第一篇：豬源TTV論文：豬源TTV ORF 熒光定量PCR 多克隆抗體

豬源TTV論文：豬源TTV轉錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測方法的建立

【中文摘要】TTV(Torque teno virus)屬于環病毒科指環病毒屬成員,為單股、環狀、負鏈的DNA病毒,正20面體對稱結構,無囊膜。人源TTV基因組大小約為3900bp,豬源TTV約2700bp。到目前為止,尚未發現豬源TTV與任何一種豬病有必然聯系,但是與一些豬病的發生有一定的相關性,如斷奶豬多系統衰竭綜合癥、豬皮炎腎炎綜合癥等,因此,研究豬源TTV對于預防其潛在的致病性有重要意義。

1、由于還沒有找到適合在體外培養TTV的細胞系,其基因組結構及復制轉錄機制尚不清楚。本研究利用本實驗室構建的含有TTV2基因組三種不同拷貝數的質粒pSK+1TTV2(含有1個TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+1.3TTV2(含有1.3個TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+2TTV2(含有2個TTV2基因組拷貝的pSK載體),將其轉染至張氏肝細胞,48小時后,提取總的RNA,用DpnI消化其中可能存在的DNA,然后利用預測的閱讀框ORF1、ORF2、ORF3的擴增引物,確證其中的DNA已經消除干凈。RNA經反轉錄后,用這三對引物擴增基因片段,經克隆和測序,結果發現:ORF1確實發生了轉錄,但轉錄產物并非O...【英文摘要】TTV(Torque teno virus), a small, non-enveloped virus, has a single-stranded circular DNA genome and is currently classified into the family Anelloviridae.Viral DNA of both porcine TTV species(TTV1 and TTV2)has a high

prevalence in both healthy ans diseased pigs worldwide and multiple infection of porcine TTV species with distinct genotypes or subtypes of the same species has been documented in China.Human TTV genome has 3900bp and porcine TTV 2700bp.So far, no porcine diseases have been found a reason...【關鍵詞】豬源TTV ORF 熒光定量PCR 多克隆抗體

【英文關鍵詞】porcine TTV ORF fluorescence quantitative PCR polyclonal antibody 【索購全文】聯系Q1：138113721 Q2：139938848 同時提供論文寫作一對一輔導和論文發表服務.保過包發

【目錄】豬源TTV轉錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測方法的建立摘要6-817-29

Abstract8-9

第一章 緒論

1.2 人TTV 的研

1.2.2 1.1 TTV 的發現及概況17-19究進展19-251.2.1 人TTV 流行情況的調查19人TTV 的分子生物學特征19-242

41.2.3 人TTV 的致病性

1.3 豬源TTV 研1.2.4 人TTV 感染的診斷24-25究現狀25-272

51.3.1 豬源TTV 的流行病學調查

1.3.3 豬源TTV 1.3.2 豬源TTV 的基因型25-26

26的分子生物學特征26-27

1.3.4 豬源TTV 的致病性

1.3.6 TTV 研究第二章 豬源TTV

2.1.1 質1.3.5 豬源TTV 的檢測方法

1.4 目的和意義的前景展望2727-29轉錄本的鑒定29-472.1 材料與方法29-37

粒、菌株和細胞2929-3030

2.1.2 試驗試劑和主要儀器設備2.1.3 CaCl_2 法制備大腸埃希氏菌DH5α感受態細胞2.1.4 陽性質粒轉化至DH5α感受態細胞30

312.1.6 陽性質粒的酶切鑒定

2.1.8 陽性質粒轉

2.1.5 小量制備陽性質粒312.1.7 大量制備陽性質粒31-33

33-3

42.1.9 提取總染至張氏肝細胞系RNA34-3535段362.1.10 總RNA 中殘余DNA 的檢測

2.1.12 PCR 擴增目的基因片

2.1.14 目的基因2.2.1 含TTV2 2.1.11 反轉錄35-362.1.13 PCR 產物的回收36-37

2.2 結果37-45片段的克隆與測序FJ2 基因組不同拷貝數的三種質粒的酶切鑒定結果37-382.2.2 含TTV2 FJ2 基因組不同拷貝數的三種質粒的大

2.2.3 總RNA 反轉錄后目的基因的擴增結

2.3 討論量抽提結果38-39果39-4145-4747-614747-48482.2.4 測序結果分析41-45第三章 豬源TTV2 ORF1 和ORF2 的多克隆抗體制備3.1 材料與方法47-543.1.2 試劑與儀器47

3.1.1 質粒、菌株與載體3.1.3 實驗動物3.1.4 TSS 法制備BL21(DE3)pLysS 感受態細胞3.1.5 ORF1 全長的體外表達48-49

3.1.6 ORF1 的3.1.7 B 細胞表位富集區和ORF2 全長的體外表達49-53ORF1a 和ORF2 的多克隆抗體的制備53-54ORF2 多克隆抗體的ELISA 效價測定54

3.1.8 ORF1a 和3.2 結果

54-593.2.1 ORF1 的抗原性分析結果54-553.2.2 ORF1a 和ORF2 基因的PCR 擴增5555-5656-5959

3.2.3 重組質粒的鑒定3.2.4 ORF1a 和ORF2 重組蛋白的表達與純化3.2.5 ORF1a 和ORF2 多克隆抗體的ELISA 效價測定3.3 討論59-61

第四章 豬源TTV 熒光定量PCR 檢4.1 材料與方法61-644.1.2 試劑和儀器61-62

4.1.1 病4.1.3 引物

4.1.5 測方法的建立61-69料與核酸樣品61和探針設計62陽性標準模板的制備63636464-65驗結果67結果67-6869-7081

4.1.4 病毒基因組DNA 的提取6262-63

4.1.6 標準曲線的繪制

4.1.8 敏感性試驗4.1.7 特異性試驗634.1.9 重復性試驗63-644.2 結果64-68

4.1.10 病料的的檢測

4.2.1 標準曲線的建立

4.2.3 敏感性試4.2.5 樣品檢測4.2.2 特異性試驗結果65-674.2.4 重復性試驗結果4.3 討論68-69參考文獻70-80

第五章 全文結論 致謝80-81

作者簡歷

第二篇：豬源長生態豬養殖經驗分享

看到快樂養豬有的人可能會說，我聽說過生態養豬，但是什么是快樂養豬呢?養豬還能 快樂嗎，其實，快樂養豬更多的是改變人們養豬的一種觀念和態度。

一、快樂養豬的關鍵點

快樂養豬的三個關鍵點是生態養豬、高效養豬和掌控市場，那么怎樣才能做到呢，下面 分別介紹一下。

(一)生態養豬

對于豬場是否做到了生態養豬就看豬場的獸醫一天工作幾個小時，如果一天工作十幾個 小時的話，就趕緊開除，而對于每天無所事事的獸醫則要趕緊漲工資，因為養殖場主要做的 就是讓豬群健康成長，而不是動物醫院。

作為豬場有的一個獸醫主要做到三個方面就可以了，一是要有理論知識和操作技巧，對 于平時的疾病感染和疫苗接種要做到位：第二就是要有科學的數據和報告，不能憑著感覺說 話。三是不能有自己的觀念只要執行即可，而不能擅作主張。

(二)高效養豬

要想能做到快樂養豬，高效養豬很關鍵，比如，目前，我國的母豬的生產能力都很低，外國一頭母豬能提供23.8頭仔豬，而我國大多是提供 11-12 頭仔豬，能提供 15-16 頭的就屬

于較好的，17-18頭那是絕對的優秀，生產性能這么差養豬虧本就是很正常的事情了，所以 要做到快樂養豬就要做到高效養豬。

(三)掌控市場

在這里想為大家講一個“老虎的故事”。有兩個人在森林里赤腳散步，有一個人隨身帶 著鞋子另一個人則沒有，突然有一只老虎從遠處沖了過來，帶了鞋子的人穿上鞋子跑的更快，他的朋友對她說“別穿了，你穿上鞋就能跑過老虎?”!正在穿鞋子的人說能不能跑得過老虎 并不重要，重要的是能夠跑得過你!”

其實養豬也是一樣，打比方說，如果豬價上漲是別人的豬都生病死掉，你的豬只要存活 就能買的好價錢，所以說我們大家養豬你不要養到最好，只要能比你周圍的人養得好就行了。

那怎樣才能比別人養得好、虧得少呢，有兩個方法：

一是節流，即降低工資標準或獎金或使用便宜的產品如飼料、疫苗，但是我需要說明的 是小節約=大浪費。有一個搞房地產的老板改行去養豬了，他就問我，我怎樣才可以降低成 本呢，喂點便宜的飼料，用的便宜的疫苗可不可以，后來我就問他，你以前搞地產的時候怎 么節流呀，是不是把粗的鋼筋換成細的，他說，那可不行，那是要出人命的。其實養豬也一樣，錢是省不了的。

二是開源，越是在行情差的時候，越是要漲工資，以提高大家的生產積極性，從而達到 提高生產性的目的，如 7 日齡、20 日齡時仔豬受環境污染，很容易發生腹瀉性疾病，而且 一旦發生就很難控制，但是仔豬的蹋腹瀉病控制好了，斷奶時體重增加0.5千克，出術加5 千克，也就是說經濟效益能夠增加10 倍。

仔豬出現腹瀉時，其實前 2 天天就已經有了炎癥，這時可能只;只有一些細微的變化，一旦發病后，要 2 天以后才能修復，結果就是本來體重會增加 1 千克，結果反而減少 0.25 千克。

如果豬場技術人員能夠提前發現病情，那么按 1窩豬 10頭來計算，每頭豬斷奶時體重 能增加 1.25 千克，出欄時每頭豬就能增加 12.5 千克，2 窩豬(20 頭)就，就可以增(增加加250

千克，如果以當前的行情按每千克 12 元來計算的話，那么 250 x 12=3000 元，養這兩欄豬

就可以增加3000元的效益。如果能做到這一點的話，雖然你不能掌控市場的價格，但你可 以做到比別人少賠錢，或比別人多掙錢。

二、實現快樂養豬的方法

(一)努力學習科學養豬技術

應用科學技術是第一生產生產力，學精通的目的就在于應用，一定要活到老，學到老，而且還要用到老。

(二)建立正確的觀念

1.表面的節約往往是透支未來

永遠不要在節約上面做文章，節約往往會透支未來。

2.敢于應用新技術和新產品

新產品只有最先使用者才能額外受益，因為產品價格=該產品的平均社會成本(使用普通 方法產生的成本)+該產品的平均社會利潤，產品的平均社會成本是可以變化的，比如，養一 頭豬的利潤是150元，目前使用普通方法養一頭豬的成本，也就是平均社會成本是800元。那么豬這個產品的價格就是 800+150=950 元，如果這時你采用熱水豬的話成本可以降低為 700元，也就等于你比別人多盈利100元;

但是隨著大家對一種新事物的熟知，如果大家都采用 1水養豬的話，那么養豬的平均社 會成本就變為 700元，么這時的產品價格就是 700+150=850元，所以對新

產品的使用，受益的往往是最先使用者。

3.效果不好的才是最貴的有人買東西總是衡量價格的貴賤，其實效果不好的產品才是最貴的，比如有人送給你一

噸消毒劑(其實就是水)，你回去后拿去消毒，因為產品本身不好，所以就起不應有的效果，這時候可不僅僅是沒花錢，有可能損失的是50 萬，所以說效果不好的才是最貴的。

(三)改變態度

要想做到快樂養豬就要改變態度，怎樣改變態度呢?那就是把豬當人待，比如，母豬的產房有沒有問題，就自己去睡一晚上，這時候豬舍的空氣質量、溫度、濕度是否合適，就都 明白了。

1.把仔豬當兒女

給仔豬喝溫水豬是恒溫動物，所有的豬都應隨時隨喝到溫水，最適合的水溫就是豬的體 溫，水溫過高或過都會對豬產生負面影響，斷奶后喝冷水，會帶來嚴重后果，打個比方說，誰會給自己家的小孩子喝冷水，其實對豬是一樣，一旦喝冷水，就會對仔豬產生不利影響，主要有下幾個方面：

產生冷應激，使免疫力下降，抵抗力差，豬只易生病;

冷水刺激胃腸，還會引起腹瀉甚至脫水;

因冷水的口感差，可使小豬減少飲水量，從而影響采食量，直接影響生長速度;

飲用冷水還會用飼料提供的熱能把冷水加熱到體溫(40℃左右)，從而消耗大量飼料，降 低經濟效益。

給保育豬喝溫水，可使仔豬精神狀態好，很少生病，成活率顯著提高，日增重明顯提高，料肉比顯著降低。

為小豬提供最適生長溫度 因為豬是恒溫動物，只有在適宜的溫度條件下才能正常生長、發育，充分發揮其生產潛力，達到多成活、快生長、多增重、少耗料、增產增效的目的。低溫會使仔豬成活率低，生長發育慢，飼料利用率低、健康狀況差，容易發生疾病，因 此，做好保溫很關鍵。

保溫應解決好三個方面的問題：一是滿足仔豬不同階段對溫度的不同要求;二是保持恒 定溫度;三是要二次加溫，解決方案是利用微電腦技術或全自動恒溫地暖系統。

仔豬創造干燥的環境仔豬環境的衛生指標有兩個，分別為干凈和干燥，因為病原增殖的 四大條件分別是空氣(氧氣)、營養(有機物)、溫度和濕度，所以創造干凈和干燥的環境條件 即有利于減少病原的增殖。

2.把母豬當老婆待確保母豬健康母豬健康的標準是什么?就是能吃、能睡、排泄好、皮膚紅潤有彈性，皮

毛有光澤，沒有生殖系統炎癥。

疫抑制的重要原因是什么?主要有以下三個方面：

第一，免疫抑制性疾病普遍存在，如藍耳病病毒、圓環毒會直接破壞免疫系統，目前越 來越多的學者認為豬瘟、支原體和豬流感也是免疫抑制性疾病;

第二，霉菌毒素會干擾免疫系統;

第三，濫用抗生素破壞機體抵抗力、形成耐藥菌株、破體微生態平衡。目前很多豬場用 抗生素來做保健，要知道在人的保健品中沒有一個是抗生素，抗生素是用來治病的，不到萬 不得已是不能用的，目前由于抗生素的大量應用使豬的肝腎嚴重受損，從而使機體產生免疫 抑制，抵抗力下降，容易被大量病毒感染，從而繼發細菌性疾病，造成嚴重的損失，而出現 這種發病情況后，又不得不大量使抗生素，從而使養豬業形成惡性循環。

解決措施就是解除母豬的免疫抑制、修復受損的免疫系統，提升母豬自身的抵抗力，方 案是實施真正意義上的保健，逐漸減少直至徹底取消抗生素的使用。

控制便秘，便秘是健康的殺手，它直接導致毒素在體內的蓄積，進而給機體帶來一系列 的嚴重危害，同時還會害母豬健康、使毒素危害胎兒、造成子宮炎癥和難產、引起產后泌乳 綜合征、仔豬頻繁下痢。

便秘的主要原因有飲水不足、膳食纖維不足、長期大量投喂抗生素、某些營養元素嚴重 不足、運動量不夠。

對于便秘的解決方案可以補充纖維素，補充青綠飼料，每天以 1-2 千克為宜，可適當調 高纖維素含量較高的料的比例，如麥麩等;使用復合微生態制劑對便秘有一定的改善;也可以 飼喂無機鹽類制劑，如人工鹽及其衍生物。

第三篇：豬細小病毒論文：豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應用

豬細小病毒論文：豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應用

【中文摘要】豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是當前影響養豬業發展的3種重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2單獨感染或混合感染均能引起豬發病,造成母豬的繁殖障礙或(和)感染豬的免疫抑制,為其他病原的繼發感染提供了便利,甚至會造成豬群中疫病的流行,使養殖效益蒙受損失。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特異等優點,自發明以來在病原的特異性檢測方面表現出明顯的優勢,在動物疫病診斷和病原檢測上也得到廣泛地應用,對疫病防控起到了重要的作用。由于當前養豬業中豬群中多種病原混合感染病例的增多,單一病原PCR檢測方法也表現出自身的不足,需要對一種病料進行多次PCR檢測,使得檢測時間延長,耗費人力,成本也高。多重PCR不僅保持了普通PCR敏感性高和特異性強的優點,而且還具有一個PCR反應就同時檢測多種病原,具有簡便、快捷、靈敏等優點,能滿足生產上同時對多種疾病進行快速診斷的要求。本研究基于前期對陜西省部分養殖企業豬群中病毒性病原的調查檢測,發現常有PPV、PRV和PCV-2的單純或混合感染,為此我們擬建立PPV、PRV和PCV-2檢測的多重PCR方法,以期為生產中這3種病原的快速檢測提供可用方法。本研究獲得了以下結果:(1)根據GenBank中已經發表的PPV、PRV和PCV-

2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0軟件,針對病毒的保守性基因序列,分別設計了檢測引物,通過對引物濃度、退火溫度、PCR組分等條件的優化建立起鑒別PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性試驗表明,PRV、PCV-2在多重PCR反應中的敏感性到達pg級,而PRV在多重PCR反應中的敏感性少了一個數量級,其最低檢測量也達到了10pg級。以PCV-

1、牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、大腸埃希菌、PPV、PRV、PCV-2為模板分別進行多重PCR檢測,結果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及單個病毒的PCR均擴增出各自的特異性條帶。(2)用建立的方法對采自陜西省部分豬場的286份病料及血樣進行病毒檢測,從臨床健康豬全血樣品中PPV、PRV和PCV-2的檢測結果來看,PCV-2在正常豬群中有一定比例的存在,同時在個別豬場也存在PRV和PCV-2雙重感染的現象;從臨床患病豬病料中進行檢測發現,PRV和PCV-2混合感染較嚴重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染發生;多重PCR檢測結果與單項PCR檢測結果的符合率達99%以上,說明建立的多重PCR檢測方法可用于臨床樣品的檢測,為這3種疫病的診斷提供依據。

【英文摘要】Porcine parvovirus , porcine pseudorabies and porcine circovirus are three main threat to the development of swine-breeding industry.Beacause sigle or mixed infection of the three virus both can cause diseases which can give rise to reproductive failure or(and)immunosuppression, it provides a convenient chance for secondary infection by other pathogens

and enven causes epidemic diseases in pigs wich can lead to tremendous economic losses ,and may arise public health problems.PCR with rapid,specific and sensitive advantages exhibits obvious preponderance in specificit detection of infectious agents in animals since it was invent.And it is applied widely in animal disease diagnosis and pathogen detection which has made important contributions to disease prevention and control.At present,the cases of mixed infection of pathogen are increasing,and common分子molecular detection of pathogen has show its own shortage of time consuming ,high cost and labour power when we need detect one specimen repeatedly.Mutiplex PCR not only preserve advantages of routine PCR,but also owns advantages of convenience shortcut and sensitiveness which meet the need of fast diagonosis for multiple diseases in production.We found that sigle or mixed infection of PPV、PRV and PCV-2 is common in the course for the survey of viral pathogen in some breeding enterprises in this research.So we plan to establish the mutiplex PCR for detection of PPV、PRV and PCV-2,in purpose for providing fast detection of the three pathogens an available method.(1)Specific primers for DNA viruses, namely, porcine parvovirus(PPV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2

(PCV-2),were synthesized according to the published virus conserved gene sequence of PPV, PRV and PCV-2 in GenBank and used by DNAStar and Oligo 6.0 software.We establish a mutiplex PCR method for the detection of PPV, PRV and PCV-2 by optimizing concentration of primers,annealing temperature and component of PCR.Sensibility test shows that the susceptibility of PRV and PCV-2 reach the level of pg.With PCV-1, bovine viral diarrhea virus, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, Escherichia coli, PPV, PRV, PCV-2 as a template for multiple PCR were detected,the results show that the only PPV, PRV and PCV-2 virus in a single or multiplex PCR were amplified by their specific band.(2)The blood samples collected from 286 pig farms in Shaanxi Province were viral detection by this method.Clinically healthy pigs from a blood sample PPV, PRV and PCV-2 test results indict that PCV-2 in normal pigs have a certain percentage of presence, meanwhile several farms also exist the phenomenon of the PRV and PCV-2 dual infection.Swine from the clinical illness were detected compound, It was serous of PRV+PCV-2 combined infection in diseased pigs,and PPV+PRV+PCV-2 combined infection also were detected in diseased pigs.The coincidence

rate of multiplex PCR test and single PCR test is more than 99%, illutstrating that The developed novel multiplex PCR will be a tool used for the detection of clinical samples for diagnosis reference.【關鍵詞】豬細小病毒 偽狂犬病病毒 豬圓環病毒2型 多重PCR 【英文關鍵詞】Porcine parvovirus(PPV)Pseudorabies virus(PRV)Porcine circovirus type 2 multiplex PCR(mPCR)【目錄】豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應用綜述12-

31摘要6-8

ABSTRACT8-9

文獻

第一章 豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環病毒

12-26

1.1 豬細小病毒

1.1.2 豬細小病毒的特性

1.1.4 PPV

1.2.1 2型檢測方法研究進展12-1913-141.1.1 概述12-131.1.3 豬細小病毒病流行情況14-1

51.2 偽狂犬病病毒19-22的檢測方法研究15-19概述191.2.2 偽狂犬病病毒的特性19-20

1.2.4 偽狂犬病病毒檢測方法

1.3.1 概述

1.2.3 偽狂犬病流行情況2020-2222-231.3 豬圓環病毒22-261.3.2 豬圓環病毒的特性231.3.3 豬圓環病毒檢測方法23-26檢測上的應用26-31PCR 技術26

第二章 聚合酶鏈反應(PCR)技術在動物病原

2.1 PCR 技術概述26-27

2.1.1 2.2 主要的2.1.2 PCR 技術的發展26-27

PCR 技術27-31PCR(nested PCR)

2.2.1 常規PCR272.2.2 套式

2.2.4 反

2.2.3 二溫式PCR27-28轉錄PCR(RT PCR)2828

2.2.5 反轉錄一復合套式聚合酶鏈反應

2.2.7 競爭PCR(compete

2.2.9 定量2.2.11 多

第三章 2.2.6 反向PCR28PCR)28-29PCR29

2.2.8 標記PCR(LP-PCR)292.2.10 玻片PCR(Slide-PCR29-30

31試驗研究31-45重PCR(Multiplex PCR)豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環病毒2 型 PCR 檢測方法的建立31-38313232-333.1 材料與方法31-3

33.1.1 主要試劑

3.1.3 引物設計3.1.5 PCR 反應33

3.1.7 PCR 產物3.1.2 毒株、菌株和細胞31-323.1.4 病毒DNA 的提取323.1.6 PCR 反應條件的優化的測序分析333333-343434-3636

3.1.8 PCR 反應的敏感性和特異性分析

3.2.1 最佳PCR 退火溫度的確定3.2 結果33-363.2.2 PCR 反應最佳引物體濃度的確定3.2.3 PCR 產物的鑒定3

43.2.4 PCR 反應的敏感性3.2.5 PCR 反應的特異性試驗和重復性試驗3.3 討論36-38

第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR

38-4

54.1 材料與方法檢測方法的建立與臨床樣品檢測分析38-39384.1.1 主要試劑38

4.1.2 毒株、菌株、細胞38

4.1.4 多重PCR

4.2 結果4.1.3 臨床樣品及病料的采集反應條件的優化384.1.5 樣品檢測38-39

39-424.2.1 兩重PCR 反應條件的優化39-40

4.2.3 樣品檢測41-42

參考文獻46-56

4.2.2 4.3 討致謝多重PCR 的建立40-41論42-4556-57結論

45-46作者簡介57