陽性質控品、HBV臨界陽性質控品和陽性定量參考品的上清液各20μl。蓋緊管蓋，8000rpm離心數秒后轉移至擴增檢測區。

4.PCR擴增（擴增和產物分析區）5.結果分析

反應結束后自動保存結果，根據分析后的圖像調節baseline值得Start值、End值以及Threshold值，點擊Analysis自動獲取分析結果，在Repoet界面查看結果，記錄未知樣本數值（C）6.質量控制

(1)陰性質控品：FAM通道無對數增長期或Ct值等于30，VIC檢測通道擴增曲線為明顯對數增長期

(2)HBV陽性質控品：FAM通道有明顯的對數增長期且Ct值小于30(3)HBV陽性定量參考品：FAM通道有明顯的對數增長期，呈典型S形曲線。CT<29且R2>0.98 7.結果判斷（1）如果在FAM通道無明顯的對數增長期或Ct值等于30，在VIC檢測通道擴增曲線有對數增長期，則判定樣本的HBV DNA濃度小于檢測靈敏度。（2）如果在FAM通道有對數增長期或Ct值小于30 則1）若樣本的C<100，則樣本的HBV DNA濃度<100IU/ml 2）若樣本的100《C《5.00E+008，則樣本的HBV DNA濃度= C IU/ml 3）若樣本的C>5.00E+008，則樣本的HBV DNA濃度>5×10 ? IU/ml