第一篇：基因工程藥物論文

基因工程藥物

姓名：陳劍云 學(xué)號：U201210914 班級：機械學(xué)院測控1204班

摘要：自１９７２年ＤＮＡ重組技術(shù)誕生以來，生命科學(xué)進入了一個嶄新的發(fā)展時期。１９８２年美國禮萊公司推出基因工程胰島素，這是第一個人用基因工程藥物。從那時起，以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)已應(yīng)用到農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、環(huán)境等各個領(lǐng)域。基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展不僅使醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)生了革命性的變化，也為醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展開辟了廣闊的前景，以ＤＮＡ重組技術(shù)為基礎(chǔ)的基因工程技術(shù)改造和替代傳統(tǒng)醫(yī)藥工業(yè)技術(shù)，已成為重要的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：基因工程制藥應(yīng)用

基因的定義：基因是脫氧核糖核酸（DNA）分子上的一個特定片段。不同基因的遺傳信息，存在于各自片段上的堿基排列順序之中。基因通過轉(zhuǎn)錄出的信使使核糖核酸（mRNA），指導(dǎo)合成特定的蛋白質(zhì)，使基因得以表達。

基因工程定義：基因工程又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因(DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。基因工程藥物定義:基因工程藥物又稱生物技術(shù)藥物,是根據(jù)人們的愿望設(shè)計的基因,在體外剪切組合,并和載體DNA 連接,然后將載體導(dǎo)入靶細胞(微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞),使目的基因在靶細胞中得到表達,最后將表達的目的蛋白質(zhì)純化及做成制劑,從而成為蛋白類藥或疫苗。

基因工程藥物的發(fā)展歷程：自1972年DNA重組技術(shù)誕生以來,作為現(xiàn)代生物技術(shù)核心的基因工程技術(shù)得到飛速的發(fā)展。1982年美國Lilly公司首先將重組胰島素投放市場,標志著世界第一個基因工程藥物的誕生。美國是現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)的發(fā)源地,也是率先應(yīng)用基因工程藥物的國家,其基因工程技術(shù)研究開發(fā)以及產(chǎn)業(yè)化居于世界領(lǐng)先地位。美國已擁有世界上一半的生物技術(shù)公司和一半的生物技術(shù)專利。據(jù)1998年美國藥學(xué)會統(tǒng)計,美國FDA已批準了56種生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品上市,其中絕大多數(shù)為基因工程藥物。此外,還有200多種基因工程藥物正在進行臨床試驗,其中至少有1/5的產(chǎn)品將可能在今后10年內(nèi)上市。基因工程藥物為美國的一些公司創(chuàng)造了豐厚的回報,取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。歐洲在發(fā)展基因工程藥物方面也進展較快,英、法、德、俄等國在開發(fā)研制和生產(chǎn)基因工程藥物方面成績斐然,在生命科學(xué)技術(shù)與產(chǎn)業(yè)的某些領(lǐng)域甚至趕上并超過了美國。我國基因工程藥物的研究和開發(fā)起步較晚,直至20世紀70年代初才開始將DNA重組技術(shù)應(yīng)用到醫(yī)學(xué)上,但在國家產(chǎn)業(yè)政策的大力支持下,這一領(lǐng)域發(fā)展迅速,逐步縮短了與先進國家的差距。1989年我國批準了第一個在我國生產(chǎn)的基因工程藥物———重組人干擾素重組人干擾素αIb,標志著我國生產(chǎn)的基因工程藥物實現(xiàn)了零的突破。重組人干擾素αIb是世界上第一個采用基因克隆和表達的基因工程藥物,也是到目前為止唯一的一個我國自主研制成功的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程一類新藥。從此以后,我國基因工程制藥產(chǎn)業(yè)從無到有,不斷發(fā)展壯大。截止1998年底,我國已批準上市的基因工程藥物和疫苗產(chǎn)品共計15種，國內(nèi)已有30余家生物制藥企業(yè)取得基因工程藥物或疫苗試生產(chǎn)或正式生產(chǎn)批準文號。至2000年,我國已有200多家生物技術(shù)公司,有20多家生產(chǎn)銷售人干擾素、白細胞介素、乙肝疫苗等12種基因工程藥物。

基因工程藥物的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，生產(chǎn)基因工程藥物的方法是：將目的基因連接在載體上，然后將導(dǎo)入靶細胞（微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞），使目的基因在靶細胞中的到表達，最后將表達的目的蛋白質(zhì)提純做成制劑，從而成為蛋白類藥或疫苗。若目的基因直接在人體組織靶細胞表達，就稱為基因治療。

基因治療：基因治療就是從遺傳物質(zhì)本身，即基因入手，不必產(chǎn)生或純化基因的最終產(chǎn)物，而是將基因，通常是通過一個載體直接導(dǎo)入人體，再利用人體自身就具有的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯功能來產(chǎn)生這些產(chǎn)物，達到補充正常基因產(chǎn)物或?qū)巩惓；虻哪康摹⒒驅(qū)氩溉轭悇游锛毎姆椒ㄓ袃煞N，一類是理化方法，一類是病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點在于：大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性物質(zhì)和多肽；挖掘更多的生理活性物質(zhì)和多肽；改造內(nèi)源生理活性物質(zhì)；可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。

基因藥物的發(fā)展前景

與傳統(tǒng)制藥相比，生物制藥有便于大規(guī)模生產(chǎn)、利潤高、生產(chǎn)工藝簡單、人力投入少、無污染、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，因此，隨著人類基因組計劃的實施和科技水平的進一步發(fā)展，基因藥物在醫(yī)藥市場的比例也將會日益提升，也將越來越影響人類的生活。

基因藥物同時具有高投入、高收益、高風(fēng)險、長周期的特征。Frost&Sullivan公司的一份最新報告指出，2004年，全球生物制藥市場的收入為450億美元。到2011年，其有望達到982億美元。據(jù)預(yù)測，全球第一個用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的生物藥物可望于2005～2006年上市。隨著公眾認知度的提高和相關(guān)法規(guī)的逐步完善，用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)生物藥物的市場將飛速增長，到2011年，單美國市場就將達到22億美元。2002年底到2003年5月間一場突如其來的SARS疫情，再加上2005年度禽流感病毒傳播，席卷了亞洲及加拿大等地。在緊張而又嚴肅的應(yīng)對這場疫情的過程中，生物制藥又成為醫(yī)藥行業(yè)人士關(guān)注的焦點。

我國生物制品需求巨大，過去的幾年我國企業(yè)一直能保持年均15％以上增幅，并且近年來銷售的增長速度有加快的趨勢。據(jù)統(tǒng)計，2005年國內(nèi)生物制品銷售收入總額為157．4億元人民幣，銷售利潤總額為38.7億元人民幣。預(yù)計到2006年生物技術(shù)工業(yè)總產(chǎn)值將達400億到500億元，到2015年總產(chǎn)值可達1100億到1300億元。我國的生物制藥業(yè)將進入一個快速發(fā)展的階段,生物醫(yī)藥工業(yè)將成為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)增長最快的部分。目前,我國許多省市已將生物制藥作為本地的支柱產(chǎn)業(yè)重點扶持。一大批生物醫(yī)藥科技園相繼在各地高新技術(shù)開發(fā)區(qū)建成。面對入世帶給我國生物制藥業(yè)的挑戰(zhàn)和機遇,專家們預(yù)測,在未來若干年,我國的生物制藥業(yè)將以超過全球平均增長速度步入高速發(fā)展軌道,前景十分廣闊。

基因工程藥物的發(fā)展概況

20世紀70年代，隨著DNA重組技術(shù)的成熟，誕生了基因工程藥物，高產(chǎn)值、高效率的基因藥物給醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)帶來了一場革命，推動了整個醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)進入了新的歷史時期。基因藥物經(jīng)歷了三個階段：第一階段是把藥用蛋白基因?qū)氲酱竽c桿菌等細菌中，通過大腸桿菌等表達藥用蛋白但這類藥物往往有缺陷，人類的基因在低等生物的細菌中往往不表達或表達的蛋白沒有生物活性。第二階段是人們用哺動物的細胞代替細菌，生產(chǎn)第二代基因工程藥物。第三階段是到了80年代中期，隨著基因重組和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，科學(xué)家可以將人們所需要的藥用蛋白基因?qū)氲讲溉閯游矬w內(nèi)，使目的基因在哺乳動物身上表達，從而獲得藥用蛋白。

基因工程技術(shù)制藥展望

基因工程技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用非常廣泛，利用基因工程技術(shù)開發(fā)藥物已成為當前.最為活躍和迅猛發(fā)展的領(lǐng)域。隨著人類基因組計劃的完成，以及基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等研究的深入，為醫(yī)藥生物技術(shù)開拓了一個新的領(lǐng)域，基因工程制藥將有更多機會獲得突破性進展，為保障人類健康做出更大的貢獻。

參考文獻：

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第二篇：基因工程藥物教學(xué)大綱（范文）

基因工程藥物教學(xué)大綱

課程名稱：基因工程藥物

課程編號：0235203 學(xué)分：1.5 學(xué)時數(shù)：28

考核方式：N+2。筆記10%，考試成績占40%，過程成績N占50%。先修課程：生物化學(xué)、微生物學(xué)、基因工程等。課程說明：專業(yè)選修課。

一、課程的性質(zhì)

基因工程技術(shù), 不僅使整個生命科學(xué)的研究發(fā)生了前所未有的深刻變化, 而且也給工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟發(fā)展帶來了巨大的經(jīng)濟和社會效益, 給人類進步帶來了新的契機。目前，基因工程學(xué)正以新的勢頭繼續(xù)向前迅猛發(fā)展, 成為當今生物科學(xué)研究諸領(lǐng)域中最具生命力、最引人注目的前沿學(xué)科之一, 特別是基因工程在醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用，其意義深遠、潛力之巨大。

二、課程的目的與教學(xué)基本要求

課程目的：為了適應(yīng)生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展、拓寬專業(yè)面, 為了使學(xué)生對當今世界生物工程領(lǐng)域日新月異地發(fā)展的高新技術(shù)有更多的了解, 進一步擴大學(xué)生的知識面和視野，同時為他們今后從事這方面的工作和研究打下一定理論基礎(chǔ), 特開設(shè)該課程。

課程任務(wù): 通過講授基因工程制藥的概貌及國內(nèi)外研究進展、基因工程制藥常用的工具酶和克隆載體、基因工程藥物無性繁殖系的組建以及基因工程藥物的生產(chǎn)和質(zhì)量控制等, 使學(xué)生對基因工程的基本理論、基本步驟和操作技術(shù)以及基因工程藥物的生產(chǎn)技術(shù)原理和方法有比較系統(tǒng)的了解, 初步掌握基因工程制藥有關(guān)基本知識。

三、課程適用專業(yè)

本課程適用于生物技術(shù)專業(yè)等相關(guān)專業(yè)。

四、教學(xué)內(nèi)容、要求與學(xué)時分配

第一章 基因工程制藥概述(2學(xué)時)

第一節(jié)：基因工程的概貌 簡述基因工程的誕生和興起，基因工程的定義、特點與基本步驟，基因工程早期的開創(chuàng)性研究成就，基因工程的應(yīng)用與發(fā)展趨勢等。

第二節(jié)：基因工程與生物制藥 簡述基因工程藥物的研究和發(fā)展概況，介紹應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究開發(fā)的幾種新型基工藥物。

第二章 基因工程制藥常用的工具酶(2學(xué)時)

第一節(jié)：限制性核酸內(nèi)切酶 簡述限制酶的發(fā)現(xiàn)、限制酶的種類、限制酶的命名和限制酶的特性與用途等。

第二節(jié) DNA連接酶 重點介紹DNA連接酶連接作用的特點，基因工程中常用的連接酶(T4噬菌體DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶)的酶活性和用途，DNA連接酶連接作用的分子機理。

第三節(jié) DNA聚合酶 重點介紹大腸桿菌DNA聚合酶

1、Klenow大片段酶、T4噬菌體DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及、反轉(zhuǎn)錄酶等的酶活性和用途。

第四節(jié) DNA修飾酶 重點介紹末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、T4噬菌體多核苷酸激酶等的酶活性和用途。

第五節(jié) 單鏈核酸內(nèi)切酶 重點介紹S1核酸酶、Bal31核酸酶等的酶活性和用途。

第三章 基因工程制藥常用的克隆載體(4學(xué)時)第一節(jié) 質(zhì)粒載體 內(nèi)容：質(zhì)粒的定義、質(zhì)粒DNA分子的特性、質(zhì)粒載體的改造及構(gòu)建。重點介紹基因工程制藥中常用的幾種質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)和用途，主要包括pBR322及其衍生栽體、pUC系列載體。

第二節(jié) λ噬菌體載休 內(nèi)容：λ噬菌體的基本特性、λ噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)與功能、λ噬菌體DNA的改造及其載體的構(gòu)建。重點介紹基因工程制藥中常用的幾種λ噬菌體載體，主要包括 Charon系列載體、EMBL系列載體、λgt系列載體。

第三節(jié) M13噬菌體載體 內(nèi)容包括：M13噬菌體的基本特性、M13絲狀噬菌體載體的構(gòu)建、常用的M13噬菌體載體，主要包括M13mp18和M13mp19載體。

第四節(jié) 粘粒（Cosmid）載體 內(nèi)容：粘粒載體的構(gòu)建、常用的粘粒載體。

第五節(jié) 哺乳動物細胞載體系統(tǒng) 主要介紹：SV40載體、BPV載體、EBV病毒載體。

第四章 目的基因的制取(2學(xué)時)

第一節(jié) 目的基因的化學(xué)合成 內(nèi)容：目的基因的設(shè)計, 寡聚核苷酸片段的合成, 寡核苷酸片段的分離和純化, 用寡核苷酸片段組裝目的基因, 化學(xué)合成寡核苷酸的其它用途。

第二節(jié) 構(gòu)建基因文庫法分離目的基因 內(nèi)容：構(gòu)建基因文庫法分離目的基因的基本步驟, 真核基因組DNA文庫的構(gòu)建過程

第三節(jié) 酶促合成法制取目的基因 內(nèi)容：真核生揚細胞中的mRNA, 從構(gòu)建 的cDNA文庫中篩選目的cDNA, RT-PCR法合成目的cDNA。

第五章 目的基因與克隆載體的體外重組(2學(xué)時)

第一節(jié) 目的基因與質(zhì)粒載體的連接 內(nèi)容：粘性末端連接法, 定向克隆法,平末端連接法, 同聚物加尾法, 加人工接頭連接法, 加DNA銜接物連接法, 其它轉(zhuǎn)換末端形式連接法。

第二節(jié) 目的基因與噬菌體載體的連接 內(nèi)容包括：噬菌體載體臂DNA的制備, 噬菌體載體臂與外源目的DNA片段的連接。

第六章 重組克隆載體引入受體細胞(2學(xué)時)

第一節(jié) 概述 內(nèi)容：基因工程的受體細胞, 重組體分子導(dǎo)入受體細胞的途徑。

第二節(jié) 重組體DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 內(nèi)容包括：用氯化鈣制備新鮮的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法, 用復(fù)合劑制備感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法, 高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法。

第三節(jié) 重組噬菌體DNA的體外包裝與轉(zhuǎn)染 內(nèi)容：噬菌體體外包裝的基本原理, 噬菌體DNA的體外包裝, 包裝提取物的制備, 重組DNA的體外包裝與感染方法。

第四節(jié) 重組克隆載體導(dǎo)入哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染

第七章 含目的基因重組體的篩選、鑒定與分析(6學(xué)時)

第一節(jié) 重組體(菌)的篩選 內(nèi)容：抗生素抗性基因插入失活法, b-半乳糖苷酶 基因插入失活法, 快速細胞破碎與凝膠電泳篩選法, 放射性標記核酸探針雜交篩選法, 免疫化學(xué)篩選法。

第二節(jié) 重組體的鑒定 內(nèi)容：酶切及凝膠電泳鑒定法, Southern印跡雜交法, 電鏡R-環(huán)檢測法, 基因產(chǎn)物鑒定法。

第三節(jié) 重組DNA的序列分析 內(nèi)容：Sanger雙脫氧鏈終止法DNA測序, Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法DNA測序。

第八章 目的基因在宿主細胞中的表達(2學(xué)時)

第一節(jié) 外源目的基因在原核細胞中的表達 內(nèi)容：原核基因表達載體的構(gòu)建, 常見的原核細胞表達載體系統(tǒng), 外源目的基因在原核細胞中的表達形式, 在原核細胞中高效表達目的基因, 基因定點誘變技術(shù)。

第二節(jié) 外源目的基因在真核細胞中的表達 內(nèi)容：真核細胞表達載體的功能元件, 酵母菌表達系統(tǒng), 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。

第九章 基因工程無性繁殖系的組建(2學(xué)時)

內(nèi)容：人胰島素原融合蛋白重組菌的組建, 人a2b型干擾素工程菌的組建, 集落刺激因子工程菌的組建, 白細胞介素融合蛋白工程菌的組建, 乙型肝炎表面抗原重組酵母的組建, 人組織型纖溶酶原激活劑細胞株的組建, 紅細胞生成素CHO細胞株的組建, 人腫瘤壞死因子昆蟲細胞株的組建。

第十章 基因工程藥物的生產(chǎn)(2學(xué)時)

第一節(jié) 基因工程菌（細胞）的培養(yǎng)與發(fā)酵 內(nèi)容包括：工程細菌的培養(yǎng)與發(fā)酵, 工程酵母的培養(yǎng)與發(fā)酵, 工程細胞的培養(yǎng)與發(fā)酵。

第二節(jié) 基因工程藥物的分離純化 內(nèi)容包括：影響分離純化工藝的主要因素, 各種產(chǎn)物表達形式采用的分離純化方法,。

第三節(jié) 基因工程藥物的分離純化實例 內(nèi)容包括：以包涵體形式表達的rGM-CSF中試分離純化, 以分泌型表達的人a1-干擾素的分離純化, 以可溶性形式表達的rhG-CSF的分離純化, 在酵母中表達的HBsAg的分離純化。

第十一章 基因工程藥物的檢驗(學(xué)生自學(xué))

第一節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制 內(nèi)容包括：主要的基因工程藥物, 基因工程藥物的特點, 基因工程藥物的質(zhì)量要求, 基因工程藥物的質(zhì)控要點, 基因工程藥物的制造及檢定規(guī)程。

第二節(jié) 基因工程藥物常用的檢驗方法 內(nèi)容：化學(xué)檢定法, 肽圖分析法，外源性DNA殘留量的測定，宿主細胞蛋白雜質(zhì)的檢測，無菌試驗，內(nèi)毒素試驗，異常毒性試驗，熱原質(zhì)試驗，生物學(xué)活性(效價)檢定。

第三節(jié) 主要基因工程藥物的檢驗 內(nèi)容：重組人胰島素的檢驗，重組人生長激素的檢驗，重組人干擾素的檢驗，重組人白細胞介素的檢驗，重組人紅細胞生成素的檢驗，重組人集落刺激因子的檢驗，重組人組織型纖溶酶原激活劑的檢驗, 重組人腫瘤壞死因子的檢驗，重組乙型肝炎疫苗的檢驗。

五、教材和主要參考資料

理論教學(xué)教材： 《基因工程》, 楊汝德主編，華南理工大學(xué)出版社，2006.8 主要參考教材： 《基因克隆技術(shù)在制藥中的應(yīng)用》, 楊汝德主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2004.1

執(zhí)筆人：闞勁松

教研室：

系主任審核簽名：

第三篇：基因工程藥物開發(fā)利用前景

基因工程藥物開發(fā)利用前景

摘 要：生物制藥是以基因工程為基礎(chǔ)的現(xiàn)代生物工程，即利用現(xiàn)代生物技術(shù)對DNA進行切割、連接、改造，生產(chǎn)出傳統(tǒng)制藥技術(shù)難以獲得的生物藥品。而現(xiàn)代生物技術(shù)是以基因為源頭，基因工程和基因組工程為主導(dǎo)技術(shù)，與其他高技術(shù)相互交叉、滲透的高新技術(shù)。比爾·蓋茨預(yù)言：下一個首富可能是從事生物技術(shù)的投資者。本文簡要分析了國內(nèi)外基因工程藥物開發(fā)的現(xiàn)狀和前景。

以基因工程，細胞工程，發(fā)酵工程和酶工程為主體的現(xiàn)代生物技術(shù)是70年代開始異軍突起的高新技術(shù)領(lǐng)域，近一，二十年來發(fā)展極為神速，它與微電子技術(shù)，新材料和新能源技術(shù)并列為影響未來國計民生的四大科學(xué)技術(shù)支柱，被認為是21世紀世界科學(xué)技術(shù)的核心。現(xiàn)代生物技術(shù)又是一項與醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)結(jié)合極為密切的高新技術(shù)，它的發(fā)展已帶給了某些醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科的革命性變化，并給醫(yī)藥工業(yè)開辟了更為廣闊的心領(lǐng)域。

自1982年全世界第一個基因重組醫(yī)藥產(chǎn)品“人胰島素”在美國面市以來，至今已有數(shù)十個生物技術(shù)藥物上市。現(xiàn)代生物技術(shù)開辟了人體內(nèi)源性多肽，蛋白質(zhì)藥物的新天地。于此同時它也正滲透到傳統(tǒng)醫(yī)藥的哥哥領(lǐng)域，以抗生素，氨基酸，細胞融合及基因工程菌，化學(xué)合成藥物的生物轉(zhuǎn)化性，到單克隆抗體靶向制劑等等。不久之前美國的Eli Lilly公司又提出了生物技術(shù)在醫(yī)藥上的更大應(yīng)用，是在新藥研究篩選方法上的革命，即用基因工程受體實驗代替?zhèn)鹘y(tǒng)的動物實驗，所有這一切都表明了醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的技術(shù)基礎(chǔ)正在發(fā)生戰(zhàn)略性的變革。世界各大醫(yī)藥企業(yè)已瞅準目標，紛紛投入巨資圍繞以現(xiàn)代生物技術(shù)為核心的產(chǎn)品和技術(shù)結(jié)構(gòu)開拓，展開了面向21世紀的空前激烈的競爭。基因藥物的前沿技術(shù)及部分基因藥物

基因藥物的直接體內(nèi)基因治療發(fā)展迅速,新型基因藥物不斷產(chǎn)生。現(xiàn)著重介紹對效果比較肯定關(guān)于基因藥物的幾項前沿技術(shù)，基因疫苗、反義RNA 藥物、三鏈DNA 藥物這三種新型基因藥物技術(shù)的基本方法。1.1基因疫苗

基因疫苗的免疫方法即基因疫苗的給藥途徑,目前使用的方法有以下幾種:（1）裸DNA 直接注射:將裸質(zhì)粒DNA 直接注射到機體的肌肉、皮內(nèi)、皮下、粘膜、靜脈內(nèi)。這種方法簡單易行。

（2）脂質(zhì)體包裹DNA 直接注射:包裹DNA 的脂質(zhì)體能與組織細胞發(fā)生膜融合,而將DNA 攝入,減少了核酸酶對DNA 的破壞。注射途徑同裸DNA直接注射。

（3）金包被DNA 基因槍轟擊法:將質(zhì)粒DNA 包被在金微粒子表面,用基因槍使包被DNA 的金微粒子高速穿入組織細胞.。

（4）繁殖缺陷細菌攜帶質(zhì)粒DNA 法:選擇一種容易進入某組織器官的細菌,將其繁殖基因去掉,然后用質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化細菌,當這些細菌進入某組織器官后,由于不能繁殖,則自身裂解而釋放出質(zhì)粒DNA。1.2反義RNA 反義RNA 指與mRNA 互補后,能抑制與疾病發(fā)生直接相關(guān)基因的表達的RNA。它封閉基因表達,具有特異性強、操作簡單的特點,可用來治療由基因突變或過度表達導(dǎo)致的疾病和嚴重感染性疾病,反義RNA 治療的基本方法有： 1)反義寡核苷酸：體外合成十至幾十個核苷酸的反義寡核苷酸或反義硫代磷酸酯寡核苷酸序列,用脂質(zhì)體等將反義寡核苷酸導(dǎo)入體內(nèi)靶細胞,然后反義寡核苷酸與相應(yīng)mRNA特異性結(jié)合,從而阻斷mRNA 的翻譯。

2)反義RNA表達載體:合成或PCR 擴增獲取反義RNA 的DNA ,將它克隆到表達載體,然后

將表達載體用脂質(zhì)體導(dǎo)入靶細胞, 該DNA 轉(zhuǎn)錄反義RNA ,反義RNA 即與相應(yīng)的mRNA 特異性結(jié)合,同樣阻斷某基因的翻譯。

反義RNA目前主要用于惡性腫瘤、病毒感染性疾病等。有報導(dǎo)，用反義封閉胰腺癌、肺癌的癌基因，對癌細胞具有明顯的抑制作用。1.3三鏈DNA 脫氧寡核苷酸能與雙螺旋雙鏈DNA 專一性序列結(jié)合,形成三鏈DNA ,來阻止基因轉(zhuǎn)錄或DNA 復(fù)制,此脫氧寡核苷酸被稱為三鏈DNA 形成脫氧寡核苷酸(TFO)。為了與作用在mRNA 翻譯水平的反義RNA 的反義技術(shù)相區(qū)別,將三鏈DNA 技術(shù)稱之為反基因技術(shù)。

基本方法與機理

設(shè)計合成15～40個堿基的脫氧寡核苷酸, 這些序列具有較短而兼并性較高的特點, 與雙鏈DNA結(jié)合,通常結(jié)合在蛋白識別位點處,形成三鏈DNA ,干擾DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合, 如轉(zhuǎn)錄激活因子, 從而阻止基因的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。1.4部分基因藥物

生物技術(shù)的開發(fā)迅猛異常、日新月異。生物技術(shù)的核心是基因工程, 基因工程技術(shù) 最成功的是用于生物治療的新型藥物的研制。已有近50 種基因工程藥物投入市場, 產(chǎn)生 了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。生物技術(shù)用于疾病的預(yù)防和疑難病癥的治療已經(jīng)成為現(xiàn) 實。基因藥物主要為以下幾個系列：

（1）干擾素系列(IFN)IFN是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，僅在同種細胞上可發(fā)揮作用。根據(jù)其來源、理化及生物學(xué)性質(zhì)的不同，可分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ 3種干擾素。干擾素具有很強的生物活性，主要表現(xiàn)在：

①抗病毒作用 目前慢性丙型肝炎的治療以IFN-α為首選。②抗腫瘤作用。③免疫調(diào)節(jié)作用。

（2）白介素系列 白細胞介素是非常重要的細胞因子家族，現(xiàn)在得到承認的成員已達15個；它們在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過程中均發(fā)揮重要作用，此外它們還參與機體的多種生理及病理反應(yīng)。

（3）集落刺激因子類藥物(CSF)一些細胞因子可刺激不同的造血干細胞在半固體培養(yǎng)基中形成細胞集落，這些因子被命名為集落刺激因子，根據(jù)其作用對象，進一步命名分為粒細胞-CSF，巨噬細胞-CSF，粒細胞和巨噬細胞-CSF及多集落刺激因子。

（4）其他基因工程藥物

①促進紅細胞生成素 促紅細胞生成素(Epo)是一種調(diào)節(jié)紅細胞生成的體液因子，自從成功地克隆人類Epo基因后，其產(chǎn)物重組人促紅細胞生成素被成功用于治療腎性貧血及腫瘤等疾病伴發(fā)的貧血。最近的研究認為Epo是一種由缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor，HIF)家庭誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能細胞因子超家庭成員，對于多種器官都有保護作用。有報導(dǎo)，Epo能通過降低腎IRI時MDA、IL-6水平，增加SOD水平從而發(fā)揮保護作用，而最新研究還表明Epo有促進血管生成的作用。

②人生長激素人類的生長激素(Growth hormone，GH)是一條單鏈、非糖化、191個氨基酸合成的親水性球蛋白，分子量21700Da，等電點pI為4.9.人生長激素具有促生長、促進蛋白質(zhì)合成、對脂肪、糖、能量代謝有影響。

③人表皮生長因子 皮膚細胞表達10種以上的生長因子，它們以自分泌和旁分泌的方式對細胞自身和鄰近細胞進行多種調(diào)節(jié)。

④重組鏈激酶 對心腦血管疾病有一定的療效。

⑤腫瘤壞死因子 研究表明，巨噬細胞是產(chǎn)生TNF的主要來源。當肝、脾等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)受到刺激后，借助于脂多糖的幫助，TNF基因開始轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生并釋放TNF。同時B淋巴細胞也

產(chǎn)生一種與TNF類似的淋巴毒素，并與TNF享有共同受體。為了便于區(qū)分二者，將巨噬細胞產(chǎn)生的毒素稱為TNF—α，淋巴細胞產(chǎn)生的毒素稱為TNF-β。

TNF-α是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強的細胞因子，它能特異性地直接殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞無不良影響，能抑制腫瘤細胞的增殖并促使其溶解，還可激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。但是由于TNF-α能被腎快速排泄和各種蛋白酶分解作用，在體內(nèi)很不穩(wěn)定，半衰期很短(15～30min)，而殺傷腫瘤細胞需要12～36 h。若希望通過靜脈給藥獲得明顯的抗腫瘤效果，則必須頻繁大劑量注射，進而導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)。目前國內(nèi)外學(xué)者對其的制劑研究主要集中在高分子化學(xué)修飾和藥物載體傳遞系統(tǒng)兩方面．無論采取何種手段，其最終目的有二：一是減少RES的攝取，延長藥物血中半衰期；二是提高藥物的靶向性，降低不良反應(yīng).國外基因工程藥物研究開發(fā)現(xiàn)狀和展望

據(jù)不完全統(tǒng)計，歐美諸國目前已經(jīng)上市的基因工程藥物近100 種，還有約300 種藥物正在臨床試驗階段，處于研究和開發(fā)中的品種約2 000 個。近兩年基因藥物上市的周期明顯縮短，與一般藥物研究開發(fā)相比，基因工程藥物研究投入較大。

美國作為基因重組技術(shù)的發(fā)源地和眾多基因工程藥物的第一制造者，每年在基因工程藥物研究方面的投資高達數(shù)十億美元，現(xiàn)已成為國際公認的現(xiàn)代生物技術(shù)研究和開發(fā)的“帶頭羊”。日本，歐洲等地也不甘落后，都根據(jù)各自的特點，制定出符合本國國情的發(fā)展戰(zhàn)略和對策，進行著激烈的競爭和角逐，就連亞洲的韓國，新加坡等也野心勃勃地著手這方面的研究和開發(fā)。

美國：在基因工程藥物的研究和開發(fā)方面美國一直保持著世界領(lǐng)先地位。從1971年成立第一家美國生物技術(shù)公司到現(xiàn)在已形成擁有1300余家公司（占全世界生物技術(shù)公司總數(shù)的2/3的令人注目的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，不過短短25年的歷史，到1996年8月美國有20多種基因工程藥物和疫苗上市。（詳見表1）另有113家美國公司的284個產(chǎn)品處于臨床試驗階段或等待FDA批準，呈現(xiàn)了強勁的發(fā)展勢頭。

日本：日本在基因工程藥品的研究和開發(fā)方面也投入了大量資金，并取得了豐碩成果。現(xiàn)已開發(fā)出干擾素，乙肝疫苗，人促紅細胞生產(chǎn)素，組織纖溶酶原激活劑，人生長激素，人胰島素，人巨噬細胞集落刺激因子，人粒細胞集落刺激因子等眾多產(chǎn)品。國內(nèi)基因工程藥物研究開發(fā)現(xiàn)狀及展望

我國生物工程藥物研究雖起步較晚，基礎(chǔ)較差，但一開始就受到黨和國家的高度重視。為跟蹤世界新技術(shù)革命迅猛發(fā)展的浪潮，1986年3月我國一批著名科學(xué)家倡導(dǎo)起草了“高技術(shù)研究計劃”——“863計劃”，并將現(xiàn)代生物技術(shù)列為“863計劃”最優(yōu)先發(fā)展的項目和國家“七五”，“八五”攻關(guān)項目。經(jīng)過廣大科技工作者的艱苦努力，已取得了鼓舞人心的進展，一批基因工程產(chǎn)品的上游研究正在努力展開；一些產(chǎn)品正逐步進入開發(fā)研究階段，不少產(chǎn)品已步入臨床試驗階段或已獲新藥證書，進入工業(yè)化生產(chǎn)，詳見表2。

與傳統(tǒng)制藥相比，生物制藥有便于大規(guī)模生產(chǎn)、利潤高、生產(chǎn)工藝簡單、人力投入少、無污染、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，因此，隨著人類基因組計劃的實施和科技水平的進一步發(fā)展，基因藥物在醫(yī)藥市場的比例也將會日益提升，也將越來越影響人類的生活。

基因藥物同時具有高投入、高收益、高風(fēng)險、長周期的特征。Frost&Sullivan公司的一份最新報告指出，2004年，全球生物制藥市場的收入為450億美元。到2011年，其有望達到982億美元。據(jù)預(yù)測，全球第一個用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的生物藥物可望于2005～2006年上市。隨著公眾認知度的提高和相關(guān)法規(guī)的逐步完善，用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)生物藥物的市場將飛速增長，到2011年，單美國市場就將達到22億美元。2002年底到2003年5月間一場突如其來的SARS疫情，再加上2005禽流感病毒傳播，席卷了亞洲及加拿大等地。在緊張而又嚴肅的應(yīng)對

這場疫情的過程中，生物制藥又成為醫(yī)藥行業(yè)人士關(guān)注的焦點。

我國生物制品需求巨大，過去的幾年我國企業(yè)一直能保持年均15％以上增幅，并且近年來銷售的增長速度有加快的趨勢。據(jù)統(tǒng)計，2005年國內(nèi)生物制品銷售收入總額為157．4億元人民幣，銷售利潤總額為38.7億元人民幣。預(yù)計到2006年生物技術(shù)工業(yè)總產(chǎn)值將達400億到500億元，到2015年總產(chǎn)值可達1100億到1300億元。我國的生物制藥業(yè)將進入一個快速發(fā)展的階段,生物醫(yī)藥工業(yè)將成為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)增長最快的部分。目前,我國許多省市已將生物制藥作為本地的支柱產(chǎn)業(yè)重點扶持。一大批生物醫(yī)藥科技園相繼在各地高新技術(shù)開發(fā)區(qū)建成。面對入世帶給我國生物制藥業(yè)的挑戰(zhàn)和機遇,專家們預(yù)測,在未來若干年,我國的生物制藥業(yè)將以超過全球平均增長速度步入高速發(fā)展軌道,前景十分廣闊。

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第四篇：基因工程論文

學(xué)號：13054107

基因工程結(jié)課論文

靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達載體構(gòu)建

院（系）名

稱： 理學(xué)院 專業(yè)

名

稱： 生物科學(xué) 學(xué)

生

姓名： 姜己玉 所

在班

級： 13-1

目錄

摘要............................................................................................................................................2 第一章 緒論..............................................................3 1..1RNAi的研究進展....................................................3 1.1.1RNAi的分子作用機制...........................................3 1.1.2 RNAi 的特點..................................................3 1.1.3 siRNA簡介.........................................................3 1.1.4 s iRNA 的設(shè)計原則..........................................3 1.2 用于 RNA i 的載體....................................................4 1.2.1 載體的選擇..................................................4 1.2.2 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的.................................................4 1.3 MRP1 的研究進展......................................................4 第二章 實驗材料與方法.....................................................5 2.1 實驗材料.............................................................5 2.1.1 宿主菌.............................................................5 2.1.3 載體通用引物................................................5 2.1.5 主要儀器..........................................................5 2.2 試驗方法.........................................................5 2.2.1 shRNA 的設(shè)計與退火..................................................5 2.2.2 合成干涉片段的退火..........................................6 2.2.3 重組載體的構(gòu)建..............................................6 2.2.4 菌落PCR初步篩選陽性重組子..................................7 2.2.5 測序鑒定重組載體...............................................7 第三章 結(jié)果與分析.........................................................8 3.1 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結(jié)果...........................8 3.1.1 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后結(jié)果.............................8 3.1.2 目的片段的回收................................................8 3.2 重組質(zhì)粒的菌落PCR...................................................8 3.3 重組質(zhì)粒大量提取......................................................8 3.4 重組質(zhì)粒測序結(jié)果.................................................8 參考文獻..................................................................9

摘 要

癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢。化療作為其常規(guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。腫瘤細胞的多藥耐藥性（multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致腫瘤細胞化療失敗的主要原因。腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的過度表達是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達的技術(shù)，如能通過RNAi技術(shù)沉默MDR1基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。

目的：本課題選用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表達穿梭載體。構(gòu)建針對mrp1 mRNA的RNA干擾表達載體。

方法：將預(yù)先根據(jù)MRP1基因序列設(shè)計合成的編碼siRNA的cDNA序列與pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建靶向mrp1 siRNA重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后大量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落 PCR和 DNA測序分析檢測重組載體構(gòu)建結(jié)果。

結(jié)果：成功構(gòu)建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達載體。為下一步抑制mrp1基因在腫瘤細胞中的表達奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：RNA干擾；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒；穿梭載體

第1章 緒 論

1.1 RNAi的研究進展

RNA干擾(RNA interference , RNAi)是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，為一種雙鏈RNA分子在mRNA 水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達的過程，是一項新興的基因阻斷技術(shù)。RNAi有望成為分析人類基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。

1.1.1 RNAi的分子作用機制

RNAi的作用機制在眾多學(xué)者的努力研究下日漸明朗。不同生物體內(nèi)的RNA干擾作用機制也各有不同，但是主要可以分為兩種類型：特異效應(yīng)作用機制與非特異效應(yīng)作用機制。特異性效應(yīng)一般發(fā)生在短雙鏈RNA（21～23nt）上，非特異性效應(yīng)發(fā)生于長雙鏈RNA（30nt以上）。

1.1.2 RNAi的特點

RNAi具有高效性，也就是說與細胞內(nèi)的mRNA的量相比，注入細胞內(nèi)的siRNA的量要少得多。但由于循環(huán)放大機制的存在，仍可以有效地阻斷目的基因的表達；同時，RNAi也具有高特異性，小干擾RNA由dsRNA降解得到的，除在序列識別中不起主要作用的正義鏈3′端的兩個堿基以外，其余堿基均為必需。

1.1.3 siRNA簡介

RNA干擾作用是通過siRNA（small interfering RNA，siRNA）這類小RNA分子作為較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實現(xiàn)的。通過對植物的研究證明，雙鏈RNA復(fù)合體降解為35nt左右的小RNA分子后通過序列互補與mRNA結(jié)合，進而降解mRNA。

1.1.4 siRNA的設(shè)計原則

RNAi 作用的成功與否，關(guān)鍵在于siRNA序列的結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)的siRNA序列沉默基因的效率差別很大，2001年，Elbashir S M等[應(yīng)用化學(xué)合成法合成了siRNA，并發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)哺乳動物發(fā)生RNAi，他們進而據(jù)此提出了siRNA 設(shè)計方法：1)從起始密碼下游50~100nt開始搜索siRNA以避免出現(xiàn)于5′或3′端的UTRs 的蛋白結(jié)合位點，；

2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果沒有相應(yīng)序列，可以選擇5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之間[16]； 4)要確定siRNA對靶基因的特異性，可以利用Blast軟件在基因組中進行比對，；5)設(shè)置在基因組中無對應(yīng)序列的siRNA的對照siRNA。但是，Elbashir S M等的設(shè)計方法siRNA 篩選效率仍然很低，要更好的掌握RNAi。

1.2 用于RNAi的載體

基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具，稱為載體。是指能夠運載外源DNA片段進入受體細胞，具有自我復(fù)制能力，使外源DNA片段在受體細胞中得到擴增和表達，不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。載體具有以下的功能：（1）運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞；（2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；（3）為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。

1.2.1載體的選擇

質(zhì)粒是為一種1-200kb不等的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子。是染色體外穩(wěn)定遺傳，并能以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中的因子。RNA干擾實驗通常選用質(zhì)粒作為載體。質(zhì)粒載體是為適應(yīng)實驗室操作在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工構(gòu)建的。但是，天然質(zhì)粒的缺點是分子量大，拷貝數(shù)低，所以為使分子量盡可能減少，必須去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。

1.2.2 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的

天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對之進行改造構(gòu)建

1.3 MRP1的研究進展

MRP1的底物 直接通過細胞毒性分析和底物刺激的ATP酶測量進行識別MRP1的底物的，底物是由大量的多樣化的疏水復(fù)合物，有機陰離子結(jié)合物以及陰離子非結(jié)合性底物所組成。典型的結(jié)合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合物，MRP1的組織分布 MRP1在體內(nèi)的表達可以說是無所不在。

第2章 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 宿主菌

E.coli DH5α：為感受態(tài)宿主菌由北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司提供。

2.1.2 質(zhì)粒載體

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒特性如下：pRNAT-H1.1/shuttle 是一種腺病毒siRNA穿梭質(zhì)粒，shRNA的表達由人的轉(zhuǎn)錄啟動子H1 Promoter啟動，H1啟動子屬于PolⅢ啟動子，該啟動子總在其下游的固定距離開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，轉(zhuǎn)錄過程遇到4~5個連續(xù)的U即終止，非常精確；同時CMV Promoter為真核生物啟動子，可在該質(zhì)粒中高效啟動紅色熒光蛋白的表達；MCS為多克隆位點。

2.1.3 載體通用引物

正向引物（M13）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ 反向引物（Rev）：5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′

2.1.4 主要試劑、具酶及儀器

質(zhì)粒快速提取試劑盒，Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒，10×PCR buffer，dNTP，Marker(1kb,100bp)，Goldview DNA染料，EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶，LiCl Amresco RNase Sigma bacto-typtone Bio Basic Inc bacto-yeast extract Bio Basic Inc PEG8000，HindⅢ NEB，BamHI NEB，T4DNA連接酶 NEB，Taq酶，微量振蕩器（MM-2型），微量振蕩器（MM-2型），恒溫空氣搖床，電子天平，紫外分析儀（ZF型），低溫離心機（SK18），低溫離心機（SK18），PCR儀（9600型），ABI 恒溫磁力攪拌器（2003-16），恒溫水浴鍋，自動雙重純水儀

2.2 實驗方法

2.2.1 shRNA的設(shè)計與退火

根據(jù)siRNA設(shè)計原則[34]，根據(jù)MRP1靶序列，設(shè)計合成四對互補反向重復(fù)脫氧核糖核酸序列，中間間隔9nt莖環(huán)序列(TTCAAGAGA)，5′端帶有BamHⅠ酶切位點，3′端帶有HindⅢ酶切位點，用BLAST進行同源性分析，確定與其他基因無同源性。shRNA的 5

DNA模板由上海生工合成，單鏈干涉片段退火后形成雙鏈。根據(jù)2個靶序列設(shè)計的2對DNA干涉片段mrp1-1，mrp1-2。

2.2.2 合成干涉片段的退火

合成片段的退火體系：各管混勻后90℃保溫3分鐘，37℃保溫1h，再取5μL退火溶液加45μL 滅菌雙蒸水混勻，使干涉片段終濃度為8ng/μL。

2.2.3 重組載體的構(gòu)建

（1）將含有pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒的大腸桿菌接種入盛有200mL LB培養(yǎng)基（含2μg/mL氨芐青霉素）的500mL三角瓶中，置37℃振蕩培養(yǎng)過夜（置搖床中160r/min）。（2）實驗前預(yù)先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。預(yù)冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。取出菌懸液，觀察菌體生長狀況，將菌懸液分裝于兩個250ml離心桶中，調(diào)平。預(yù)冷離心機至4℃，4℃下8000r/min離心5min，棄上清，得菌體。（3）加預(yù)冷的溶液Ⅰ50ml于每離心桶，混勻，洗滌沉淀。8000r/min離心5min，棄上清，得沉淀。此步驟的目的為出去培養(yǎng)基，以獲得更純的細菌沉淀物。（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重懸細菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，溫和混勻，室溫放置10min，裂解大腸桿菌。（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌體破碎，釋放質(zhì)粒DNA等內(nèi)容物。緩慢顛倒數(shù)次，防止破壞基因組DNA，室溫放置3min。（6）加30ml預(yù)冷的溶液Ⅲ，緩慢顛倒數(shù)次，防止SDS破壞基因組DNA，冰浴放置15min。4℃下以10000r/min離心10min，然后將上清液全部倒入新離心桶中。（7）將上清液在4℃下以10000r/min離心10min，然后將上清液經(jīng)8層紗布過濾至新離心桶中。（8）加0.6倍體積（約54ml）的異丙醇，充分混勻，室溫放置15min，以沉淀核酸。8000r/min離心15min，小心倒掉上清，敞開瓶口倒置于紙巾上，使殘余上清液流盡，晾干。（9）加15ml水再加15ml LiCl（預(yù)冷）混勻，靜置沉淀15min，4℃下10000r/min離心15min，以出去蛋白質(zhì)和RNA。（10）倒上清于新的離心桶中，加30ml異丙醇，劇烈震蕩，靜置沉淀15min，在4℃下以10000r/min離心15min。再次沉淀核酸。（11）棄上清，得到沉淀的核酸。敞開瓶口倒置于紙巾上使殘余上清液流盡。（12）用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下以10000r/min離心5min，棄去乙醇，離心桶敞口倒置于紙巾上，使乙醇揮發(fā)殆盡。此步驟可以沉淀DNA。（13）加2ml無菌水溶解沉淀，將液體吸到10ml離心管中，再吸2ml ddH2O沖洗瓶壁，隨后將洗液加到同一10ml離心管中，隨后加100μl RNaseA，37℃，水浴30min。以使RNA徹底分解。（14）加等體積含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機于4℃以12000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。（15）沉淀用3ml70%乙醇重懸清洗，以除去PEG，12000r/min離心8min。（16）重復(fù)上步操作，將離心管倒扣于紙巾上10min，加1ml H2O溶解，用等體積酚/氯仿/異戊醇再抽提一次蛋白質(zhì)，室溫下8000r/miin離心10min。（17）小心吸上清與另一離心管中，加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，再加0.1體積的NaAC（3mol，pH5.2），冰上沉淀20min，4℃下10000r/min離心15min，使DNA沉淀出來。（18）去上清加入3ml 70%乙醇重懸清洗，10000r/min 離心15min，晾干，用500μl無菌水溶解沉淀。

2.2.4菌落PCR初步篩選陽性重組子

滅菌牙簽挑取LB篩選平板上圓滑單菌落，先在預(yù)先分隔并標記的另一LB平皿上劃板，然后點入制備好的PCR反應(yīng)混合液，開始擴增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2分鐘；94℃ 變性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35個循環(huán)；72℃ 延伸1分鐘，4℃保存，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。劃板的平皿于37℃培養(yǎng)12-16h。

2.2.5 測序鑒定重組載體

將小提鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司，以載體反向引物為測序引物。將經(jīng)鑒定后未發(fā)生突變的H1.1-

1、H1.1-2靶向MRP1基因siRNA重組質(zhì)粒的宿主菌搖瓶擴大培養(yǎng)后，進行質(zhì)粒大量提取,方法如2.1.2.3.1所述。

第3章 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結(jié)果

3.1.1 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后結(jié)果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切，結(jié)果顯示單酶切產(chǎn)物大小約為6200bp，雙酶切產(chǎn)物略小于單酶切產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符。

3.1.2 目的片段的回收

目的片段回收 ,結(jié)果顯示回收產(chǎn)物大小約為6Kb，與預(yù)期結(jié)果相符。

3.2 重組載體的菌落PCR 重組載體菌落 PCR電泳，結(jié)果顯示PCR擴增產(chǎn)物,電泳分析發(fā)現(xiàn)陽性產(chǎn)物可以擴增出560bp大小的條帶，假陽性產(chǎn)物不能擴增出560bp大小的條帶,與預(yù)期結(jié)果相符，可以初步篩選出陽性產(chǎn)物。

3.3 重組質(zhì)粒大量提取

重組質(zhì)粒大量提取后的電泳，結(jié)果顯示pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 重組質(zhì)粒大小約為6.2kb，與預(yù)期結(jié)果相符。

重組質(zhì)粒大提并稀釋50倍以后在紫外分光光度儀Genespec上測其OD值。

3.4 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒測序鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的堿基序列與預(yù)期結(jié)果一致，未發(fā)生堿基突變，說明pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

參考文獻

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第五篇：基因工程論文

基因工程論文

一． 定義

基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。基因工程技術(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段

二，基本操作步驟：

1．提取目的基因：一條是從供體，的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因（1）直接分離基因：最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復(fù)制（在遺傳學(xué)中叫做擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。

（2）工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對的原則，推測出它的基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。

2.目的基因與載體結(jié)合：將目的基因與運載體結(jié)合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。

3.將目的基因?qū)胧荏w細胞：目的基因的片段與運載體在生物體外連接形成重組DNA分子后，下一步是將重組DNA分子引入受體細胞中進行擴增。

4.目的基因檢測與表達：在全部的受體細胞中，真正能夠攝入重組DNA分子的受體細胞是很少的。必須通過一定的手段對受體細胞中是否導(dǎo)入了目的基因進行檢測。重組DNA分子進入受體細胞后，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程。

三．基因工程應(yīng)用：

1．與醫(yī)藥衛(wèi)生

（1）生產(chǎn)基因工程藥品（2）基因診斷（3）基因治療

2．與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)

（1）農(nóng)業(yè)：培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)或具特殊用途的動植物新品種。

（2）畜牧養(yǎng)殖業(yè)：培育體型巨大、品質(zhì)優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因動物；利用外源基因在哺乳動物體內(nèi)的表達獲得人類所需要的各種物質(zhì)，如激素、抗體及酶類等。（3）食品工業(yè)：為人類開辟新的食物來源。

3．與環(huán)境保護

（1）用于環(huán)境監(jiān)測：用DNA探針可檢測飲水中病毒的含量

（2）用于被污染環(huán)境的凈化：分解石油的“超級細菌”；“吞噬”汞和降解土壤中DDT的細菌；能夠凈化鎘污染的植物；構(gòu)建新的殺蟲劑；回收、利用工業(yè)廢物等。

生物081 馬明臣 0802030119