第一篇：基因工程藥物的生產原理及其應用

基因工程藥物的生產原理及其應用

摘要：近年來，基因工程藥物在目的基因制備、載體的構建、基因轉移技術、宿主表達系統和生物反應發生器等方面取得了令人矚目的成就。本文簡單介紹基因工程藥物的生產原理及其重要應用。關鍵詞：基因工程藥物 生產原理 應用

隨著基因研究的深入，人類已經可以生產出許多基因工程產品。基因工程藥物引入醫藥產業,由此引起了醫藥工業的重大變革,使得醫藥產業成為最活躍、發展最快的產業之一，同時大大提高了21世紀人類的整體健康狀況。

基因工程藥物又稱生物技術藥物是指利用基因工程技術研制和生產的藥物，是根據人們的愿望設計的基因,在體外剪切組合,并和載體DNA 連接,然后將載體導入靶細胞(微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞),使目的基因在靶細胞中得到表達,最后將表達的目的蛋白質純化及做成制劑,從而成為蛋白類藥或疫苗。主要種類有：胰島素、單克隆抗體、荷爾蒙、干擾素、白細胞介素、組織型纖溶酶原激活因子、紅細胞生成素、集落刺激因子。生產原理

基因工程制藥技術分獲取目標基因的上游技術和大量培養上游技術階段。上游技術實質就是基因工程技術。下游技術則包括菌體培養，細胞破碎，大量培養以及分離純化幾個步驟。

1.1 基因工程制藥的上游技術

基因工程是生物工程的一個重要分支，它和細胞工程、酶工程、蛋白質工程和微生物工程共同組成了生物工程。所謂基因工程是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當的工具酶進行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達。

基因工程研究采用的技術方法很多，以下介紹常見基本兩種：聚合酶鏈反應技和Sanger雙脫氫鏈終止法。

1.1.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。

類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

① 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

② 模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③ 引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍

作者簡介:任灝詩,女,漢族,籍貫(廣東佛山),大學本科,華南師范大學大二本科生, Email: 1030156661@qq．com 現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。1.1.2 雙脫氫鏈終止法

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復制或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個堿基)，根據片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。主要步驟如下：

Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測序程序 操作程序是按DNA復制和RNA反轉錄的原理設計的。

1.分離待測核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。

2.在4只試管中加入適當的引物、模板、4種dNTP(包括放射性標記dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP(雙脫氧核苷酸)。

3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理)結合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進行延伸反應，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddNTP摻入時，由于它在3’位置沒有羥基，故不與下一個dNTP結合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的DNA鏈。

4.用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時分離4只反應管中的反應產物，由于每一反應管中只加一種ddNTP(如ddATP)，則該管中各種長度的DNA都終止于該種堿基(如A)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3’ 末端都為同一種雙脫氧堿基。

5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。1.2 基因工程制藥下游技術

1.2.1 基因工程菌的培養

基因工程菌的培養過程主要包括：

① 通過搖瓶操作了解工程菌生長的基礎條件；

② 通過培養罐操作確定培養參數和控制的方案以及順序。

由于細胞生長和異源基因表達之間有著較大的差異，各培養參數在全過程中必須分段控制。

培養方式主要有：

一、補料分批培養

補料分批培養是將種子接入發酵反應器中進行培養，經過一段時間后，間歇或連續地補加新鮮培養基，使菌體進一步生長的培養方法。

二、連續培養

連續培養是將種子接入發酵反應器中，攪拌培養至一定菌體濃度后，開動進料和出料的蠕動泵，以控制一定稀釋率進行不間斷的培養。連續培養可為微生物提供恒定的生活環境，控制其比生長速率。

三、透析培養

透析培養是利用膜的半透性原理使代謝產物和培養基分離，通過去除培養液中的代謝產物來解除其對生產菌的不利影響。采用膜透析裝置是在發酵過程中用蠕動泵將發酵液打作者簡介:任灝詩,女,漢族,籍貫廣東佛山),大學本科,華南師范大學大二本科生, Email: 1030156661@qq．com．

入罐外的膜透析器的一側循環，其另一側通入透析液循環。

四、固定化培養

基因工程菌經固定化培養后，解決了質粒的穩定性問題，該培養方式對分泌型菌更為有利

1.2.2基因工程菌細胞的破碎

現今，在基因工程菌的研究中，主要涉及有細菌，酵母和藻類。微生物的細胞壁比較堅韌。

目前已發展了多種細胞破碎方法，以便適應不同用途和不同類型的細胞壁破碎。破碎方法可規納為機械法和非機械法兩大類。

機械法有很多類型，常見的有：高壓勻漿破碎法（homogenization），振湯珠擊破碎法(Skaking Bead)，高速攪拌珠研磨破碎法（fine grinding），超聲波破碎法（ultrasonication）。

非機械法有如下類型：滲透壓沖擊破碎法（osmotic shock），凍融破碎法（freezing and thawing），酶溶破碎法（enzyme lysis），化學破碎法（chemical treatment），去垢劑破碎（detergents）。

1.2.3基因工程蛋白的分離和純化

基因重組產物均在其宿主細胞內克隆表達，且大多為胞內物質。基因重組蛋白的分離和純化，由于目標產物的性質和對產品純化要求不同，其分離和純化的方法和選擇的純化路徑也不同，但主要分為兩個方面：1.目標產物的粗級分離，主要是在細胞培養后，將細胞從培養液中分離出來，然后再破碎細胞釋放產物，溶解包含體，復原蛋白質以除去大部分雜質；2.目標產物的純化，這是在分離的基礎上，用各種具體高選擇性的精密儀器，使產物的純度和回收率。

主要分離技術: 1．離心及沉淀 離心分離的原理是在轉子高速轉動所產生的離心力的驅動下，利用固體及液體間的密度差來進行懸浮液，乳濁液的分離。沉淀原理是利用油和雜質的不同密度，借助策略的作用，達到自然分離才者的一種方法。

2.膜分離 膜分離是在20世紀初出現，20世紀60年代后迅速崛起的一門分離新技術。膜分離技術由于兼有分離、濃縮、純化和精制的功能，又有高效、節能、環保、分子級過濾及過濾過程簡單、易于控制等特征，因此，目前已廣泛應用于食品、醫藥、生物、環保、化工、冶金、能源、石油、水處理、電子、仿生等領域，產生了巨大的經濟效益和社會效益，已成為當今分離科學中最重要的手段之一。

3.雙水相萃取 某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可以形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統。利用親水性高分子聚合物的水溶液可形成雙水相的性質，Albertsson于20世紀50年代后期開發了雙水相萃取法，又稱雙水相分配法。20世紀70年代,科學家又發展了雙水相萃取在生物分離過程中的應用，為蛋白質特別是胞內蛋白質的分離和純化開辟了新的途徑。

4.反膠團萃取 蛋白質溶解于小水池中(正萃，或稱萃取)，其周圍有一層水膜及表面活性劑極性頭的保護，使其避免與有機溶劑接觸而失活。改變pH、鹽濃度等條件蛋白質又可回到水相(反萃)，實現了蛋白質的萃取分離、純化目的。反膠團萃取蛋白質的機理目前尚不十分清楚。一般認為，萃取過程是靜電力、疏水力、空間力、親和力或幾種力協同作用的結果，其中蛋白質與表面活性劑極性頭間的靜電相互作用是主要推動力。根據所用表面活性劑類型，通過控制水相pH高于或低于蛋白質的等電點(pI)，達到正萃反萃的目的。

作者簡介:任灝詩,女,漢族,籍貫廣東佛山),大學本科,華南師范大學大二本科生, Email: 1030156661@qq．com．

基因工程藥物應用事例

2.1胰島素

胰島素是基因工程藥物最重要的代表。胰島素是由胰產生的一種蛋白。它在人體新陳代謝中起著重要作用，如果體內不足就會引發糖尿病，因此胰島素是治療糖尿病的特效藥。這種病發病率很高，困擾著上千萬人。過去從豬、牛胰中提取胰島素，產量低，滿足不了患者的需求。現在利用基因工程技術，有兩種方法可以讓微生物發酵產生胰島素。一種是先在大腸桿菌中分別合成胰島素A鏈和B鏈，然后再在體外用化學方法將兩條鏈連接成胰島素。美國Eli lilly公司采用這種方法生產胰島素。另一種是采用分泌型載體表達胰島素原，然后再將其轉化為胰島素。丹麥Novo Nordisk公司就是采用重組酵母分泌產生胰島素原，再用酶法轉化為人胰島素。2.2干擾素

干擾素是病毒入侵人體或其他動物后，機體產生的可以對多種病毒具有抵抗能力，抑制它們復制、增殖的一種蛋白質。它是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，其活性受細胞基因組的調控。在一般生理狀態下，細胞的干擾素基因呈靜止狀態，只有在干擾素誘導劑作用下，干擾素基因才進行轉錄并翻譯出具有種屬特異性的干擾素。干擾素本身不能直接殺滅活病毒，但是它能使細胞產生許多抗病毒蛋白質，使病毒的mRNA不能和核酸體結合，因而無法合成病毒蛋白質，從而減少了新病毒粒子的合成，阻斷了病毒的增殖。它在臨床上主要用于惡性腫瘤和病毒性疾病的治療。

過去，干擾素一般只能從感染病毒的人血液中的白細胞或纖維中提取，量少價昂，難以應用于臨床。1980年美國基因技術公司把人體血細胞干擾素基因轉移到大腸桿菌或酵母菌中，成功表達。其中a、β、r種干擾素已工業化生產，產品已投放市場。我國也已生產出a型和r型干擾素。2.3重組疫苗

所謂重組疫苗就是利用重組DNA技術，克隆并表達抗原基因的編碼序列，并將表達產物用作疫苗。重組疫苗的重要性在于它可以替代滅活或無感染力的病原微生物來進行免疫。第一個應用于人體的重組疫苗是用酵母菌生產的乙肝疫苗。它是將乙肝表面蛋白抗原基因在酵母菌 中克隆和表達，生產出來的蛋白及其聚合物與在感染體內發現的十分相似，將這些聚合物純化，制成乙肝疫苗，可以用于使人體產生對乙肝病毒的免疫力。

在生物技術總的發展趨勢下，基因工程制藥仍是21世紀生物制藥中最具活力的研究領域．隨著人類基因組中更多基因的功能被研究清楚和藥物基因組學的不斷完善，將可能有數以千計的具有特殊療效的蛋白質藥物問世。這將使傳統的醫藥業發生革命性變化。藥物的生產和使用將會更加趨于種族化、家族化甚至個體化。參考文獻

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第二篇：基因工程藥物論文

基因工程藥物

姓名：陳劍云 學號：U201210914 班級：機械學院測控1204班

摘要：自１９７２年ＤＮＡ重組技術誕生以來，生命科學進入了一個嶄新的發展時期。１９８２年美國禮萊公司推出基因工程胰島素，這是第一個人用基因工程藥物。從那時起，以基因工程為核心的現代生物技術已應用到農業、醫藥、化工、環境等各個領域。基因工程技術的迅速發展不僅使醫學基礎學科發生了革命性的變化，也為醫藥工業發展開辟了廣闊的前景，以ＤＮＡ重組技術為基礎的基因工程技術改造和替代傳統醫藥工業技術，已成為重要的發展方向。

關鍵詞：基因工程制藥應用

基因的定義：基因是脫氧核糖核酸（DNA）分子上的一個特定片段。不同基因的遺傳信息，存在于各自片段上的堿基排列順序之中。基因通過轉錄出的信使使核糖核酸（mRNA），指導合成特定的蛋白質，使基因得以表達。

基因工程定義：基因工程又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因(DNA分子)，按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。基因工程藥物定義:基因工程藥物又稱生物技術藥物,是根據人們的愿望設計的基因,在體外剪切組合,并和載體DNA 連接,然后將載體導入靶細胞(微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞),使目的基因在靶細胞中得到表達,最后將表達的目的蛋白質純化及做成制劑,從而成為蛋白類藥或疫苗。

基因工程藥物的發展歷程：自1972年DNA重組技術誕生以來,作為現代生物技術核心的基因工程技術得到飛速的發展。1982年美國Lilly公司首先將重組胰島素投放市場,標志著世界第一個基因工程藥物的誕生。美國是現代醫藥生物技術的發源地,也是率先應用基因工程藥物的國家,其基因工程技術研究開發以及產業化居于世界領先地位。美國已擁有世界上一半的生物技術公司和一半的生物技術專利。據1998年美國藥學會統計,美國FDA已批準了56種生物技術醫藥產品上市,其中絕大多數為基因工程藥物。此外,還有200多種基因工程藥物正在進行臨床試驗,其中至少有1/5的產品將可能在今后10年內上市。基因工程藥物為美國的一些公司創造了豐厚的回報,取得了巨大的經濟效益和社會效益。歐洲在發展基因工程藥物方面也進展較快,英、法、德、俄等國在開發研制和生產基因工程藥物方面成績斐然,在生命科學技術與產業的某些領域甚至趕上并超過了美國。我國基因工程藥物的研究和開發起步較晚,直至20世紀70年代初才開始將DNA重組技術應用到醫學上,但在國家產業政策的大力支持下,這一領域發展迅速,逐步縮短了與先進國家的差距。1989年我國批準了第一個在我國生產的基因工程藥物———重組人干擾素重組人干擾素αIb,標志著我國生產的基因工程藥物實現了零的突破。重組人干擾素αIb是世界上第一個采用基因克隆和表達的基因工程藥物,也是到目前為止唯一的一個我國自主研制成功的擁有自主知識產權的基因工程一類新藥。從此以后,我國基因工程制藥產業從無到有,不斷發展壯大。截止1998年底,我國已批準上市的基因工程藥物和疫苗產品共計15種，國內已有30余家生物制藥企業取得基因工程藥物或疫苗試生產或正式生產批準文號。至2000年,我國已有200多家生物技術公司,有20多家生產銷售人干擾素、白細胞介素、乙肝疫苗等12種基因工程藥物。

基因工程藥物的本質是蛋白質，生產基因工程藥物的方法是：將目的基因連接在載體上，然后將導入靶細胞（微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞），使目的基因在靶細胞中的到表達，最后將表達的目的蛋白質提純做成制劑，從而成為蛋白類藥或疫苗。若目的基因直接在人體組織靶細胞表達，就稱為基因治療。

基因治療：基因治療就是從遺傳物質本身，即基因入手，不必產生或純化基因的最終產物，而是將基因，通常是通過一個載體直接導入人體，再利用人體自身就具有的基因復制、轉錄與翻譯功能來產生這些產物，達到補充正常基因產物或對抗異常基因的目的。將基因導入哺乳類動物細胞的方法有兩種，一類是理化方法，一類是病毒介導的DNA轉移。

利用基因工程技術生產藥品的優點在于：大量生產過去難以獲得的生理活性物質和多肽；挖掘更多的生理活性物質和多肽；改造內源生理活性物質；可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。

基因藥物的發展前景

與傳統制藥相比，生物制藥有便于大規模生產、利潤高、生產工藝簡單、人力投入少、無污染、生產周期短等優點，因此，隨著人類基因組計劃的實施和科技水平的進一步發展，基因藥物在醫藥市場的比例也將會日益提升，也將越來越影響人類的生活。

基因藥物同時具有高投入、高收益、高風險、長周期的特征。Frost&Sullivan公司的一份最新報告指出，2004年，全球生物制藥市場的收入為450億美元。到2011年，其有望達到982億美元。據預測，全球第一個用轉基因植物生產的生物藥物可望于2005～2006年上市。隨著公眾認知度的提高和相關法規的逐步完善，用轉基因植物生產生物藥物的市場將飛速增長，到2011年，單美國市場就將達到22億美元。2002年底到2003年5月間一場突如其來的SARS疫情，再加上2005禽流感病毒傳播，席卷了亞洲及加拿大等地。在緊張而又嚴肅的應對這場疫情的過程中，生物制藥又成為醫藥行業人士關注的焦點。

我國生物制品需求巨大，過去的幾年我國企業一直能保持年均15％以上增幅，并且近年來銷售的增長速度有加快的趨勢。據統計，2005年國內生物制品銷售收入總額為157．4億元人民幣，銷售利潤總額為38.7億元人民幣。預計到2006年生物技術工業總產值將達400億到500億元，到2015年總產值可達1100億到1300億元。我國的生物制藥業將進入一個快速發展的階段,生物醫藥工業將成為醫藥產業增長最快的部分。目前,我國許多省市已將生物制藥作為本地的支柱產業重點扶持。一大批生物醫藥科技園相繼在各地高新技術開發區建成。面對入世帶給我國生物制藥業的挑戰和機遇,專家們預測,在未來若干年,我國的生物制藥業將以超過全球平均增長速度步入高速發展軌道,前景十分廣闊。

基因工程藥物的發展概況

20世紀70年代，隨著DNA重組技術的成熟，誕生了基因工程藥物，高產值、高效率的基因藥物給醫藥產業帶來了一場革命，推動了整個醫藥產業的發展，醫藥產業進入了新的歷史時期。基因藥物經歷了三個階段：第一階段是把藥用蛋白基因導入到大腸桿菌等細菌中，通過大腸桿菌等表達藥用蛋白但這類藥物往往有缺陷，人類的基因在低等生物的細菌中往往不表達或表達的蛋白沒有生物活性。第二階段是人們用哺動物的細胞代替細菌，生產第二代基因工程藥物。第三階段是到了80年代中期，隨著基因重組和基因轉移技術的不斷發展和完善，科學家可以將人們所需要的藥用蛋白基因導入到哺乳動物體內，使目的基因在哺乳動物身上表達，從而獲得藥用蛋白。

基因工程技術制藥展望

基因工程技術在醫藥工業中的應用非常廣泛，利用基因工程技術開發藥物已成為當前.最為活躍和迅猛發展的領域。隨著人類基因組計劃的完成，以及基因組學、蛋白質組學、生物信息學等研究的深入，為醫藥生物技術開拓了一個新的領域，基因工程制藥將有更多機會獲得突破性進展，為保障人類健康做出更大的貢獻。

參考文獻：

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第三篇：基因工程藥物教學大綱（范文）

基因工程藥物教學大綱

課程名稱：基因工程藥物

課程編號：0235203 學分：1.5 學時數：28

考核方式：N+2。筆記10%，考試成績占40%，過程成績N占50%。先修課程：生物化學、微生物學、基因工程等。課程說明：專業選修課。

一、課程的性質

基因工程技術, 不僅使整個生命科學的研究發生了前所未有的深刻變化, 而且也給工農業生產和國民經濟發展帶來了巨大的經濟和社會效益, 給人類進步帶來了新的契機。目前，基因工程學正以新的勢頭繼續向前迅猛發展, 成為當今生物科學研究諸領域中最具生命力、最引人注目的前沿學科之一, 特別是基因工程在醫藥生物技術領域中的研究和應用，其意義深遠、潛力之巨大。

二、課程的目的與教學基本要求

課程目的：為了適應生物工程技術的迅速發展、拓寬專業面, 為了使學生對當今世界生物工程領域日新月異地發展的高新技術有更多的了解, 進一步擴大學生的知識面和視野，同時為他們今后從事這方面的工作和研究打下一定理論基礎, 特開設該課程。

課程任務: 通過講授基因工程制藥的概貌及國內外研究進展、基因工程制藥常用的工具酶和克隆載體、基因工程藥物無性繁殖系的組建以及基因工程藥物的生產和質量控制等, 使學生對基因工程的基本理論、基本步驟和操作技術以及基因工程藥物的生產技術原理和方法有比較系統的了解, 初步掌握基因工程制藥有關基本知識。

三、課程適用專業

本課程適用于生物技術專業等相關專業。

四、教學內容、要求與學時分配

第一章 基因工程制藥概述(2學時)

第一節：基因工程的概貌 簡述基因工程的誕生和興起，基因工程的定義、特點與基本步驟，基因工程早期的開創性研究成就，基因工程的應用與發展趨勢等。

第二節：基因工程與生物制藥 簡述基因工程藥物的研究和發展概況，介紹應用基因工程和蛋白質工程技術研究開發的幾種新型基工藥物。

第二章 基因工程制藥常用的工具酶(2學時)

第一節：限制性核酸內切酶 簡述限制酶的發現、限制酶的種類、限制酶的命名和限制酶的特性與用途等。

第二節 DNA連接酶 重點介紹DNA連接酶連接作用的特點，基因工程中常用的連接酶(T4噬菌體DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶)的酶活性和用途，DNA連接酶連接作用的分子機理。

第三節 DNA聚合酶 重點介紹大腸桿菌DNA聚合酶

1、Klenow大片段酶、T4噬菌體DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及、反轉錄酶等的酶活性和用途。

第四節 DNA修飾酶 重點介紹末端脫氧核苷酸轉移酶、堿性磷酸酶、T4噬菌體多核苷酸激酶等的酶活性和用途。

第五節 單鏈核酸內切酶 重點介紹S1核酸酶、Bal31核酸酶等的酶活性和用途。

第三章 基因工程制藥常用的克隆載體(4學時)第一節 質粒載體 內容：質粒的定義、質粒DNA分子的特性、質粒載體的改造及構建。重點介紹基因工程制藥中常用的幾種質粒載體的結構和用途，主要包括pBR322及其衍生栽體、pUC系列載體。

第二節 λ噬菌體載休 內容：λ噬菌體的基本特性、λ噬菌體基因組的結構與功能、λ噬菌體DNA的改造及其載體的構建。重點介紹基因工程制藥中常用的幾種λ噬菌體載體，主要包括 Charon系列載體、EMBL系列載體、λgt系列載體。

第三節 M13噬菌體載體 內容包括：M13噬菌體的基本特性、M13絲狀噬菌體載體的構建、常用的M13噬菌體載體，主要包括M13mp18和M13mp19載體。

第四節 粘粒（Cosmid）載體 內容：粘粒載體的構建、常用的粘粒載體。

第五節 哺乳動物細胞載體系統 主要介紹：SV40載體、BPV載體、EBV病毒載體。

第四章 目的基因的制取(2學時)

第一節 目的基因的化學合成 內容：目的基因的設計, 寡聚核苷酸片段的合成, 寡核苷酸片段的分離和純化, 用寡核苷酸片段組裝目的基因, 化學合成寡核苷酸的其它用途。

第二節 構建基因文庫法分離目的基因 內容：構建基因文庫法分離目的基因的基本步驟, 真核基因組DNA文庫的構建過程

第三節 酶促合成法制取目的基因 內容：真核生揚細胞中的mRNA, 從構建 的cDNA文庫中篩選目的cDNA, RT-PCR法合成目的cDNA。

第五章 目的基因與克隆載體的體外重組(2學時)

第一節 目的基因與質粒載體的連接 內容：粘性末端連接法, 定向克隆法,平末端連接法, 同聚物加尾法, 加人工接頭連接法, 加DNA銜接物連接法, 其它轉換末端形式連接法。

第二節 目的基因與噬菌體載體的連接 內容包括：噬菌體載體臂DNA的制備, 噬菌體載體臂與外源目的DNA片段的連接。

第六章 重組克隆載體引入受體細胞(2學時)

第一節 概述 內容：基因工程的受體細胞, 重組體分子導入受體細胞的途徑。

第二節 重組體DNA分子的轉化或轉染 內容包括：用氯化鈣制備新鮮的感受態細胞轉化法, 用復合劑制備感受態細胞轉化法, 高壓電穿孔轉化法。

第三節 重組噬菌體DNA的體外包裝與轉染 內容：噬菌體體外包裝的基本原理, 噬菌體DNA的體外包裝, 包裝提取物的制備, 重組DNA的體外包裝與感染方法。

第四節 重組克隆載體導入哺乳動物細胞的轉染

第七章 含目的基因重組體的篩選、鑒定與分析(6學時)

第一節 重組體(菌)的篩選 內容：抗生素抗性基因插入失活法, b-半乳糖苷酶 基因插入失活法, 快速細胞破碎與凝膠電泳篩選法, 放射性標記核酸探針雜交篩選法, 免疫化學篩選法。

第二節 重組體的鑒定 內容：酶切及凝膠電泳鑒定法, Southern印跡雜交法, 電鏡R-環檢測法, 基因產物鑒定法。

第三節 重組DNA的序列分析 內容：Sanger雙脫氧鏈終止法DNA測序, Maxam-Gilbert化學修飾法DNA測序。

第八章 目的基因在宿主細胞中的表達(2學時)

第一節 外源目的基因在原核細胞中的表達 內容：原核基因表達載體的構建, 常見的原核細胞表達載體系統, 外源目的基因在原核細胞中的表達形式, 在原核細胞中高效表達目的基因, 基因定點誘變技術。

第二節 外源目的基因在真核細胞中的表達 內容：真核細胞表達載體的功能元件, 酵母菌表達系統, 哺乳動物細胞表達系統。

第九章 基因工程無性繁殖系的組建(2學時)

內容：人胰島素原融合蛋白重組菌的組建, 人a2b型干擾素工程菌的組建, 集落刺激因子工程菌的組建, 白細胞介素融合蛋白工程菌的組建, 乙型肝炎表面抗原重組酵母的組建, 人組織型纖溶酶原激活劑細胞株的組建, 紅細胞生成素CHO細胞株的組建, 人腫瘤壞死因子昆蟲細胞株的組建。

第十章 基因工程藥物的生產(2學時)

第一節 基因工程菌（細胞）的培養與發酵 內容包括：工程細菌的培養與發酵, 工程酵母的培養與發酵, 工程細胞的培養與發酵。

第二節 基因工程藥物的分離純化 內容包括：影響分離純化工藝的主要因素, 各種產物表達形式采用的分離純化方法,。

第三節 基因工程藥物的分離純化實例 內容包括：以包涵體形式表達的rGM-CSF中試分離純化, 以分泌型表達的人a1-干擾素的分離純化, 以可溶性形式表達的rhG-CSF的分離純化, 在酵母中表達的HBsAg的分離純化。

第十一章 基因工程藥物的檢驗(學生自學)

第一節 基因工程藥物的質量控制 內容包括：主要的基因工程藥物, 基因工程藥物的特點, 基因工程藥物的質量要求, 基因工程藥物的質控要點, 基因工程藥物的制造及檢定規程。

第二節 基因工程藥物常用的檢驗方法 內容：化學檢定法, 肽圖分析法，外源性DNA殘留量的測定，宿主細胞蛋白雜質的檢測，無菌試驗，內毒素試驗，異常毒性試驗，熱原質試驗，生物學活性(效價)檢定。

第三節 主要基因工程藥物的檢驗 內容：重組人胰島素的檢驗，重組人生長激素的檢驗，重組人干擾素的檢驗，重組人白細胞介素的檢驗，重組人紅細胞生成素的檢驗，重組人集落刺激因子的檢驗，重組人組織型纖溶酶原激活劑的檢驗, 重組人腫瘤壞死因子的檢驗，重組乙型肝炎疫苗的檢驗。

五、教材和主要參考資料

理論教學教材： 《基因工程》, 楊汝德主編，華南理工大學出版社，2006.8 主要參考教材： 《基因克隆技術在制藥中的應用》, 楊汝德主編，化學工業出版社，2004.1

執筆人：闞勁松

教研室：

系主任審核簽名：

第四篇：基因工程藥物開發利用前景

基因工程藥物開發利用前景

摘 要：生物制藥是以基因工程為基礎的現代生物工程，即利用現代生物技術對DNA進行切割、連接、改造，生產出傳統制藥技術難以獲得的生物藥品。而現代生物技術是以基因為源頭，基因工程和基因組工程為主導技術，與其他高技術相互交叉、滲透的高新技術。比爾·蓋茨預言：下一個首富可能是從事生物技術的投資者。本文簡要分析了國內外基因工程藥物開發的現狀和前景。

以基因工程，細胞工程，發酵工程和酶工程為主體的現代生物技術是70年代開始異軍突起的高新技術領域，近一，二十年來發展極為神速，它與微電子技術，新材料和新能源技術并列為影響未來國計民生的四大科學技術支柱，被認為是21世紀世界科學技術的核心。現代生物技術又是一項與醫藥產業結合極為密切的高新技術，它的發展已帶給了某些醫學基礎學科的革命性變化，并給醫藥工業開辟了更為廣闊的心領域。

自1982年全世界第一個基因重組醫藥產品“人胰島素”在美國面市以來，至今已有數十個生物技術藥物上市。現代生物技術開辟了人體內源性多肽，蛋白質藥物的新天地。于此同時它也正滲透到傳統醫藥的哥哥領域，以抗生素，氨基酸，細胞融合及基因工程菌，化學合成藥物的生物轉化性，到單克隆抗體靶向制劑等等。不久之前美國的Eli Lilly公司又提出了生物技術在醫藥上的更大應用，是在新藥研究篩選方法上的革命，即用基因工程受體實驗代替傳統的動物實驗，所有這一切都表明了醫藥產業的技術基礎正在發生戰略性的變革。世界各大醫藥企業已瞅準目標，紛紛投入巨資圍繞以現代生物技術為核心的產品和技術結構開拓，展開了面向21世紀的空前激烈的競爭。基因藥物的前沿技術及部分基因藥物

基因藥物的直接體內基因治療發展迅速,新型基因藥物不斷產生。現著重介紹對效果比較肯定關于基因藥物的幾項前沿技術，基因疫苗、反義RNA 藥物、三鏈DNA 藥物這三種新型基因藥物技術的基本方法。1.1基因疫苗

基因疫苗的免疫方法即基因疫苗的給藥途徑,目前使用的方法有以下幾種:（1）裸DNA 直接注射:將裸質粒DNA 直接注射到機體的肌肉、皮內、皮下、粘膜、靜脈內。這種方法簡單易行。

（2）脂質體包裹DNA 直接注射:包裹DNA 的脂質體能與組織細胞發生膜融合,而將DNA 攝入,減少了核酸酶對DNA 的破壞。注射途徑同裸DNA直接注射。

（3）金包被DNA 基因槍轟擊法:將質粒DNA 包被在金微粒子表面,用基因槍使包被DNA 的金微粒子高速穿入組織細胞.。

（4）繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA 法:選擇一種容易進入某組織器官的細菌,將其繁殖基因去掉,然后用質粒DNA 轉化細菌,當這些細菌進入某組織器官后,由于不能繁殖,則自身裂解而釋放出質粒DNA。1.2反義RNA 反義RNA 指與mRNA 互補后,能抑制與疾病發生直接相關基因的表達的RNA。它封閉基因表達,具有特異性強、操作簡單的特點,可用來治療由基因突變或過度表達導致的疾病和嚴重感染性疾病,反義RNA 治療的基本方法有： 1)反義寡核苷酸：體外合成十至幾十個核苷酸的反義寡核苷酸或反義硫代磷酸酯寡核苷酸序列,用脂質體等將反義寡核苷酸導入體內靶細胞,然后反義寡核苷酸與相應mRNA特異性結合,從而阻斷mRNA 的翻譯。

2)反義RNA表達載體:合成或PCR 擴增獲取反義RNA 的DNA ,將它克隆到表達載體,然后

將表達載體用脂質體導入靶細胞, 該DNA 轉錄反義RNA ,反義RNA 即與相應的mRNA 特異性結合,同樣阻斷某基因的翻譯。

反義RNA目前主要用于惡性腫瘤、病毒感染性疾病等。有報導，用反義封閉胰腺癌、肺癌的癌基因，對癌細胞具有明顯的抑制作用。1.3三鏈DNA 脫氧寡核苷酸能與雙螺旋雙鏈DNA 專一性序列結合,形成三鏈DNA ,來阻止基因轉錄或DNA 復制,此脫氧寡核苷酸被稱為三鏈DNA 形成脫氧寡核苷酸(TFO)。為了與作用在mRNA 翻譯水平的反義RNA 的反義技術相區別,將三鏈DNA 技術稱之為反基因技術。

基本方法與機理

設計合成15～40個堿基的脫氧寡核苷酸, 這些序列具有較短而兼并性較高的特點, 與雙鏈DNA結合,通常結合在蛋白識別位點處,形成三鏈DNA ,干擾DNA與蛋白質的結合, 如轉錄激活因子, 從而阻止基因的轉錄與復制。1.4部分基因藥物

生物技術的開發迅猛異常、日新月異。生物技術的核心是基因工程, 基因工程技術 最成功的是用于生物治療的新型藥物的研制。已有近50 種基因工程藥物投入市場, 產生 了巨大的社會效益和經濟效益。生物技術用于疾病的預防和疑難病癥的治療已經成為現 實。基因藥物主要為以下幾個系列：

（1）干擾素系列(IFN)IFN是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，僅在同種細胞上可發揮作用。根據其來源、理化及生物學性質的不同，可分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ 3種干擾素。干擾素具有很強的生物活性，主要表現在：

①抗病毒作用 目前慢性丙型肝炎的治療以IFN-α為首選。②抗腫瘤作用。③免疫調節作用。

（2）白介素系列 白細胞介素是非常重要的細胞因子家族，現在得到承認的成員已達15個；它們在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調節等一系列過程中均發揮重要作用，此外它們還參與機體的多種生理及病理反應。

（3）集落刺激因子類藥物(CSF)一些細胞因子可刺激不同的造血干細胞在半固體培養基中形成細胞集落，這些因子被命名為集落刺激因子，根據其作用對象，進一步命名分為粒細胞-CSF，巨噬細胞-CSF，粒細胞和巨噬細胞-CSF及多集落刺激因子。

（4）其他基因工程藥物

①促進紅細胞生成素 促紅細胞生成素(Epo)是一種調節紅細胞生成的體液因子，自從成功地克隆人類Epo基因后，其產物重組人促紅細胞生成素被成功用于治療腎性貧血及腫瘤等疾病伴發的貧血。最近的研究認為Epo是一種由缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor，HIF)家庭誘導產生的多功能細胞因子超家庭成員，對于多種器官都有保護作用。有報導，Epo能通過降低腎IRI時MDA、IL-6水平，增加SOD水平從而發揮保護作用，而最新研究還表明Epo有促進血管生成的作用。

②人生長激素人類的生長激素(Growth hormone，GH)是一條單鏈、非糖化、191個氨基酸合成的親水性球蛋白，分子量21700Da，等電點pI為4.9.人生長激素具有促生長、促進蛋白質合成、對脂肪、糖、能量代謝有影響。

③人表皮生長因子 皮膚細胞表達10種以上的生長因子，它們以自分泌和旁分泌的方式對細胞自身和鄰近細胞進行多種調節。

④重組鏈激酶 對心腦血管疾病有一定的療效。

⑤腫瘤壞死因子 研究表明，巨噬細胞是產生TNF的主要來源。當肝、脾等網狀內皮系統受到刺激后，借助于脂多糖的幫助，TNF基因開始轉錄，產生并釋放TNF。同時B淋巴細胞也

產生一種與TNF類似的淋巴毒素，并與TNF享有共同受體。為了便于區分二者，將巨噬細胞產生的毒素稱為TNF—α，淋巴細胞產生的毒素稱為TNF-β。

TNF-α是迄今為止發現的抗腫瘤作用最強的細胞因子，它能特異性地直接殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞無不良影響，能抑制腫瘤細胞的增殖并促使其溶解，還可激活機體的抗腫瘤免疫反應。但是由于TNF-α能被腎快速排泄和各種蛋白酶分解作用，在體內很不穩定，半衰期很短(15～30min)，而殺傷腫瘤細胞需要12～36 h。若希望通過靜脈給藥獲得明顯的抗腫瘤效果，則必須頻繁大劑量注射，進而導致嚴重的不良反應。目前國內外學者對其的制劑研究主要集中在高分子化學修飾和藥物載體傳遞系統兩方面．無論采取何種手段，其最終目的有二：一是減少RES的攝取，延長藥物血中半衰期；二是提高藥物的靶向性，降低不良反應.國外基因工程藥物研究開發現狀和展望

據不完全統計，歐美諸國目前已經上市的基因工程藥物近100 種，還有約300 種藥物正在臨床試驗階段，處于研究和開發中的品種約2 000 個。近兩年基因藥物上市的周期明顯縮短，與一般藥物研究開發相比，基因工程藥物研究投入較大。

美國作為基因重組技術的發源地和眾多基因工程藥物的第一制造者，每年在基因工程藥物研究方面的投資高達數十億美元，現已成為國際公認的現代生物技術研究和開發的“帶頭羊”。日本，歐洲等地也不甘落后，都根據各自的特點，制定出符合本國國情的發展戰略和對策，進行著激烈的競爭和角逐，就連亞洲的韓國，新加坡等也野心勃勃地著手這方面的研究和開發。

美國：在基因工程藥物的研究和開發方面美國一直保持著世界領先地位。從1971年成立第一家美國生物技術公司到現在已形成擁有1300余家公司（占全世界生物技術公司總數的2/3的令人注目的產業規模，不過短短25年的歷史，到1996年8月美國有20多種基因工程藥物和疫苗上市。（詳見表1）另有113家美國公司的284個產品處于臨床試驗階段或等待FDA批準，呈現了強勁的發展勢頭。

日本：日本在基因工程藥品的研究和開發方面也投入了大量資金，并取得了豐碩成果。現已開發出干擾素，乙肝疫苗，人促紅細胞生產素，組織纖溶酶原激活劑，人生長激素，人胰島素，人巨噬細胞集落刺激因子，人粒細胞集落刺激因子等眾多產品。國內基因工程藥物研究開發現狀及展望

我國生物工程藥物研究雖起步較晚，基礎較差，但一開始就受到黨和國家的高度重視。為跟蹤世界新技術革命迅猛發展的浪潮，1986年3月我國一批著名科學家倡導起草了“高技術研究計劃”——“863計劃”，并將現代生物技術列為“863計劃”最優先發展的項目和國家“七五”，“八五”攻關項目。經過廣大科技工作者的艱苦努力，已取得了鼓舞人心的進展，一批基因工程產品的上游研究正在努力展開；一些產品正逐步進入開發研究階段，不少產品已步入臨床試驗階段或已獲新藥證書，進入工業化生產，詳見表2。

與傳統制藥相比，生物制藥有便于大規模生產、利潤高、生產工藝簡單、人力投入少、無污染、生產周期短等優點，因此，隨著人類基因組計劃的實施和科技水平的進一步發展，基因藥物在醫藥市場的比例也將會日益提升，也將越來越影響人類的生活。

基因藥物同時具有高投入、高收益、高風險、長周期的特征。Frost&Sullivan公司的一份最新報告指出，2004年，全球生物制藥市場的收入為450億美元。到2011年，其有望達到982億美元。據預測，全球第一個用轉基因植物生產的生物藥物可望于2005～2006年上市。隨著公眾認知度的提高和相關法規的逐步完善，用轉基因植物生產生物藥物的市場將飛速增長，到2011年，單美國市場就將達到22億美元。2002年底到2003年5月間一場突如其來的SARS疫情，再加上2005禽流感病毒傳播，席卷了亞洲及加拿大等地。在緊張而又嚴肅的應對

這場疫情的過程中，生物制藥又成為醫藥行業人士關注的焦點。

我國生物制品需求巨大，過去的幾年我國企業一直能保持年均15％以上增幅，并且近年來銷售的增長速度有加快的趨勢。據統計，2005年國內生物制品銷售收入總額為157．4億元人民幣，銷售利潤總額為38.7億元人民幣。預計到2006年生物技術工業總產值將達400億到500億元，到2015年總產值可達1100億到1300億元。我國的生物制藥業將進入一個快速發展的階段,生物醫藥工業將成為醫藥產業增長最快的部分。目前,我國許多省市已將生物制藥作為本地的支柱產業重點扶持。一大批生物醫藥科技園相繼在各地高新技術開發區建成。面對入世帶給我國生物制藥業的挑戰和機遇,專家們預測,在未來若干年,我國的生物制藥業將以超過全球平均增長速度步入高速發展軌道,前景十分廣闊。

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第五篇：基因工程及其應用說課稿

《基因工程及其應用》說課稿

一、說教材

1．教材的地位和作用

《基因工程及其應用》是人教版生物必修2第六章第二節內容。本節的教學內容是在學生對基因有一定的理解的基礎上，引入基因工程，讓學生了解基因工程在生活中的運用，激發學生的求知欲。在教學內容的組織上體現了學科內在邏輯性與學生認識規律的統一。這一節主要講述了基因工程的原理、基因工程 的應用以及轉基因生物和轉基因食品的安全性三個 方面的內容。基因工程的原理既是學生進入高中以來第一次接 觸到的生物工程方面的內容。為了避免與《現代生物科 技專題》模塊中基因工程的內容重復，教材沒有過 多地展開介紹。其地位更是由《課程標準》上的了解層次上升為 《考試說明》上的理解層次，其重要性顯而易見。

2.教學目標

根據本教材結構和內容分析，結合著學生的認知結構及其心理特征，我制定了以下的教學目標：

(1)、知識目標：掌握基因工程的概念、原理及安全性問題；基因操作的工具及其操作過程。

(2)、能力目標：培養學生分析、推理、歸納、總結的能力。

(3)、情感目標：培養學生實事求是的科學態度，從微觀到宏觀，從現象到本質的科學的研究方法；培養學生嚴謹的學習態度和思維習慣。

3.說教學的重、難點

本著高二新課程標準和考試大綱，在吃透教材基礎上，我確定了以下教學重點和難點(1)、教學重點

基因工程的基本原理及安全性問題、基因操作的工具，基本步驟及其應用。(2)、教學難點

基因工程的基本原理，基因工程的應用及其安全性。

4.課程資源的開發及有機整合：本節課安排2課時，應當充分利用學生已有的知識經驗和網絡條件學習本課知識。

二、說學法：本節課的授課對象是高二的學生，此年齡段的學生求知欲望強，因為本節知識難度不是很大，學生將通過多種途徑，如：觀察、閱讀、思考、分析、討論、實踐等等，來開展學生之間的協作學習和自主學習，形成以學生為主體的教學模式。

三、說教法

圍繞本節課的教學目標、教學重點和學生情況的分析，采用了觀察法、演示法、討論法、實踐法等多種教學方法，積極創設一個可以讓學生在輕松愉快的氛圍中，去主動探求知識的過程。在教學過程中，開展師生互動、生生互動，體現出以學生為主體，教師為主導的主動探究式教學理念。

四、說教學過程

在這節課的教學過程中，我注重突出重點，條理清晰，緊湊合理。各項活動的安排也注重互動、交流，最大限度的調動學生參與課堂的積極性、主動性。

1、導入新課： 提問：各種生物間的性狀千差萬別這是為什么呢?

引導：生物體的不同性狀是通過基因特異性表達而形成的。

列舉：幾種生物的不同性狀：蠶吐出絲；豆科植物的根瘤菌能夠固定空氣中的氮氣；青霉菌能產生對人類有用的抗生素——青霉素。

提問：人類能不能改造性狀？能不能使本身沒有某個性狀的生物具有某個特定性狀呢？ 引導：讓禾本科植物能夠固定空氣中的氮氣；能否讓細菌“吐出”蠶絲；讓微生物生產出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物。（這種設想能實現嗎？）定向改造生物的新技術——基因工程。

2、講授新課：（1）基因工程的原理

指導學生閱讀教材P102頁第二段，通過提問的方式指導學生找出概念中的關鍵詞語，并讓學生理解基因工程概念，引導學生獨立完成。最后歸納列表，便于學生的記憶。概念：在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內表達，產生出所需要的基因產物。（2）基因操作的工具

利用多媒體課件演示抗蟲棉培育過程示意圖，同時提出討論問題，進行分組討論，最后交流討論結果，教師進行歸納總結。

思考：在以上的基因工程培育的過程中，關鍵步驟或難點是什么？

引導：關鍵步驟的完成過程中都要用到基因操作工具，并使學生形象地記憶“工具”的作用。A基因的剪刀——限制性內切酶（簡稱限制酶）。

要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性未端 B基因的針線——DNA連接酶

用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要連接幾個磷酸二酯鍵？

限制酶切一個特定基因要切斷幾個磷酸二酯鍵？ C基困的運輸工具——運載體

大家一起思考下這些工具到底怎樣操作才能完成基因工程的過程呢？ 思考題： 簡要歸納基因工程操作的基本步驟和大致過程。

啟發學生思考：想像科學家在分子水平上進行這一操作的精確性。

(3)基因工程的應用。

學生閱讀教科書P.104的內容。教師總結，并從具體事例引入關于轉基因生物和轉基因食品安全性的爭議，啟發學生對其安全性問題進行討論。

3、課堂小結，強化認識。

復習基因工程操作的基本步驟和重要工具，完成課后習題

4、板書設計 基因工程操作的基本步驟： 剪切→拼接→導入→表達

結束語：

本節課設置了一系列問題情境，層層設問，在學生答問、質疑、討論過程中讓學生建構新概念和新的知識體系，并通過教師及時掌握反饋信息，適時點撥、調節，讓學生在推理判斷中培養良好的思維習慣和對知識的遷移能力，而且通過留出一定的時間讓學生提問，體現了以學生為主體的思想。我的說課完畢，謝謝大家。