第一篇：基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與抽提

基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與抽提

摘要....................................................................................................................................................Ⅰ Abstract............................................................................................................................................Ⅱ 引言.......................................................................................................................................................1 1 材料與儀器、用品.........................................................................................................................2 2 原理與方法......................................................................................................................................3

2.1 獲取目的基因.......................................................................................................................3

2.1.1提取RNA.................................................................................................................3 2.1.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA............................................................................................3 2.1.3 聚合酶鏈式反應(yīng)......................................................................................................4 2.2 回收目的基因.......................................................................................................................5

2.2.1 核酸電泳....................................................................................................................5 2.2.2 膠回收........................................................................................................................6 2.3 DNA分子體外連接.............................................................................................................7 2.4 轉(zhuǎn)化.......................................................................................................................................7 2.5 抽提鑒定質(zhì)粒.......................................................................................................................8 3 討論...............................................................................................................................................10 3.1試劑.....................................................................................................................................11 3.2 核酸酶................................................................................................................................11 3.3 核酸電泳緩沖液...............................................................................................................11 3.4 膠回收效率........................................................................................................................11 3.5 DNA酶切位點..................................................................................................................11 3.6 轉(zhuǎn)化效率............................................................................................................................11 3.7 試劑盒................................................................................................................................12 參考文獻...........................................................................................................................................13 致謝....................................................................................................................錯誤！未定義書簽。附錄....................................................................................................................................................14

Contents Chinese Abstract............................................................................................................................Ⅰ Abstract.........................................................................................................................................Ⅱ Preface.............................................................................................................................................1 1 Materials and equipment, supplies...............................................................................................2 2 The principle and method.............................................................................................................2 2.1 Acquire target gene...............................................................................................................2 2.1.1 Extraction of RNA........................................................................................................2 2.1.2 RNA transcription for cDNA.........................................................................................3 2.1.3 Polymerase chain reaction..............................................................................................3 2.2 Recycling target gene............................................................................................................5 2.2.1 Nucleic acid electrophoresis...........................................................................................5 2.2.2 Plastic recycling.............................................................................................................4 2.3 Connection of DNA molecules in vitro.................................................................................5 2.4 Transformation......................................................................................................................2.5 Extraction and identification of plasmid...............................................................................6 3 Disguss.......................................................................................................................................10

3.1 Reagent................................................................................................................................11

3.2 Nuclease..............................................................................................................................11

3.3 The nucleic acid electrophoresis buffer...............................................................................11

3.4 Efficiency of plastic recycling.............................................................................................11

3.5 DNA enzyme loci................................................................................................................11

3.6 The efficiency of conversion...............................................................................................11

3.7 Kit........................................................................................................................................12 References.....................................................................................................................................10 Acknowledgement.........................................................................................................................10 Appendix.......................................................................................................................................10

引言

自噬是一種實現(xiàn)細胞本身代謝需要和某些細胞器更新的生命活動，該活動對于動物機體生長發(fā)育具有重要意義。自噬相關(guān)基因LC3通過與細菌質(zhì)粒結(jié)合可以大量復(fù)制。質(zhì)粒存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。不同微管之間的差異，主要與結(jié)合于微管的非微管結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)，它們參與微管結(jié)構(gòu)的組裝，維持微管的穩(wěn)定LC3和微管與其他骨架纖維之間的連接，表現(xiàn)為廣泛的功能性作用，該類蛋白被統(tǒng)稱為微管相關(guān)蛋白，LC3即微管相關(guān)蛋白輕鏈3，作為動物機體的一個自噬相關(guān)基因，對于其自噬活動相關(guān)微管蛋白質(zhì)表達具有重要意義，目前國內(nèi)外對該基因研究逐步增多、不斷深入。Vega-Naredo等研究表明LC3 調(diào)控對巨噬過程是至關(guān)重要的,因為蛋白質(zhì)LC3-II定位自噬前體和自噬小體,它被認為是一個自噬標記，在其對兩性哈德氏腺的實驗中，免疫印跡分析顯示了LC3-I和LC3-II兩個對應(yīng)波段[1]；Hanqing Dong等的發(fā)現(xiàn)表明,LC3 結(jié)合可能發(fā)生在脂滴表面,導(dǎo)致限制膜形成，在原位分隔脂滴的一部分，其他脂滴的候選識別是脂滴-相關(guān)蛋白質(zhì)；Noboru Mizushima和Masaaki Komatsu的文章敘述了選擇性自噬最有特性的基質(zhì)是p62,它也被稱為死骨片1 / SQSTM1，p62是廣泛表達的細胞蛋白質(zhì),在動物中守恒,但在植物和真菌不是，在分隔膜中通過LC3-作用區(qū)域p62直接與LC3相互作用[3]。此次實習(xí)實驗過程中，將該基因作為目的基因，采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建重組基因，并提取出目的基因。提取出的目的基因可成為相關(guān)研究、實驗的組成環(huán)節(jié)，例如用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)檢驗，以及動物機體蛋白質(zhì)表達控制研究、自噬研究等。

質(zhì)粒是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子，即細胞附殖粒、又稱胞附殖粒。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型，它存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中，總體多為原核生物。構(gòu)建重組質(zhì)粒指將目的基因，即外源基因，與具有自主復(fù)制能力的載體在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，隨后抽提質(zhì)粒可以將目的基因與細菌DNA分離，以獲得高純度的目的基因。筆者通過實驗學(xué)習(xí)、實際動手操作，完成了此質(zhì)粒的構(gòu)建和抽提過程，并在文中闡述了獲取目的基因后而進行的LC3基因克隆過程，其中使用GFP、RFP載體構(gòu)建質(zhì)粒。基因克隆又稱為分子克隆，指采用重組DNA技術(shù)，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子的過程。其是七十年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術(shù)，可簡要敘述為分、切、連、轉(zhuǎn)、選五個步驟。其最終目的在于通過相應(yīng)技術(shù)手段，將目的基因?qū)爰闹骷毎谒拗骷毎麅?nèi)目的基因被大量的復(fù)制，即把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來，構(gòu)成了一個重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細菌中，建立基因克隆體系。本實驗構(gòu)建含GFP-RFP-LC3基因的重組質(zhì)粒，GFP、RFP分別為綠色和紅色熒光基因；使用的T載體為克隆載體，符合基因工程的載體應(yīng)具有的基本性質(zhì)，包括在宿主細胞中有獨立的復(fù)制和表達的能力，使外源重組的DNA片段得以擴增；分子量小，利于在宿主細胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA片段，且在實驗操作中也不易被機械剪切而破

[2]

壞；載體分子中具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記，以賦予宿主細胞的不同表型特征；載體具有較多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。

細胞中的RNA可分為信使RNA、轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取實質(zhì)就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純RNA產(chǎn)物的過程，目前，國內(nèi)外提取RNA的技術(shù)均比較成熟，生產(chǎn)出的有關(guān)試劑盒利用分子量比較大的有機溶劑氯仿使有機相和無機相迅速分離，初步獲取RNA，并進一步分離純化。提取RNA后將其反轉(zhuǎn)錄并擴增，即可獲得用于重組質(zhì)粒的目的基因。重組質(zhì)粒過程中利用了聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、瓊脂糖凝膠電泳等方法。聚合酶鏈式反應(yīng)是利用DNA片段旁側(cè)兩個短的單鏈引物，在體外快速擴增特異DNA片段的技術(shù)，它應(yīng)用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過雙鏈DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復(fù)循環(huán)，DNA片段以指數(shù)方式增加了百萬倍。從非常微量的DNA甚至單個細胞所含有的DNA起始，可產(chǎn)生微克量的PCR產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂凝膠作為支持物，利用核酸分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達到分離混合物的目的。重組質(zhì)粒構(gòu)建后，使用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒抽提質(zhì)粒，本實驗采取的離心法抽提質(zhì)粒，即去除 RNA，將質(zhì)粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。最后將得到的質(zhì)粒送至有關(guān)生物公司測序，測序結(jié)果分析表明，目的基因片段存在于送檢樣品中，說明實驗成功構(gòu)建并獲取了鴨RFP-GFP-LC3重組質(zhì)粒。材料與儀器、用品

鴨肝臟組織，液氮，75%酒精，無水乙醇，氯仿，蒸餾水，普通雙蒸水，瓊脂糖，50倍濃度商品化TAE，2000bpDNA標準參照物（Marker），填充劑（Loading）,氨芐霉素，LB培養(yǎng)液，E.coli DH5a 菌株。

美國Omega RNA提取試劑盒，包含HiBin微型制備管，2毫升收集管，RNA-Solv試劑，RNA Wash 緩沖液 I，RNA Wash 緩沖液 II，DEPC水等。

AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒，試劑盒中的試劑包括小量制備 制備管, 2毫升 微量離心管,1.5毫升 微量離心管, RNA酶 A, 緩沖液 S1, 緩沖液 S2,緩沖液 S3,緩沖液 W1, 緩沖液 W2 濃縮液，Eluent洗脫液。

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，試劑盒中試劑包括緩沖液 W1，緩沖液 W2濃縮液，緩沖液 DE-A，緩沖液 DE-B，Eluent洗脫液。

RNA引物混合液，包含模版RNA，隨機引物，無RNA酶雙蒸水等。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，包含模版RNA引物變性溶液，隨機引物，5倍濃度M-MLV 緩沖液，dNTP混合物，RNA酶抑制劑，RNA酶M-MLV，無RNA酶雙蒸水。

一次性口罩，一次性手套，實驗工作服，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，制冰機，研缽，移液器，槍頭，無DNA酶和RNA酶的收集管，1.5毫升收集管，2毫升收集管,制備管，離心機，恒溫水浴鍋，振蕩器，冰盒，酒精燈，蒸餾設(shè)備和用品（50毫升燒杯，蒸餾頭，100℃溫度計，冷凝管，接引管，三角瓶，鐵夾，鐵環(huán)，酒精燈，沸石，50m量筒，鐵架臺），PE管，PCR儀，錐形瓶，微波爐，水平電泳槽，電泳儀，電泳儀電源，記號筆，衛(wèi)生紙，玻璃涂棒。原理與方法

2.1 獲取目的基因 2.1.1提取RNA RNA提取的原理就是將細胞破碎裂解，利用一些試劑去除多糖、酚類、蛋白和DNA的污染，通過一系列的抽提、洗滌和沉淀，最終得到純凈的RNA的過程。影響RNA提取質(zhì)量的因素有很多，尤其是RNA酶的污染。RNA酶無處不在，包括破碎細胞內(nèi)的RNA酶,實驗室空氣、實驗臺上的酶，實驗所用試劑中的酶,實驗人員身上攜帶的酶以及實驗器材的污染等等，而且RNA酶性質(zhì)穩(wěn)定，實驗室很難做到完全隔離這個酶的作用[4]。RNA提取試劑盒的通病就是A260/A230普遍偏低，主要是因為RNA樣品中易殘留RNA酶的變性劑異硫氰酸胍和β-巰基乙醇，細胞裂解不徹底，導(dǎo)致核糖核酸不能完全釋放出來。另外，有些細菌的細胞壁堅韌，一般溫和的破壁方法很難將其完全破碎，降低了核糖核酸的量[5]。

本實驗使用美國Omega RNA提取試劑盒。實驗前，酒精充分消毒實驗臺、實驗室空氣，戴棉手套取適量液氮置于保溫瓶中，將用酒精沖洗過的研缽泡入液氮中，同時將鴨的肝組織泡入液氮中，待兩者充分冷凍，在研缽中研碎鴨肝組織。

操作步驟包括取適量組織粉末置于無DNA酶和RNA酶的收集管中，離心，5000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，4℃。加1毫升RNA-Solv試劑，振蕩混勻，室溫孵化3分鐘。加0.2 毫升氯仿（每1 毫升 RNA-Solv與組織混合液加0.2 毫升氯仿），蓋好管蓋，用手劇烈振蕩15秒，冰上孵育10分鐘。隨后4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，離心后混合物分三層，RNA存在于最上層水相。將五分之四的RNA水層置于新的收集管，加三分之一收集管的無水乙醇。輕微混勻并離心后，小心吸出不大于700 微升的上層RNA水層液體于無RNA酶的制備管中，振蕩混勻沉淀，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。重復(fù)上一步驟，再次離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。將制備管置于新的2毫升收集管，加400微升RNA Wash 緩沖液 I，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。用同一收集管，加500微升RNA Wash 緩沖液 II，離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液，隨后用空收集管離心，13000轉(zhuǎn)/分鐘，2分鐘，20℃，完全干燥。干燥可使用的方法亦有用移液器將離心管內(nèi)殘余的液體吸出，打開管蓋，將沉淀于超凈臺上晾5分鐘；或?qū)⒀b有沉淀的管子蓋緊蓋子后，放進一次性手套中，然后打開管蓋，稍微包扎手套后，于50°C烘箱中放置3分鐘。最后洗提RNA，將制備管置于新的1.5毫升收集管，加入40微升的DEPC水，確保加入到制備管中央，隨后室溫靜置2分鐘，離心，13000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，20℃。得到的RNA保存在超低溫冰箱。2.1.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板,通過反轉(zhuǎn)錄酶催化,以dNTP為原料，合成DNA的過程，是DNA

生物合成的一種特殊方式。反轉(zhuǎn)錄過程由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶，即以RNA為模板催化DNA鏈的合成，合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA（cDNA）。反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3′末端上，按磷酸到五碳糖(5'-3')的方向方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過程[

6、7]。

操作步驟包括收集管中配制模版RNA引物混合液，為6微升體系，包含模版RNA2微升，隨機引物1微升，無RNA酶雙蒸水3微升。70℃保溫10分鐘后迅速在冰上急冷2分鐘以上。離心數(shù)秒種使模版RNA引物的變性溶液聚集于收集管底部。在收集管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，為10微升體系，包含上述模版RNA引物變性溶液6微升，隨機引物1微升，5倍濃度M-MLV 緩沖液2微升,dNTP混合物0.5微升，RNA酶抑制劑0.25微升，RNA酶M-MLV0.5微升，無RNA酶雙蒸水0.75微升。因為本實驗使用隨機引物，所以先于30℃恒溫水浴鍋保溫10分鐘，然后42℃保溫60分鐘。70℃保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA做好標記并保存于超低溫冰箱。2.1.3 聚合酶鏈式反應(yīng)

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，它的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加[8]。聚合酶鏈式反應(yīng)是利用DNA在體外95℃高溫時變性會變成單鏈，低溫(經(jīng)常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制以得到多量脫氧核糖核酸[

9、10]。

本實驗第一次聚合酶鏈式反應(yīng)是用兩對引物分別擴增cDNA為DNA,目的是判斷哪一對引物擴增效果好，選擇其進行DNA擴增。準備步驟包括制作雙蒸水，首先取蒸餾水200 微升，于超凈臺點燃酒精燈，安裝設(shè)備對蒸餾水再次蒸餾，PE管分裝后放置于-20℃保存，注意操作完成后用酒精棉擦拭雙手，禁用雙手觸碰PE管口。RNA引物獲取，是將目的基因送至博士生物公司，由其進行引物的設(shè)計與合成；合成的引物經(jīng)過真空冷凍干燥，呈薄膜狀附在離心管中，盛有引物的離心管經(jīng)過離心后開啟，隨后加入規(guī)定量的雙蒸水合上管蓋充分振蕩使其溶解，備用。

操作步驟包括準備四個PE管，并分別標記為1-

1、1-

2、2-

1、2-2，將兩對引物分別加入兩個模版中，配制25微升體系，每管加入r-Tag酶12.5微升，上下游引物各0.25微升，dNTP1微升,模版3微升，雙蒸水11微升。將所有PE管振蕩，并瞬時離心一次，使管壁沒有殘留混合液，隨后擺到雙面板上；使用PCR擴增儀進行RNA擴增，打開電源開關(guān)，設(shè)置運行條件為94℃、5分鐘，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分鐘,72℃、10分鐘，4℃、保存時長，循環(huán)30次。

2.2 回收目的基因

2.2.1 核酸電泳

核酸電泳，其中利用了瓊脂糖凝膠，瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然后倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度[11]。將凝膠置電場中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網(wǎng)孔向陽極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構(gòu)象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩沖液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當(dāng)時間后，大小、構(gòu)象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA[12]，一般來說，需要分離的目的基因片段越大，瓊脂糖濃度越小，凝膠密度越小，反之亦然。樣品加入量加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散。每孔點樣的體積一般少于25微升，吸取每一個樣品時，操作需謹慎，沒有顏色的樣品需要加入填充劑。另外，電泳系統(tǒng)須加入適宜DNA標準參照物進行判定，過大或過小的標準參照物姐不利于判定結(jié)果。

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳準備步驟包括核酸用瓊脂糖凝膠制作，配制1%的瓊脂糖凝膠，首先稱取1.000g瓊脂糖加入錐形瓶中，倒入100毫升電泳緩沖液TAE(50倍濃度TAE20毫升加1升水，混勻)，搖晃混勻后用封口膜封住瓶口后在微波爐內(nèi)加熱兩三分鐘，在水龍頭上沖涼冷卻至60℃左右后加入10微升EB替代染料，在此過程中注意自身防護。同時用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子，將配好的瓊脂糖凝膠液體倒入電泳槽，凝固約20分鐘。溶解的凝膠應(yīng)及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊，倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。

將完全凝固的瓊脂糖凝膠放置在加有緩沖液的電泳槽，緩沖液一定要沒過凝膠，由負極到正極電泳；瓊脂糖加樣時用移液搶將樣品加至點樣孔，動作穩(wěn)重注意不要戳破凝膠導(dǎo)致濾液，點樣是每孔加50微升樣品混合液，標準參照物加10微升；接通電泳儀電源，調(diào)節(jié)電流為120A，電壓為120V，開始電泳；約20分鐘后樣品跑到五分之四凝膠寬度，取出電泳膠，觀察結(jié)果，以確定擴增目的基因引物為第一對或第二對(圖1)。

圖1 引物選擇PCR結(jié)果

Figure 1 The result of PCR for primer choice 2.2.2 膠回收

cDNA擴增引物選擇結(jié)果顯示引物2的擴增效果較引物1好，因此選擇引物2進行目的基因擴增。加入第二對引物進行第二次的聚合酶鏈式反應(yīng)擴增DNA并回收產(chǎn)物，擴增使用高保真的連接酶。配制50微升體系，每管加入緩沖液15微升，高保真酶La Tag0.3微升，上下游引物各1.2微升，dNTP5微升,模版3微升，雙蒸水24.3微升，隨后將PE管振蕩，并瞬時離心一次，使管壁沒有殘留；使用PCR擴增儀進行RNA擴增，運行條件為94℃、5分鐘，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分鐘,72℃、10分鐘，10℃、保存時長，循環(huán)40次。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，配膠過程同上，點樣時，每孔加50微升樣品混合液和5微升Loading，然后接通電泳儀電源，調(diào)節(jié)電流為120Ma，電壓為120V，開始電泳。約20分鐘跑膠完成，觀察結(jié)果（圖2）。為對瓊脂糖凝膠電泳的某一核酸條帶做進一步分析，可對DNA進行膠回收

[

13、14]。

圖2 cDNA擴增結(jié)果

Figure 2 cDNA amplification results 本實驗使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒對目的片段切膠回收。準備步驟包括緩沖液 W2濃縮液中加入一定體積的無水乙醇，原因是此為第一次使用凝膠回收試劑盒。準備無核酸或核酸酶污染的Tip頭、離心管。準備75℃水浴。試用前，檢查緩沖液 DE-B是否出現(xiàn)沉淀，如出現(xiàn)應(yīng)于70℃水浴加熱并溶解。

操作步驟包括戴上防護帽在紫外燈下切下含有目的基因的DNA的瓊脂凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎，計算凝膠重量，用加入凝膠后稱量重量減去提前記錄的1.5毫升離心管重量，該重量作為一個凝膠體積。加入3個凝膠體積的緩沖液 DE-A，混合均勻后于75℃加熱，每而兩三分鐘間斷混合，直至凝膠完全融化。加0.5個緩沖液 DE-A體積的緩沖液 DE-B，混合均勻。吸取上一步中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管，制備管置于2毫升離心管，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，加500毫升 緩沖液 W1，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，加700毫升 緩沖液 W2，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。以同樣的方法加700毫升緩沖液 W2洗滌一次，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，棄去濾液。將制備管置于潔凈的1.5毫升離心管中，在制備膜中央加30微升 Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘，離心，12000轉(zhuǎn)/分鐘，1分鐘，洗脫DNA。得到的DNA保存至超低溫冰箱。2.3 DNA分子體外連接

本實驗采用卡那霉素抗性T載體連接，此步驟即重組DNA分子，為目的基因?qū)爰毦毎?fù)制的必要條件。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步:首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物;然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5'磷酸基和3'羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化;最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個不同大小的片斷相連。連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h過夜，這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

T載體連接操作時，首先于小PCR管中配制50微升體系，包括Solution I 5微升，回收產(chǎn)物4.5微升，T載體0.5微升。隨后混勻并于16℃連接過夜，連接時間至少8小時。2.4 轉(zhuǎn)化

外源 DNA 與載體分子的連接即為 DNA 重組技術(shù)，這樣重新組合的 DNA 分子叫做重組子。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過抗生素篩選法篩選出重組子，并可通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切，電泳，根據(jù)DNA Maker標準判斷陽性重組子中是否含有目的基因。感受態(tài)細胞制作原理為細菌在0°C氯化鈣低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)[15]。轉(zhuǎn)化是將外源 DNA 分子導(dǎo)入到受體細胞，即原核細胞或者真核細胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法[16]。基因克隆中的轉(zhuǎn)化過程原理為質(zhì)粒DNA或重組DNA粘附在細菌細胞表面，經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達，可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長，從而鑒別選擇出轉(zhuǎn)化子。

準備步驟包括配制LB培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、含抗生素LB培養(yǎng)基。首先，每升LB培養(yǎng)基，需在超純水中加入蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，溶解混勻；LB固體培養(yǎng)基是在每升LB培養(yǎng)基中加入15克瓊脂糖，混勻加熱溶解；制作含氨芐霉素培養(yǎng)基，稱量固體LB微波爐加熱3分鐘，沖冷水至不燙手，按1：1000比例加入氨芐霉素，倒薄薄的一層于培養(yǎng)皿中，待其凝固，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，倒置并標記。

操作步驟包括準備冰盒，打開42℃水恒溫浴鍋，將無抗LB提前放入37℃預(yù)熱；從超低溫冰箱取出E.coli DH5a 感受態(tài)菌株，將商品化DH5a 感受態(tài)細胞快速且溫柔取于冰中，待其于冰中融化；在超凈工作臺作業(yè)，吸取10微升載體連接產(chǎn)物，緩慢加入感受

態(tài)中，反復(fù)抽吸三次混勻，動作需輕微，防止產(chǎn)生氣泡，放入冰盒30分鐘；將樣品放入42℃中熱激90秒，此為轉(zhuǎn)化必須環(huán)節(jié)；冰浴2分鐘，使其停止轉(zhuǎn)化過程；將預(yù)熱的無抗LB8微升加入樣品中，放入搖床45分鐘至60分鐘，復(fù)蘇感受態(tài)細胞；將涂菌棒用酒精燈滅菌，從冰箱取出培養(yǎng)基放入37℃溫箱預(yù)熱；將搖好后的樣品4000g離心5分鐘，棄去上清600微升，余200微升，目的是使得細菌濃度升高，將剩余200微升樣品混勻，加到培養(yǎng)板上，用滅菌放涼的涂菌棒涂勻；涂菌后的培養(yǎng)基保存于37℃恒溫箱過夜。

培養(yǎng)大腸桿菌，在培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)大腸桿菌過夜，長出的菌落呈乳白色大圓點狀菌，表面和背面顏色一致，菌落邊緣整齊均勻，表面光滑濕潤,分散分布于整個培養(yǎng)皿（圖3）。隨后挑菌、搖菌、獲得菌液，用于篩選、抽提鑒定質(zhì)粒。挑菌時在細菌間超凈工作臺作業(yè)，取10只試管標號，依次擺到試管架上，灼燒試管蓋和鑷子，用鑷子拔下試管蓋后，在此灼燒試管口和試管蓋，倒入約三分之一的氨芐抗性LB，用鑷子夾槍頭挑去細菌，連同槍頭扔進試管，灼燒管口和試管口，在火焰中蓋上試管蓋。搖菌是在37℃搖床，過夜后就得到了菌液。余下的菌落用封口膜封上放入4℃冰箱中保存。

圖3 轉(zhuǎn)化后大腸桿菌培養(yǎng)結(jié)果

Figure 3 The result of the e.coli bacteria after transformation 2.5 抽提鑒定質(zhì)粒

質(zhì)粒是在細菌細胞中染色體之外能夠自主復(fù)制的共價閉合環(huán)狀雙螺旋的分子或遺傳因子。質(zhì)粒抽提原理即去除 RNA，且將質(zhì)粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒[

17、18]。

本實驗采用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒抽提質(zhì)粒。

準備步驟包括RNA酶 A全部加入緩沖液 S1中并4℃貯存。準備無核酸或核酸酶污染的Tip頭、離心管。緩沖液 W2濃縮液中加入指定體積的無水乙醇，原因是第一次使用試劑盒。試用前，檢查緩沖液 S2是否出現(xiàn)沉淀，如有沉淀應(yīng)于37℃水浴加熱并溶解。

操作步驟包括取2毫升在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄盡上清。加250微升緩沖液 S1懸浮細菌沉淀，懸浮需要均勻，不能夠有小的菌塊，確認緩沖液W2中已加入無水乙醇。加250毫升，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步驟需要控制在5分鐘之內(nèi)。使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的和中的中和，降低溶菌效率。避免劇烈搖晃，否則可能導(dǎo)致基因組DNA的污染，此步驟需要控制在5分鐘之內(nèi)。采用離心法純化質(zhì)粒，吸取上一步驟中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；將制備管置回離心管，加500微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；加700微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；加700微升 緩沖液 W1，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；將制備管置回2毫升離心管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘。將制備管移入新的1.5毫升離心管中，在制備管中央加80 微升的Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心1分鐘，將Eluent或去離子水加熱至65℃能提高洗脫效率。隨后，質(zhì)粒測序鑒定目的基因是否插入。菌液PCR后使用隨機引物進行通測，引物合成及測序由北京華大生物公司完成（圖4、5）。

圖4 質(zhì)粒基因組堿基序列

Figure 4 Plasmid genome base sequence

圖5 質(zhì)粒基因組測序峰

Figure 5 Plasmid genome sequencing 3 討論

本文構(gòu)建的目的基因LC3有關(guān)自噬活動，近年來，自噬在癌癥免疫因素感染炎癥和神經(jīng)退行性變等領(lǐng)域的研究不斷增加，準確地檢測自噬基因?qū)τ谘芯孔允傻纳飳W(xué)功能至關(guān)重要，根據(jù)LC3的特點構(gòu)建重組質(zhì)粒，從而獲取大量LC3基因可作為自噬研究的組成環(huán)節(jié)。

本實驗采用反轉(zhuǎn)錄的方法獲取cDNA后，依據(jù)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳效果顯示第二對引物擴增的條帶比較清晰,由此選擇第二對引物進行擴增，得到相應(yīng)目的基因。采用T載體連接方法，將目的基因引入感受態(tài)大腸桿菌，進行基因克隆。轉(zhuǎn)化子擴增后，將轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒提取出，進行電泳、測序等進一步鑒定。轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)約600bp的明亮條帶,為目的基因條帶，說明目的基因成功導(dǎo)入細菌質(zhì)粒并復(fù)制，進一步的基因測序鑒定結(jié)果表明實驗完成了鴨RFP-GFP-LC3重組質(zhì)粒的構(gòu)建。最后使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒，得到多量目的基因LC3。

整個過程的每個環(huán)節(jié)中皆包含影響實驗結(jié)果的因素，各個因素稍有變化既可能對實驗結(jié)果造成量或質(zhì)的影響，現(xiàn)將需要注意的幾個重要因素及其影響討論如下： 3.1試劑

試劑使用前應(yīng)當(dāng)仔細閱讀說明書。如用于提取RNA的Omega RNA提取試劑盒，其中的緩沖液 W2 濃縮液在提取開始或貯存在室溫條件前，必須用無水乙醇稀釋，如果使用了未經(jīng)處理濃縮液，則無法充分洗滌RNA，使得最后產(chǎn)物中存在大量雜質(zhì)。3.2 核酸酶

注意保證實驗環(huán)境中RNA酶量最小化，操作過程應(yīng)迅速且謹慎，始終戴一次性橡膠手套，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶到試管或污染用具；避免在操作中說話聊天，戴口罩以防止引起RNA酶污染；配制溶液用的酒精、異丙醇等應(yīng)采用未開封的新瓶，使用專門配制的無RNA酶制備管、收集管。酶如果沒有被充分隔絕，將減少甚至提取不出RNA。3.3 核酸電泳緩沖液

瓊脂糖核酸電泳的緩沖系統(tǒng)在高離子強度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的選擇和濃度，而且不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應(yīng)有選擇地使用。

DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響，凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，否則將導(dǎo)致實驗結(jié)果參照不準。3.4 膠回收效率

將凝膠切成細小的碎塊可大大縮短凝膠融化時間，從而提高回收率；勿將含DNA的凝膠長時間地暴露在紫外燈下，減少紫外燈對DNA造成的損傷；融化凝膠時應(yīng)當(dāng)完全，避免殘留降低回收率，以及阻塞制備管濾膜影響后續(xù)步驟也會降低回收效率。3.5 DNA酶切位點

基因克隆時選擇載體DNA酶切位點時應(yīng)注意兩個酶切位點的距離不應(yīng)過小，否則影響限制性內(nèi)切酶識別切點；目的基因片段內(nèi)部不應(yīng)含有所選的酶切位點；實驗后繼應(yīng)用的所有載體都盡可能含有所選的酶切位點，并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）[20]；選擇較常用的酶切位點，兩個酶切點至少隔上3個堿基；使用酶切效率高，且雙酶切有共同緩沖液的酶。3.6 轉(zhuǎn)化效率

為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實驗中要考慮細胞生長狀態(tài)和密度，不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液；細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制，DH5α菌株的OD600 為0.5 時,這時比較合適，密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。

質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度方面應(yīng)注意用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA 應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA 的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低，1納克的超螺旋態(tài)DNA 即可使50微升的感受態(tài)細胞達到飽和，一般情況下,DNA 溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的二十分之一[

18、19]。

試劑的質(zhì)量方面應(yīng)注意所用的試劑,如氯化鈣等均需是最高純度的，并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處；防止雜菌和雜DNA 的污染，整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管,Tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所污染[20], 否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA 的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。3.7 試劑盒

本實驗使用了若干試劑盒，例如AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、美國Omega RNA提取試劑盒，使操作能夠擺脫繁重的試劑配制及優(yōu)化過程，試劑盒中配備有相應(yīng)使用說明書，按照說明書不需或只需少量的優(yōu)化即可得到滿意的結(jié)果，使用試劑盒時要根據(jù)自己的實驗需要選取專用提取試劑盒，如果不是專用試劑盒，提出的RNA不能確保其質(zhì)量以及完整性，會影響RT-PCR、基因克隆、抽提質(zhì)粒等后續(xù)實驗的結(jié)果。

參考文獻

[1] Vega-Naredo, Beatriz Caballero, et al.Sexual dimorphism of autophagy in Syrian hamster Harderian gland culminates in a holocrine secretion in female glands.Landes Bioscience 2009;30:785-92.[2] Hanqing Dong and Mark J.Czaja, et al.Regulation of lipid droplets by autophagy.Cell 2005;19:2066-8.[3] Noboru Mizushima1 and Masaaki Komatsu.Autophagy: Renovation of Cells and Tissues.Dev Cell 2011;6:463-77.[4]鄒曉蕾,劉禮崔,羅立新.細菌總RNA提取方法的比較[J].現(xiàn)代食品科技,2013,08:1948-1954.[5]淳俊,鄭彥峰,王勝華,陳放.一種廣泛適用的RNA提取方法[J].生物化學(xué)與生物物理進展,2008,05:591-597.[6] 張濤，韓梅等.人參總RNA提取方法及反轉(zhuǎn)錄酶的比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,08:34-37.[7] 邱建明,董澤平等.應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-套式PCR方法檢測腎綜合征出血熱病人血清中的漢坦病毒特異性RNA[J].病毒學(xué)報,1997,02:23-29.[8]黃銀花,胡曉湘等.影響多重PCR擴增效果的因素[J].傳,2003,01:65-68.金科華,劉潔.[9]段新華,劉誠明.關(guān)于PCR擴增體系優(yōu)化的實驗研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2004,04:294-298.[10] 潘力,崔翠等.一種用于PCR擴增的絲狀真菌DNA快速提取方法[J].微生物學(xué)通報,2010,03:450-453.張濤,韓梅,劉翠晶,胥苗苗.[11]梅魁敏,伍學(xué)州等.用ELISA法和核酸電泳法檢測牛輪狀病毒[J].微生物學(xué)通報,1991,06:366-367.[12]劉淑華.核酸電泳法檢測輪狀病毒(摘要)[J].青海醫(yī)藥雜志,1986,02:29.[13]吳淑珍,夏露等.用PCR-PAGE切膠回收-PCR測序法制備DXS9898基因座等位基因分型標準物[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,05:460-461+463.[14]徐珍,張玉芹等.不同酶切體系對膠回收純化DNA濃度的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2010,09:54-57.[15]李明才,何韶衡.一種高效、快速的大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,04:228-230+241.[16]羅鋒,余騰等.感受態(tài)細胞制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化冰浴時間對大腸埃希菌轉(zhuǎn)化效率的影響[J].江漢大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,03:82-85.[17]金科華，劉潔等.質(zhì)粒抽提策略對雙酶切鑒定的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,06:559-561.[18]李鈞敏,邊才苗.幾種細菌質(zhì)粒抽提方法的研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2004,05:9-12+114.[19]封建凱,孫萬邦等.重組hIL-10質(zhì)粒構(gòu)建及其在畢赤酵母SMD1168中的表達和純化[J].生物技術(shù)通報,2010,03:168-172.[20]盧鈞雄.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶C端重組質(zhì)粒構(gòu)建與表達及對細胞增殖和活力的影響[D].南方醫(yī)科大學(xué),2012.附錄

附錄1：離心力和離心轉(zhuǎn)速換算計算公式

RCF= 1.118 ×10-5×N2 ×R RCF表示相對離心力，單位為g N表示轉(zhuǎn)速，單位為rpm（轉(zhuǎn)/分）R表示離心半徑，單位為cm。

本實驗使用的離心機離心力和離心轉(zhuǎn)速換算如下： 12000rpm=13205rcf 13000rpm=15497rcf

附錄2：試劑穩(wěn)定性

AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒，試劑穩(wěn)定性及貯存條件如下：

RNA酶 A，室溫可以貯藏6個月，長期貯存于-20℃；緩沖液 S1為細菌懸浮液，加入RNA酶 A后，混合均勻，4℃貯存；緩沖液 S2為細菌裂解液，室溫密閉貯存；緩沖液 S3為中和液，室溫密閉貯存；緩沖液 W1為洗滌液，室溫密閉貯存；緩沖液 W2為濃縮液或去鹽液，使用前，按照試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存；Eluent為洗脫液，室溫密閉貯存。的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，試劑穩(wěn)定性及貯存條件如下：

緩沖液 W1為洗滌液，室溫密閉貯存；緩沖液 W2 為濃縮液，又稱去鹽液，使用前，按照試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存；Eluent為洗脫液，室溫密閉貯存；緩沖液 DE-A為凝膠融化劑，含DNA保護劑，防止DNA在高溫下降解，室溫密閉貯存；緩沖液 DE-B為結(jié)合液，室溫密閉貯存。

第二篇：質(zhì)粒抽提常見問題與解答

1.沒有提出質(zhì)粒或者質(zhì)粒收獲量很低

A菌種老化

建議：對于甘油保存的菌種，需要先進行活化，涂布或者劃線菌種，重新挑選單菌落進行液體培養(yǎng)，并對菌種進行初搖活化，按照1:500的比例進行菌種培養(yǎng)。二次培養(yǎng)時間最好不要超出16小時(或者OD600不超過3.0)。

B低拷貝質(zhì)粒

建議：如果是由于低拷貝質(zhì)粒引起的質(zhì)粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量，并相應(yīng)增加各種Buffer的用量。

C質(zhì)粒丟失

建議：某些質(zhì)粒在次繼代培養(yǎng)的過程中會出現(xiàn)丟失的想象，另外檢查篩選抗生素的濃度是否正確。

D裂解不充分

建議：如果采用超過推薦量的菌體進行質(zhì)粒制備，會導(dǎo)致菌體裂解不充分。可適當(dāng)減少菌體的用量或者相應(yīng)增大各種Buffer的用量。并確保細菌混懸均勻。

EBuffer中有沉淀未溶解

建議：BufferB1和BufferN1，BufferC1在溫度較低時會出現(xiàn)沉淀，使用前請檢查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，請置于37℃溫育片刻，待溶液澄清后使用。

FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇

建議：按照說明書要求加入要求量的無水乙醇，使用后旋緊瓶蓋，防止乙醇揮發(fā)。另外對于質(zhì)粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗滌，請確保乙醇的體積不小于70%。

G離心柱中乙醇殘留

建議：漂洗后，可適當(dāng)延長離心時間，盡量去除殘留的乙醇。另外對于質(zhì)粒中提，大提和朝大量提取，建議離心后，將柱子或大漏斗用吹風(fēng)機冷風(fēng)吹片刻(或置于65℃烘箱)，以徹底去除殘留的乙醇，便于洗脫和后續(xù)實驗操作。

H洗脫液加入位置不正確

建議：洗脫液應(yīng)加在膜中央，已取得最好的洗脫效果。

I洗脫液pH值不正確

建議：將DNA從柱子上洗脫下來的最適pH值在7.0-8.5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會顯著影響洗脫效果，請使用試劑盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)進行洗脫，如果用ddH2O進行洗脫，請確保pH在7.0-8.5之間。

J洗脫體積的選擇

建議：洗脫體積將會影響最終的收獲量，洗脫體積越大，收獲量越高，但是濃度將會降低。請使用試劑盒推薦的洗脫體積進行洗脫，以保證最好的收獲量和濃度。如果需要高濃度的質(zhì)粒，請減少洗脫體積。另外，如果想收獲高濃度高收獲量的質(zhì)粒，請根據(jù)試劑盒要求進行二次洗脫，再用推薦的方法進行沉淀，濃縮質(zhì)粒。

K洗脫時間的選擇

建議：加入洗脫Buffer后，室溫放置2-5分鐘，將有利于洗脫。

2.質(zhì)粒純度不高

A蛋白質(zhì)污染

建議：選擇推薦量的菌體，離心后小心吸取上清，如果上清液中混有懸浮物，可再次離心，以徹底去除蛋白。另外如果用ddH2O作為稀釋溶液,測定OD比值，比值可能較低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer來稀釋。

BRNA污染

建議：檢查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA應(yīng)該存放在4℃，如果存放時間過長，或者沒有正確存放，RNaseA活力下降，請重新加入RNaseA。

C基因組DNA污染

建議：加入BufferB1后，輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩渦旋，加入BufferB1的處理時間最好不要超過5分鐘。

D菌株為含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株

建議：請選用含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株質(zhì)粒DNA提取試劑盒，或者轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到不含內(nèi)源核酸酶宿主菌株中。

3.加樣時DNA飄出加樣孔外

原因：柱中殘留乙醇未除干凈。

建議：洗脫質(zhì)粒DNA前確保無乙醇殘留在柱子上。可再離心或者抽真空。

第三篇：質(zhì)粒DNA抽提實驗報告

質(zhì)粒DNA抽提實驗報告

一．實驗?zāi)康模?/p>

1.掌握堿裂解法小量快速提取質(zhì)粒DNA的方法，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切，PCR擴增等。

2.學(xué)習(xí)利用水平式瓊脂糖凝脈電泳初步檢測DNA的純度，構(gòu)型，含量和分子量大小。

二．實驗原理：堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DN結(jié)果A的變性與復(fù)性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。三．實驗儀器及試劑：

1.5mlEP管、高速離心機、移液槍

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．實驗步驟:

1、取1.5ml細胞培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，12000rpm/min離心1min，去上清液（重復(fù)一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重懸浮細胞

3、加200μl溶液Ⅱ，輕輕搖勻，放置5min

4、加150μl溶液，輕輕搖勻，冰浴5min，12000rpm/min離心5min

5、取上清，加入等體積氯仿，搖勻，12000rpm/min離心10min

6、去上清，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，12000rpm/min離心10min 7、70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干

8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存?zhèn)溆?/p>

五．實驗結(jié)果：得到大腸桿菌質(zhì)粒DNA

PCR以及電泳實驗報告

一．實驗原理：

PCR：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

電泳：瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對于蛋白質(zhì)來說是比較大的，對蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時蛋白質(zhì)分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來進行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會存在一定的摩擦阻礙作用，這時分子的大小會對電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。

二．實驗儀器及試劑：

EP管、離心機、PCR儀、電泳槽、電泳儀、移液槍、紫外透射檢測儀等 DNA模板、與特定DNA模板結(jié)合的引物、去離子水、商業(yè)化的DNA聚合酶以及緩沖液、dNTP、DNA熒光染料溴化乙錠、瓊脂糖凝膠

三．PCR反應(yīng)體系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl

四．操作步驟 1、94℃預(yù)變性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循環(huán)7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循環(huán)23次 3、72℃，10s

4、電泳檢測

五．實驗結(jié)果分析

分離不同大小的DNA片段所用的最適凝膠濃度是不同的，數(shù)據(jù)見下表：

如右圖所示：實驗所用的瓊脂糖凝膠濃度為1.3%，實驗的DNA條帶位置在500bp-750bp之間，接近500bp，證明實驗是成功的

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp 實驗組

對照組

第四篇：重組質(zhì)粒的構(gòu)建經(jīng)驗~~~

昨天我在版中我看很多谷友詢問重組質(zhì)粒的構(gòu)建問題，有些谷友說構(gòu)建質(zhì)粒需要一個月，甚至更長時間，這讓我聯(lián)想我剛做分子生物學(xué)時候的曲折。重組質(zhì)粒構(gòu)建是常用的分子生物學(xué)手段，其實只是最基本的方法，一般一個星期同時構(gòu)建三二個組質(zhì)粒是沒有問題的。在國內(nèi)先進的實驗中，也大都是由實驗員搞定。但是其中還是有些基本的技巧需要掌握。在這里將我的心得分享于大家，這也是我本人幾年來一線工作時的經(jīng)驗積累，以期能為谷友提供借鑒，讓大家在實驗中少走彎路。所涉及內(nèi)容如下： 1)克隆基因的酶切位點問題 2)載體酶切的問題 3)連接片段濃度比的問題 在闡明上述問題同時，本人盡可能舉些實驗中的問題案例予以說明。

一、克隆基因的酶切位點問題

1、克隆位點選擇的問題。首先要對目標基因進行酶切位點掃描分析，列出其所含酶切位點清單。然后對照質(zhì)粒多克隆位點，所選擇的克隆位點必須是目標基因所不含的酶切位點。這是常識，不贅述。

2、保護堿基數(shù)目的問題。在設(shè)計PCR引物時，引入酶切位點后，常常要加入保護堿基，這是大家所熟知的。但是保護堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會大大影響后續(xù)的實驗進展。一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個保護堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以正常進行；而有一類，僅僅只加入兩個保護堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就不能正常進行，這是因為內(nèi)切酶不能正常結(jié)合DNA片段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個保護堿基，常用的HindIII也要三個。下面是我提供這類酶的列表及其所需最少的保護堿基數(shù)，相信下列將有助于大這家的實驗設(shè)計。NcoI4 NdeI6 NheI3 NotI8 PmeI6 SacI3 SalI3 SmaI3 HindIII 3 BstI8 SphI4 XhoI3 XbaI3 SmaI4 案例分析一：本人最初曾選用NdeI克隆位點，未注意到保護堿基數(shù)目的問題，設(shè)計PCR引物時，引入NdeI酶切位點后，只加上兩個保護堿基，一個月內(nèi)沒有進展，始終不能成功構(gòu)建重組載體。后查文獻得知癥結(jié)所在，在NdeI序列后加上六個保護堿基后，迎刃而解。大家引以為戒啊。現(xiàn)在普通酶我都引入三個保護堿基。現(xiàn)在堿基合成價格也不貴了，為保證酶切充分，連接順利，不用節(jié)約那點錢，再說若一次不成功，重復(fù)實驗花費時間與金錢更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。

二、載體酶切的問題

1、質(zhì)粒的單酶切鑒定。這個問題似乎很簡單，但我認為很有著重強調(diào)之必要。現(xiàn)在大家手頭的質(zhì)粒都是轉(zhuǎn)來轉(zhuǎn)去的，其中的各酶切位點狀況如何，是否能被有效地切開，這些問題都是要核實的。因此，在實驗開始之前必須對質(zhì)粒載體進行單酶切鑒定。現(xiàn)在我每次構(gòu)建之前，對所選擇的克隆位點都要作一一鑒定，例如選擇NdeI和HindIII作為克隆位點，就先分別對質(zhì)粒上這兩個酶的酶切位點進行單酶切鑒定。單酶切鑒定能有效地切開后，再發(fā)出引物合成定單，進行引物合成；若不能，就按“一”中原則進行調(diào)換。

2、連接反應(yīng)的對照。在實驗中，這步驟屬于質(zhì)粒載體與外源DNA片段的連接反應(yīng)。成功與否，很大程度上取決于與質(zhì)粒和DNA片段的酶切效果。一般情況下，都在通用緩沖液中進行雙酶切，但這兩種酶在通用緩沖液中酶切效率不一樣，這可能導(dǎo)致部分的單缺口的質(zhì)粒片段存在，這樣，在連接反應(yīng)中，即使在外源DNA片段存在下，這種單缺口的質(zhì)粒片段能夠進行更快速有效自我連接。最終結(jié)果是大量假陽性的菌斑生長。對照連接反應(yīng)中，在不加入外源片段情況下，實驗結(jié)果如果有菌斑生長，說明雙酶切不充分，質(zhì)粒DNA必須重新進行雙酶切。實驗案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位點構(gòu)建重組質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行雙酶切后，直接就做連接，未上述兩步鑒定，每次結(jié)果滿板的菌斑。但就是沒有陽性。后來對質(zhì)粒進行單酶要鑒定后，發(fā)現(xiàn)XhoI酶切位點損壞。又是一個月沒有進展，浪費精力和藥品。血的教訓(xùn)啊。因為當(dāng)時沒有注意到：單切質(zhì)粒是一條帶，雙切質(zhì)粒也是一條帶，電泳行為上是一樣的，分辨不出。如果做上述任何一個鑒定就會知道問題出在那兒，呵呵。實驗案例分析3：本實驗室一個號稱實驗嚴謹?shù)拇蟛┦浚肒pnI和HindIII構(gòu)建重組質(zhì)粒，一個月未果，只得陰性斑，不得陽性斑，后懷疑KpnI酶失效。遷怒KpnI，在我不知情下扔掉實驗室所有KpnI酶。我得知后，問他做過上述兩鑒定實驗后，他支吾著說沒有，后經(jīng)鑒定HindIII位點失效。最后他責(zé)備本人暗中保留一手，沒

有傾攮相授。呵呵，他不自責(zé)自己不思考，只是木著腦袋做實驗，反倒咬一口解鈴人，再說我在那以前也不知道他遇到什么難題。呵呵，你說冤不冤？這世道啊!也可看出，實驗室人員之間相互交流相當(dāng)重要。兩星期前寫了前兩問題后，終于能抽時間寫第三個問題，在做好前述兩個方面工作后，這個問題相對簡單。

三、連接時兩片段濃度比問題 一般實驗指導(dǎo)手冊上都說質(zhì)粒：片段＝1：3（摩爾比），在實際操作中我以為在1：5甚至1：10為宜。做好“

一、二”，16℃ 10小時后，每次都能有效地連接上。當(dāng)然還有大腸桿菌感受覺態(tài)問題，我們以前自己做，現(xiàn)在懶得做了，都用“天為時代公司”的產(chǎn)品，感覺還不錯（特別聲明我不是天為公司內(nèi)線，呵呵）。這里介紹一個估測處DNA濃度的方法：DNA可以用紫外法檢測，也可以電泳對比marker估測，在要求不是很精確情況下，大家不妨試試下面方法： 1． 取一平皿。

2． 薄薄倒一層含有EB的瓊脂糖膠，凝固(4 ℃可以存一個星期)。3．平皿背面可以畫成小方格。4． 一小格中點1 ul樣品。5． 另一小格格點1 ul DNA標準品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相當(dāng)60 ng)6． 涼干后，紫外燈下根據(jù)亮度就可以估測了。OK，我連接時這么估測濃度，5分鐘就要可以知道兩片段濃度。其實連接片段濃度比可以充許在一個范圍內(nèi)，1：5至1：10都可以，所以上述估測方法在這種情況下是行得通的。

第五篇：轉(zhuǎn)化方法和酵母質(zhì)粒抽提

酵母轉(zhuǎn)化（快速）

侯昕

1、挑單菌落于3ml 2XYPAD培養(yǎng)基中，30°C 200rpm培養(yǎng)至菌濃度為2X108 cell/ml。（約18h）。

2、用1.5ml離心管收集菌液兩次，每次1ml，13500rpm，常溫離心30秒。3、4、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。在菌中依次加入

50％PEG3350

240ul

1M LiAc

34ul 2mg/ml S.S.carrier DNA

50ul plasmid DNA(各1ug)

36ul 每加入一種后，要吸打混勻。5、6、42°C水浴1－3小時。

13500rpm離心1分鐘，吸棄上清。沉淀中加500ul水，吸打均勻，100ul涂皿。

7、30°C培養(yǎng)兩天

此方法可用于已知蛋白互做檢測，將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。

2×YPAD：Yeast Extract

16g

2mg/ml carrier DNA：

Peptone

32g

鮭魚精DNA（Sima D1626）

Glucose

32g

溶于水，低溫放置過夜，滅

Adenine hemisulfate

80mg

菌后－20°C保存。

d2 H2O

800ml 酵母轉(zhuǎn)化（高效）

侯昕

1、挑酵母單菌落于100ml SC液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X107 cell/ml（稀釋20倍，OD545或OD600為0.1）。※或挑酵母單菌落于50ml 2XYPAD液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X108cell/ml（稀釋200倍，OD545或OD600為0.1）。

2、用兩個50ml離心管分別收集40ml菌液，3000g，常溫離心5分鐘。

3、將菌分別轉(zhuǎn)入兩瓶150ml 2XYPAD培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)至菌濃度為2X107cell/ml。

4、用500ml離心管收集300ml菌液，3000g，5分鐘。用 200mlddH2O洗兩次，將菌轉(zhuǎn)入一個50ml離心管。

5、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。

6、配Mixture：

50％PEG3350

14.4Mml

1M LiAc

2.16ml 2mg/ml S.S.carrier DNA

3ml plasmid DNA＋ddH2O

2.04ml

7、把Mixture加入菌沉淀中，吸打均勻。

8、42°C水域熱激45分鐘；每5分鐘搖一下，使其受熱均勻。

9、3000g，離心5分鐘，棄上清，菌沉淀中加40ml水，吸打均勻，涂皿，100－200u/皿。

此方法可用于酵母雙雜交文庫篩選，建議分步轉(zhuǎn)化。

酵母質(zhì)粒抽提

侯昕

1、收集菌液，10000g，離心10秒。

2、菌沉淀中加200ul YLS，牙簽打散。

3、加200ul 苯酚氯仿異戊醇（25：24：1），搖5分鐘，13000rpm，離心5分鐘。

4、將上層轉(zhuǎn)入一新離心管中，重復(fù)3。

5、將上層轉(zhuǎn)入一新離心管中，加20ul 3M NaOAc（pH5.2）、500ul乙醇，搖勻，10000g，4°C離心10－30分鐘。

6、750ul 75％乙醇洗，10000g，離心5－10分鐘。

7、重復(fù)6。

8、吹干，加10－20ul 水或TE。

此方法得到的質(zhì)粒可用于電轉(zhuǎn)大腸桿菌

Yeast lysis solution（YLS）：

2％（v/v）

Triton X－100

1％（w/v）

SDS 100mM

NaCl 1mM

EDTA