第一篇：質粒DNA的抽提與純化 (附注問題非常詳細)

質粒DNA的抽提與純化(附注問題非常詳細)

目的： 采用堿變性法，學習小規模制備質粒DNA的技術

原理： 堿變性抽提質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH值至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質－SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。

儀器與主要試劑 儀器（見附錄）：

主要試劑： 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH 1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液 TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTA

實驗方法：

1．將大腸桿菌菌落挑取一環接種在含有2毫升加入抗菌素的LB液體培養基的10毫升試管里，37℃振培過夜，16～18小時

2．轉移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm離心30秒

3．小心去除上清，并用吸水紙吸干殘余液體，再將沉淀物在振蕩器上振勻 4．加入溶液I 100μl，蓋緊EP管蓋，翻轉數次，冰上放置10分鐘

5．加入溶液II 200μl，溫和翻轉EP管5次(可觀察到溶液逐步由混濁變為透明)，冰上放置5分鐘

6．加入溶液III 150μl，將EP管蓋緊后累累來回翻轉23次，混勻后冰上放置20分鐘

7．12000rpm離心15分鐘 8．將上清轉移到另一個EP管中(吸取時不可吸入底部的沉淀)。加入等體積的酚和氯仿：異戊醇各抽提一次

9．加入1毫升預冷的無水乙醇和1/10體積的NaAc(3 mol/L,pH5.2)，蓋緊，并翻轉EP管數次混勻

10． 置于-20℃冰箱1～2小時

11． 15000rpm離心15分鐘，去除上清，收集管底白色沉淀 12． 70%乙醇洗滌一次，空氣干燥或真空抽干

13． 將沉淀溶于50μl TE緩沖液或去離子水，完全溶解后，-20℃保存 14． 取樣5μl，在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察DNA條帶。

附注：

1．溶液Ⅰ--－溶菌液

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中PH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械切力作用降解。EDTA的作用：

（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時一定的金屬離子作輔基）。

（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。

2．溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩定的。但當pH>12或pH<3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液Ⅱ中的NaOH濃度為0.2mol/L,加抽提液時，該系統的PH就高達12.6,因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性.SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3…R┿-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。3．溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc(pH4.8)溶液

NaAc的水溶液呈堿性，為了調節pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸.所以該溶液實際上是NaAc-Hac的緩沖液.用PH4.8的NaAc溶液是為了反pH12.6的抽提液,調回PH至中性,使變性的質粒DNA能夠復性,并能穩定存在.而高鹽的3MOL/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA,RNA,以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之.前者是因為中和核酸上的電荷,減少相斥力而互相聚合,后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白復合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復合物,使沉淀更完全.4.為什么用無水乙醇沉淀DNA? 用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的優點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學反應,對DNA很安全,因此是理想的沉淀劑.DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在,當加入乙醇時,乙醇會奪DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右.因而也可改用95%乙醇來替代懈水乙醇(因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴).但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率.折中的做法初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙醇,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇.也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA.一般在室溫下放置15-30分鐘即可.5.在用無水乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAC或NaCL至最終濃度達0.1－0.25MOL/L? 在Ph為8左右的DNA溶液中,DNA分子是帶負電荷的,加一定濃度的NaAC或NaCL,使Na2+中和DNA分子上的負電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當加入的鹽溶液濃度太低時,只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA沉淀不完全,當加入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于過多的鹽雜質存在,影響DNA的酶切等反應,必須要進行洗滌或重沉淀.6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與Kac來處理? 加進去的Rnaese本身是一種蛋白質,為了純化DNA,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀,再加Kac使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物,使沉淀更加完全.也可用飽和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnese。在溶液中，有人以Kac代替NaAc，也可以收到較好的效果。7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？ 在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa=7.2）和硼酸系統(pKa=9.24)等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍,可作DNA的保存液,但在轉化實驗時,磷酸根離子的種類及數量將與Ca2+產生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反應時,不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的緩沖系統,由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時,大都采用Tris-HCL系統,而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性.8.如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來沉淀DNA? 采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,小分子所需PEG濃度高達20%.本實驗選擇性沉淀4.3Kb的pBR322質粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最終PEG濃度為12%.PEG選擇性沉淀DNA的分辯率大約100bp.9.抽提DNA去除蛋白質時,怎樣使用酚與氯仿較好? 酚與氯仿是非極性分子,水是極性分子,當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時,蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去使蛋白失去水合狀態而變性.經過離心,變性蛋白質的密度比水的密度為大,因而與水相分離,沉淀在水相下面,從而與溶解在水相中的DNA分開.而酚與氯仿有機溶劑比重更大,保留在最下層.作為表面變性的酚與氯仿,在去除蛋白質的作用中,各有利弊,酚的變性作用大,但酚與水想有一定程度的互溶,大約10%~15%的水溶解在酚相中,因而損失了這部分水相中的DNA,而氯仿的變性作用不如酚效果好,但氯仿與水不相混溶,不會帶走DNA.所以在抽提過程中,混合使用酚與氯仿效果最好.經酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚,由于酚與氯仿是互溶的,可用氯仿第二次變性蛋白質,此時一起將酚帶走.也可以在第二次抽提時,將酚與氯仿混合(1:1)使用.10.為什么用酚與氯仿抽提DNA時,還要加少量的異戌醇? 在抽提DNA時,為了混合均勻,必須劇烈振蕩容光煥發器數次,這時在混合液內易產生氣泡,氣泡會阻止相互間的充分作用.加入異戌醇能降低分子表面張力,所以能減少抽提過程中的泡沫產生.一般采用氯仿與異戌醇為24:1之比.也可以采用酚,氯仿與異戌醇之比為25:24:1(不必先配制,可在臨用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互異戌醇即成,)節同時異戌醇有助于分相,使離必后的上層水相,中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定.11.為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?呈粉紅色的酚可否使用?如何保存酚不被空氣氧化? 因為酚與水有一定的互溶.苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中,不致吸收樣品中含有DNA的水分,減少DNA的損失.用Tris調節至PH為8是因為DNA在此條件下比較穩定.在中性或堿性條件下(PH5~7),RNA比DNA更容易游離到水相,所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品.保存在冰箱中的酚,容易被空氣氧公而變成粉紅色的,這樣的酚容易降解DNA,一般不可以使用.為了防止酚的氧化,可加入巰基乙醇和8-羥基喹啉至終濃度為0.1%.8-羥基喹啉是帶有淡黃色的固體粉末,不僅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris PH8.0水溶液飽和后的酚,最好分裝在棕色小試劑瓶里,上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子這宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或-20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質，可用數月。

第二篇：質粒DNA抽提實驗報告

質粒DNA抽提實驗報告

一．實驗目的：

1.掌握堿裂解法小量快速提取質粒DNA的方法，提取的質粒DNA可直接用于酶切，PCR擴增等。

2.學習利用水平式瓊脂糖凝脈電泳初步檢測DNA的純度，構型，含量和分子量大小。

二．實驗原理：堿變性抽提質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DN結果A的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH值至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。三．實驗儀器及試劑：

1.5mlEP管、高速離心機、移液槍

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．實驗步驟:

1、取1.5ml細胞培養物于1.5mlEP管中，12000rpm/min離心1min，去上清液（重復一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重懸浮細胞

3、加200μl溶液Ⅱ，輕輕搖勻，放置5min

4、加150μl溶液，輕輕搖勻，冰浴5min，12000rpm/min離心5min

5、取上清，加入等體積氯仿，搖勻，12000rpm/min離心10min

6、去上清，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，12000rpm/min離心10min 7、70%乙醇洗滌沉淀2次，風干

8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存備用

五．實驗結果：得到大腸桿菌質粒DNA

PCR以及電泳實驗報告

一．實驗原理：

PCR：該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

電泳：瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質和核酸的電泳支持介質，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對于蛋白質來說是比較大的，對蛋白質的阻礙作用較小，這時蛋白質分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用于一些忽略蛋白質大小而只根據蛋白質天然電荷來進行分離的電泳技術，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會存在一定的摩擦阻礙作用，這時分子的大小會對電泳遷移率產生明顯影響。

二．實驗儀器及試劑：

EP管、離心機、PCR儀、電泳槽、電泳儀、移液槍、紫外透射檢測儀等 DNA模板、與特定DNA模板結合的引物、去離子水、商業化的DNA聚合酶以及緩沖液、dNTP、DNA熒光染料溴化乙錠、瓊脂糖凝膠

三．PCR反應體系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl

四．操作步驟 1、94℃預變性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循環7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循環23次 3、72℃，10s

4、電泳檢測

五．實驗結果分析

分離不同大小的DNA片段所用的最適凝膠濃度是不同的，數據見下表：

如右圖所示：實驗所用的瓊脂糖凝膠濃度為1.3%，實驗的DNA條帶位置在500bp-750bp之間，接近500bp，證明實驗是成功的

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp 實驗組

對照組

第三篇：質粒抽提常見問題與解答

1.沒有提出質粒或者質粒收獲量很低

A菌種老化

建議：對于甘油保存的菌種，需要先進行活化，涂布或者劃線菌種，重新挑選單菌落進行液體培養，并對菌種進行初搖活化，按照1:500的比例進行菌種培養。二次培養時間最好不要超出16小時(或者OD600不超過3.0)。

B低拷貝質粒

建議：如果是由于低拷貝質粒引起的質粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量，并相應增加各種Buffer的用量。

C質粒丟失

建議：某些質粒在次繼代培養的過程中會出現丟失的想象，另外檢查篩選抗生素的濃度是否正確。

D裂解不充分

建議：如果采用超過推薦量的菌體進行質粒制備，會導致菌體裂解不充分。可適當減少菌體的用量或者相應增大各種Buffer的用量。并確保細菌混懸均勻。

EBuffer中有沉淀未溶解

建議：BufferB1和BufferN1，BufferC1在溫度較低時會出現沉淀，使用前請檢查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，請置于37℃溫育片刻，待溶液澄清后使用。

FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇

建議：按照說明書要求加入要求量的無水乙醇，使用后旋緊瓶蓋，防止乙醇揮發。另外對于質粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗滌，請確保乙醇的體積不小于70%。

G離心柱中乙醇殘留

建議：漂洗后，可適當延長離心時間，盡量去除殘留的乙醇。另外對于質粒中提，大提和朝大量提取，建議離心后，將柱子或大漏斗用吹風機冷風吹片刻(或置于65℃烘箱)，以徹底去除殘留的乙醇，便于洗脫和后續實驗操作。

H洗脫液加入位置不正確

建議：洗脫液應加在膜中央，已取得最好的洗脫效果。

I洗脫液pH值不正確

建議：將DNA從柱子上洗脫下來的最適pH值在7.0-8.5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會顯著影響洗脫效果，請使用試劑盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)進行洗脫，如果用ddH2O進行洗脫，請確保pH在7.0-8.5之間。

J洗脫體積的選擇

建議：洗脫體積將會影響最終的收獲量，洗脫體積越大，收獲量越高，但是濃度將會降低。請使用試劑盒推薦的洗脫體積進行洗脫，以保證最好的收獲量和濃度。如果需要高濃度的質粒，請減少洗脫體積。另外，如果想收獲高濃度高收獲量的質粒，請根據試劑盒要求進行二次洗脫，再用推薦的方法進行沉淀，濃縮質粒。

K洗脫時間的選擇

建議：加入洗脫Buffer后，室溫放置2-5分鐘，將有利于洗脫。

2.質粒純度不高

A蛋白質污染

建議：選擇推薦量的菌體，離心后小心吸取上清，如果上清液中混有懸浮物，可再次離心，以徹底去除蛋白。另外如果用ddH2O作為稀釋溶液,測定OD比值，比值可能較低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer來稀釋。

BRNA污染

建議：檢查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA應該存放在4℃，如果存放時間過長，或者沒有正確存放，RNaseA活力下降，請重新加入RNaseA。

C基因組DNA污染

建議：加入BufferB1后，輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩渦旋，加入BufferB1的處理時間最好不要超過5分鐘。

D菌株為含內源核酸酶的宿主菌株

建議：請選用含內源核酸酶的宿主菌株質粒DNA提取試劑盒，或者轉化質粒到不含內源核酸酶宿主菌株中。

3.加樣時DNA飄出加樣孔外

原因：柱中殘留乙醇未除干凈。

建議：洗脫質粒DNA前確保無乙醇殘留在柱子上。可再離心或者抽真空。

第四篇：基因重組質粒的構建與抽提

基因重組質粒的構建與抽提

摘要....................................................................................................................................................Ⅰ Abstract............................................................................................................................................Ⅱ 引言.......................................................................................................................................................1 1 材料與儀器、用品.........................................................................................................................2 2 原理與方法......................................................................................................................................3

2.1 獲取目的基因.......................................................................................................................3

2.1.1提取RNA.................................................................................................................3 2.1.2 RNA反轉錄為cDNA............................................................................................3 2.1.3 聚合酶鏈式反應......................................................................................................4 2.2 回收目的基因.......................................................................................................................5

2.2.1 核酸電泳....................................................................................................................5 2.2.2 膠回收........................................................................................................................6 2.3 DNA分子體外連接.............................................................................................................7 2.4 轉化.......................................................................................................................................7 2.5 抽提鑒定質粒.......................................................................................................................8 3 討論...............................................................................................................................................10 3.1試劑.....................................................................................................................................11 3.2 核酸酶................................................................................................................................11 3.3 核酸電泳緩沖液...............................................................................................................11 3.4 膠回收效率........................................................................................................................11 3.5 DNA酶切位點..................................................................................................................11 3.6 轉化效率............................................................................................................................11 3.7 試劑盒................................................................................................................................12 參考文獻...........................................................................................................................................13 致謝....................................................................................................................錯誤！未定義書簽。附錄....................................................................................................................................................14

Contents Chinese Abstract............................................................................................................................Ⅰ Abstract.........................................................................................................................................Ⅱ Preface.............................................................................................................................................1 1 Materials and equipment, supplies...............................................................................................2 2 The principle and method.............................................................................................................2 2.1 Acquire target gene...............................................................................................................2 2.1.1 Extraction of RNA........................................................................................................2 2.1.2 RNA transcription for cDNA.........................................................................................3 2.1.3 Polymerase chain reaction..............................................................................................3 2.2 Recycling target gene............................................................................................................5 2.2.1 Nucleic acid electrophoresis...........................................................................................5 2.2.2 Plastic recycling.............................................................................................................4 2.3 Connection of DNA molecules in vitro.................................................................................5 2.4 Transformation......................................................................................................................2.5 Extraction and identification of plasmid...............................................................................6 3 Disguss.......................................................................................................................................10

3.1 Reagent................................................................................................................................11

3.2 Nuclease..............................................................................................................................11

3.3 The nucleic acid electrophoresis buffer...............................................................................11

3.4 Efficiency of plastic recycling.............................................................................................11

3.5 DNA enzyme loci................................................................................................................11

3.6 The efficiency of conversion...............................................................................................11

3.7 Kit........................................................................................................................................12 References.....................................................................................................................................10 Acknowledgement.........................................................................................................................10 Appendix.......................................................................................................................................10

引言

自噬是一種實現細胞本身代謝需要和某些細胞器更新的生命活動，該活動對于動物機體生長發育具有重要意義。自噬相關基因LC3通過與細菌質粒結合可以大量復制。質粒存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環狀DNA分子。不同微管之間的差異，主要與結合于微管的非微管結構蛋白有關，它們參與微管結構的組裝，維持微管的穩定LC3和微管與其他骨架纖維之間的連接，表現為廣泛的功能性作用，該類蛋白被統稱為微管相關蛋白，LC3即微管相關蛋白輕鏈3，作為動物機體的一個自噬相關基因，對于其自噬活動相關微管蛋白質表達具有重要意義，目前國內外對該基因研究逐步增多、不斷深入。Vega-Naredo等研究表明LC3 調控對巨噬過程是至關重要的,因為蛋白質LC3-II定位自噬前體和自噬小體,它被認為是一個自噬標記，在其對兩性哈德氏腺的實驗中，免疫印跡分析顯示了LC3-I和LC3-II兩個對應波段[1]；Hanqing Dong等的發現表明,LC3 結合可能發生在脂滴表面,導致限制膜形成，在原位分隔脂滴的一部分，其他脂滴的候選識別是脂滴-相關蛋白質；Noboru Mizushima和Masaaki Komatsu的文章敘述了選擇性自噬最有特性的基質是p62,它也被稱為死骨片1 / SQSTM1，p62是廣泛表達的細胞蛋白質,在動物中守恒,但在植物和真菌不是，在分隔膜中通過LC3-作用區域p62直接與LC3相互作用[3]。此次實習實驗過程中，將該基因作為目的基因，采用基因克隆技術構建重組基因，并提取出目的基因。提取出的目的基因可成為相關研究、實驗的組成環節，例如用于測序、體外轉錄與翻譯、限制性內切酶消化、細菌轉化等分子生物學檢驗，以及動物機體蛋白質表達控制研究、自噬研究等。

質粒是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區DNA原有的能夠自主復制的較小的DNA分子，即細胞附殖粒、又稱胞附殖粒。大部分的質粒雖然都是環狀構型，它存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中，總體多為原核生物。構建重組質粒指將目的基因，即外源基因，與具有自主復制能力的載體在體外人工連接，構建成新的重組DNA，隨后抽提質粒可以將目的基因與細菌DNA分離，以獲得高純度的目的基因。筆者通過實驗學習、實際動手操作，完成了此質粒的構建和抽提過程，并在文中闡述了獲取目的基因后而進行的LC3基因克隆過程，其中使用GFP、RFP載體構建質粒。基因克隆又稱為分子克隆，指采用重組DNA技術，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子的過程。其是七十年代發展起來的一項具有革命性的研究技術，可簡要敘述為分、切、連、轉、選五個步驟。其最終目的在于通過相應技術手段，將目的基因導入寄主細胞，在宿主細胞內目的基因被大量的復制，即把一段外源DNA片段與質粒DNA連接起來，構成了一個重組質粒，并將該重組質粒轉入細菌中，建立基因克隆體系。本實驗構建含GFP-RFP-LC3基因的重組質粒，GFP、RFP分別為綠色和紅色熒光基因；使用的T載體為克隆載體，符合基因工程的載體應具有的基本性質，包括在宿主細胞中有獨立的復制和表達的能力，使外源重組的DNA片段得以擴增；分子量小，利于在宿主細胞中有較多的拷貝，便于結合更大的外源DNA片段，且在實驗操作中也不易被機械剪切而破

[2]

壞；載體分子中具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記，以賦予宿主細胞的不同表型特征；載體具有較多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。

細胞中的RNA可分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取實質就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質，最終獲得高純RNA產物的過程，目前，國內外提取RNA的技術均比較成熟，生產出的有關試劑盒利用分子量比較大的有機溶劑氯仿使有機相和無機相迅速分離，初步獲取RNA，并進一步分離純化。提取RNA后將其反轉錄并擴增，即可獲得用于重組質粒的目的基因。重組質粒過程中利用了聚合酶鏈式反應（PCR）、瓊脂糖凝膠電泳等方法。聚合酶鏈式反應是利用DNA片段旁側兩個短的單鏈引物，在體外快速擴增特異DNA片段的技術，它應用熱穩定的聚合酶，通過雙鏈DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復循環，DNA片段以指數方式增加了百萬倍。從非常微量的DNA甚至單個細胞所含有的DNA起始，可產生微克量的PCR產物。瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂凝膠作為支持物，利用核酸分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。重組質粒構建后，使用AxyPrep質粒DNA小量試劑盒抽提質粒，本實驗采取的離心法抽提質粒，即去除 RNA，將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。最后將得到的質粒送至有關生物公司測序，測序結果分析表明，目的基因片段存在于送檢樣品中，說明實驗成功構建并獲取了鴨RFP-GFP-LC3重組質粒。材料與儀器、用品

鴨肝臟組織，液氮，75%酒精，無水乙醇，氯仿，蒸餾水，普通雙蒸水，瓊脂糖，50倍濃度商品化TAE，2000bpDNA標準參照物（Marker），填充劑（Loading）,氨芐霉素，LB培養液，E.coli DH5a 菌株。

美國Omega RNA提取試劑盒，包含HiBin微型制備管，2毫升收集管，RNA-Solv試劑，RNA Wash 緩沖液 I，RNA Wash 緩沖液 II，DEPC水等。

AxyPrep質粒DNA小量試劑盒，試劑盒中的試劑包括小量制備 制備管, 2毫升 微量離心管,1.5毫升 微量離心管, RNA酶 A, 緩沖液 S1, 緩沖液 S2,緩沖液 S3,緩沖液 W1, 緩沖液 W2 濃縮液，Eluent洗脫液。

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，試劑盒中試劑包括緩沖液 W1，緩沖液 W2濃縮液，緩沖液 DE-A，緩沖液 DE-B，Eluent洗脫液。

RNA引物混合液，包含模版RNA，隨機引物，無RNA酶雙蒸水等。

反轉錄反應液，包含模版RNA引物變性溶液，隨機引物，5倍濃度M-MLV 緩沖液，dNTP混合物，RNA酶抑制劑，RNA酶M-MLV，無RNA酶雙蒸水。

一次性口罩，一次性手套，實驗工作服，超凈工作臺，恒溫培養箱，制冰機，研缽，移液器，槍頭，無DNA酶和RNA酶的收集管，1.5毫升收集管，2毫升收集管,制備管，離心機，恒溫水浴鍋，振蕩器，冰盒，酒精燈，蒸餾設備和用品（50毫升燒杯，蒸餾頭，100℃溫度計，冷凝管，接引管，三角瓶，鐵夾，鐵環，酒精燈，沸石，50m量筒，鐵架臺），PE管，PCR儀，錐形瓶，微波爐，水平電泳槽，電泳儀，電泳儀電源，記號筆，衛生紙，玻璃涂棒。原理與方法

2.1 獲取目的基因 2.1.1提取RNA RNA提取的原理就是將細胞破碎裂解，利用一些試劑去除多糖、酚類、蛋白和DNA的污染，通過一系列的抽提、洗滌和沉淀，最終得到純凈的RNA的過程。影響RNA提取質量的因素有很多，尤其是RNA酶的污染。RNA酶無處不在，包括破碎細胞內的RNA酶,實驗室空氣、實驗臺上的酶，實驗所用試劑中的酶,實驗人員身上攜帶的酶以及實驗器材的污染等等，而且RNA酶性質穩定，實驗室很難做到完全隔離這個酶的作用[4]。RNA提取試劑盒的通病就是A260/A230普遍偏低，主要是因為RNA樣品中易殘留RNA酶的變性劑異硫氰酸胍和β-巰基乙醇，細胞裂解不徹底，導致核糖核酸不能完全釋放出來。另外，有些細菌的細胞壁堅韌，一般溫和的破壁方法很難將其完全破碎，降低了核糖核酸的量[5]。

本實驗使用美國Omega RNA提取試劑盒。實驗前，酒精充分消毒實驗臺、實驗室空氣，戴棉手套取適量液氮置于保溫瓶中，將用酒精沖洗過的研缽泡入液氮中，同時將鴨的肝組織泡入液氮中，待兩者充分冷凍，在研缽中研碎鴨肝組織。

操作步驟包括取適量組織粉末置于無DNA酶和RNA酶的收集管中，離心，5000轉/分鐘，5分鐘，4℃。加1毫升RNA-Solv試劑，振蕩混勻，室溫孵化3分鐘。加0.2 毫升氯仿（每1 毫升 RNA-Solv與組織混合液加0.2 毫升氯仿），蓋好管蓋，用手劇烈振蕩15秒，冰上孵育10分鐘。隨后4°C，12000轉/分鐘，離心10分鐘，離心后混合物分三層，RNA存在于最上層水相。將五分之四的RNA水層置于新的收集管，加三分之一收集管的無水乙醇。輕微混勻并離心后，小心吸出不大于700 微升的上層RNA水層液體于無RNA酶的制備管中，振蕩混勻沉淀，離心，10000轉/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。重復上一步驟，再次離心，10000轉/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。將制備管置于新的2毫升收集管，加400微升RNA Wash 緩沖液 I，離心，10000轉/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液。用同一收集管，加500微升RNA Wash 緩沖液 II，離心，10000轉/分鐘，1分鐘，20℃，棄去濾液，隨后用空收集管離心，13000轉/分鐘，2分鐘，20℃，完全干燥。干燥可使用的方法亦有用移液器將離心管內殘余的液體吸出，打開管蓋，將沉淀于超凈臺上晾5分鐘；或將裝有沉淀的管子蓋緊蓋子后，放進一次性手套中，然后打開管蓋，稍微包扎手套后，于50°C烘箱中放置3分鐘。最后洗提RNA，將制備管置于新的1.5毫升收集管，加入40微升的DEPC水，確保加入到制備管中央，隨后室溫靜置2分鐘，離心，13000轉/分鐘，1分鐘，20℃。得到的RNA保存在超低溫冰箱。2.1.2 RNA反轉錄為cDNA 反轉錄是以RNA為模板,通過反轉錄酶催化,以dNTP為原料，合成DNA的過程，是DNA

生物合成的一種特殊方式。反轉錄過程由反轉錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶，即以RNA為模板催化DNA鏈的合成，合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA（cDNA）。反轉錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物，在tRNA3′末端上，按磷酸到五碳糖(5'-3')的方向方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成過程[

6、7]。

操作步驟包括收集管中配制模版RNA引物混合液，為6微升體系，包含模版RNA2微升，隨機引物1微升，無RNA酶雙蒸水3微升。70℃保溫10分鐘后迅速在冰上急冷2分鐘以上。離心數秒種使模版RNA引物的變性溶液聚集于收集管底部。在收集管中配制反轉錄反應液，為10微升體系，包含上述模版RNA引物變性溶液6微升，隨機引物1微升，5倍濃度M-MLV 緩沖液2微升,dNTP混合物0.5微升，RNA酶抑制劑0.25微升，RNA酶M-MLV0.5微升，無RNA酶雙蒸水0.75微升。因為本實驗使用隨機引物，所以先于30℃恒溫水浴鍋保溫10分鐘，然后42℃保溫60分鐘。70℃保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA做好標記并保存于超低溫冰箱。2.1.3 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，它的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加[8]。聚合酶鏈式反應是利用DNA在體外95℃高溫時變性會變成單鏈，低溫(經常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72°C左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制以得到多量脫氧核糖核酸[

9、10]。

本實驗第一次聚合酶鏈式反應是用兩對引物分別擴增cDNA為DNA,目的是判斷哪一對引物擴增效果好，選擇其進行DNA擴增。準備步驟包括制作雙蒸水，首先取蒸餾水200 微升，于超凈臺點燃酒精燈，安裝設備對蒸餾水再次蒸餾，PE管分裝后放置于-20℃保存，注意操作完成后用酒精棉擦拭雙手，禁用雙手觸碰PE管口。RNA引物獲取，是將目的基因送至博士生物公司，由其進行引物的設計與合成；合成的引物經過真空冷凍干燥，呈薄膜狀附在離心管中，盛有引物的離心管經過離心后開啟，隨后加入規定量的雙蒸水合上管蓋充分振蕩使其溶解，備用。

操作步驟包括準備四個PE管，并分別標記為1-

1、1-

2、2-

1、2-2，將兩對引物分別加入兩個模版中，配制25微升體系，每管加入r-Tag酶12.5微升，上下游引物各0.25微升，dNTP1微升,模版3微升，雙蒸水11微升。將所有PE管振蕩，并瞬時離心一次，使管壁沒有殘留混合液，隨后擺到雙面板上；使用PCR擴增儀進行RNA擴增，打開電源開關，設置運行條件為94℃、5分鐘，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分鐘,72℃、10分鐘，4℃、保存時長，循環30次。

2.2 回收目的基因

2.2.1 核酸電泳

核酸電泳，其中利用了瓊脂糖凝膠，瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然后倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度[11]。將凝膠置電場中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網孔向陽極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩沖液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當時間后，大小、構象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA[12]，一般來說，需要分離的目的基因片段越大，瓊脂糖濃度越小，凝膠密度越小，反之亦然。樣品加入量加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA中片段的數量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散。每孔點樣的體積一般少于25微升，吸取每一個樣品時，操作需謹慎，沒有顏色的樣品需要加入填充劑。另外，電泳系統須加入適宜DNA標準參照物進行判定，過大或過小的標準參照物姐不利于判定結果。

PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳準備步驟包括核酸用瓊脂糖凝膠制作，配制1%的瓊脂糖凝膠，首先稱取1.000g瓊脂糖加入錐形瓶中，倒入100毫升電泳緩沖液TAE(50倍濃度TAE20毫升加1升水，混勻)，搖晃混勻后用封口膜封住瓶口后在微波爐內加熱兩三分鐘，在水龍頭上沖涼冷卻至60℃左右后加入10微升EB替代染料，在此過程中注意自身防護。同時用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子，將配好的瓊脂糖凝膠液體倒入電泳槽，凝固約20分鐘。溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊，倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，影響電泳結果。

將完全凝固的瓊脂糖凝膠放置在加有緩沖液的電泳槽，緩沖液一定要沒過凝膠，由負極到正極電泳；瓊脂糖加樣時用移液搶將樣品加至點樣孔，動作穩重注意不要戳破凝膠導致濾液，點樣是每孔加50微升樣品混合液，標準參照物加10微升；接通電泳儀電源，調節電流為120A，電壓為120V，開始電泳；約20分鐘后樣品跑到五分之四凝膠寬度，取出電泳膠，觀察結果，以確定擴增目的基因引物為第一對或第二對(圖1)。

圖1 引物選擇PCR結果

Figure 1 The result of PCR for primer choice 2.2.2 膠回收

cDNA擴增引物選擇結果顯示引物2的擴增效果較引物1好，因此選擇引物2進行目的基因擴增。加入第二對引物進行第二次的聚合酶鏈式反應擴增DNA并回收產物，擴增使用高保真的連接酶。配制50微升體系，每管加入緩沖液15微升，高保真酶La Tag0.3微升，上下游引物各1.2微升，dNTP5微升,模版3微升，雙蒸水24.3微升，隨后將PE管振蕩，并瞬時離心一次，使管壁沒有殘留；使用PCR擴增儀進行RNA擴增，運行條件為94℃、5分鐘，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分鐘,72℃、10分鐘，10℃、保存時長，循環40次。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，配膠過程同上，點樣時，每孔加50微升樣品混合液和5微升Loading，然后接通電泳儀電源，調節電流為120Ma，電壓為120V，開始電泳。約20分鐘跑膠完成，觀察結果（圖2）。為對瓊脂糖凝膠電泳的某一核酸條帶做進一步分析，可對DNA進行膠回收

[

13、14]。

圖2 cDNA擴增結果

Figure 2 cDNA amplification results 本實驗使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒對目的片段切膠回收。準備步驟包括緩沖液 W2濃縮液中加入一定體積的無水乙醇，原因是此為第一次使用凝膠回收試劑盒。準備無核酸或核酸酶污染的Tip頭、離心管。準備75℃水浴。試用前，檢查緩沖液 DE-B是否出現沉淀，如出現應于70℃水浴加熱并溶解。

操作步驟包括戴上防護帽在紫外燈下切下含有目的基因的DNA的瓊脂凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎，計算凝膠重量，用加入凝膠后稱量重量減去提前記錄的1.5毫升離心管重量，該重量作為一個凝膠體積。加入3個凝膠體積的緩沖液 DE-A，混合均勻后于75℃加熱，每而兩三分鐘間斷混合，直至凝膠完全融化。加0.5個緩沖液 DE-A體積的緩沖液 DE-B，混合均勻。吸取上一步中的混合液，轉移到DNA制備管，制備管置于2毫升離心管，離心，12000轉/分鐘，1分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，加500毫升 緩沖液 W1，離心，12000轉/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，加700毫升 緩沖液 W2，離心，12000轉/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。以同樣的方法加700毫升緩沖液 W2洗滌一次，離心，12000轉/分鐘，0.5分鐘，棄去濾液。制備管置回2毫升離心管，離心，12000轉/分鐘，1分鐘，棄去濾液。將制備管置于潔凈的1.5毫升離心管中，在制備膜中央加30微升 Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘，離心，12000轉/分鐘，1分鐘，洗脫DNA。得到的DNA保存至超低溫冰箱。2.3 DNA分子體外連接

本實驗采用卡那霉素抗性T載體連接，此步驟即重組DNA分子，為目的基因導入細菌細胞并復制的必要條件。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步:首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物;然后，酶-ATP復合物再結合到具有5'磷酸基和3'羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化;最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h過夜，這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。

T載體連接操作時，首先于小PCR管中配制50微升體系，包括Solution I 5微升，回收產物4.5微升，T載體0.5微升。隨后混勻并于16℃連接過夜，連接時間至少8小時。2.4 轉化

外源 DNA 與載體分子的連接即為 DNA 重組技術，這樣重新組合的 DNA 分子叫做重組子。將重組質粒導入感受態細胞中，將轉化后的細胞在選擇性培養基中培養，可以通過抗生素篩選法篩選出重組子，并可通過限制性核酸內切酶酶切，電泳，根據DNA Maker標準判斷陽性重組子中是否含有目的基因。感受態細胞制作原理為細菌在0°C氯化鈣低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態[15]。轉化是將外源 DNA 分子導入到受體細胞，即原核細胞或者真核細胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法[16]。基因克隆中的轉化過程原理為質粒DNA或重組DNA粘附在細菌細胞表面，經過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA.然后在非選擇培養基中培養一代，待質粒上所帶的抗菌素基因表達，可以在含抗菌素的培養基中生長，從而鑒別選擇出轉化子。

準備步驟包括配制LB培養基、LB固體培養基、含抗生素LB培養基。首先，每升LB培養基，需在超純水中加入蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，溶解混勻；LB固體培養基是在每升LB培養基中加入15克瓊脂糖，混勻加熱溶解；制作含氨芐霉素培養基，稱量固體LB微波爐加熱3分鐘，沖冷水至不燙手，按1：1000比例加入氨芐霉素，倒薄薄的一層于培養皿中，待其凝固，蓋上培養皿蓋子，倒置并標記。

操作步驟包括準備冰盒，打開42℃水恒溫浴鍋，將無抗LB提前放入37℃預熱；從超低溫冰箱取出E.coli DH5a 感受態菌株，將商品化DH5a 感受態細胞快速且溫柔取于冰中，待其于冰中融化；在超凈工作臺作業，吸取10微升載體連接產物，緩慢加入感受

態中，反復抽吸三次混勻，動作需輕微，防止產生氣泡，放入冰盒30分鐘；將樣品放入42℃中熱激90秒，此為轉化必須環節；冰浴2分鐘，使其停止轉化過程；將預熱的無抗LB8微升加入樣品中，放入搖床45分鐘至60分鐘，復蘇感受態細胞；將涂菌棒用酒精燈滅菌，從冰箱取出培養基放入37℃溫箱預熱；將搖好后的樣品4000g離心5分鐘，棄去上清600微升，余200微升，目的是使得細菌濃度升高，將剩余200微升樣品混勻，加到培養板上，用滅菌放涼的涂菌棒涂勻；涂菌后的培養基保存于37℃恒溫箱過夜。

培養大腸桿菌，在培養基上37℃恒溫培養大腸桿菌過夜，長出的菌落呈乳白色大圓點狀菌，表面和背面顏色一致，菌落邊緣整齊均勻，表面光滑濕潤,分散分布于整個培養皿（圖3）。隨后挑菌、搖菌、獲得菌液，用于篩選、抽提鑒定質粒。挑菌時在細菌間超凈工作臺作業，取10只試管標號，依次擺到試管架上，灼燒試管蓋和鑷子，用鑷子拔下試管蓋后，在此灼燒試管口和試管蓋，倒入約三分之一的氨芐抗性LB，用鑷子夾槍頭挑去細菌，連同槍頭扔進試管，灼燒管口和試管口，在火焰中蓋上試管蓋。搖菌是在37℃搖床，過夜后就得到了菌液。余下的菌落用封口膜封上放入4℃冰箱中保存。

圖3 轉化后大腸桿菌培養結果

Figure 3 The result of the e.coli bacteria after transformation 2.5 抽提鑒定質粒

質粒是在細菌細胞中染色體之外能夠自主復制的共價閉合環狀雙螺旋的分子或遺傳因子。質粒抽提原理即去除 RNA，且將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒[

17、18]。

本實驗采用AxyPrep質粒DNA小量試劑盒抽提質粒。

準備步驟包括RNA酶 A全部加入緩沖液 S1中并4℃貯存。準備無核酸或核酸酶污染的Tip頭、離心管。緩沖液 W2濃縮液中加入指定體積的無水乙醇，原因是第一次使用試劑盒。試用前，檢查緩沖液 S2是否出現沉淀，如有沉淀應于37℃水浴加熱并溶解。

操作步驟包括取2毫升在LB培養基中培養過夜的菌液，12000轉/分鐘,離心1分鐘，棄盡上清。加250微升緩沖液 S1懸浮細菌沉淀，懸浮需要均勻，不能夠有小的菌塊，確認緩沖液W2中已加入無水乙醇。加250毫升，溫和并充分地上下翻轉6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步驟需要控制在5分鐘之內。使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的和中的中和，降低溶菌效率。避免劇烈搖晃，否則可能導致基因組DNA的污染，此步驟需要控制在5分鐘之內。采用離心法純化質粒，吸取上一步驟中的離心上清并轉移到制備管，12000轉/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；將制備管置回離心管，加500微升 緩沖液 W1，12000轉/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；加700微升 緩沖液 W1，12000轉/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；加700微升 緩沖液 W1，12000轉/分鐘,離心1分鐘，棄去濾液；將制備管置回2毫升離心管中，12000轉/分鐘,離心1分鐘。將制備管移入新的1.5毫升離心管中，在制備管中央加80 微升的Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘，12000轉/分鐘,離心1分鐘，將Eluent或去離子水加熱至65℃能提高洗脫效率。隨后，質粒測序鑒定目的基因是否插入。菌液PCR后使用隨機引物進行通測，引物合成及測序由北京華大生物公司完成（圖4、5）。

圖4 質粒基因組堿基序列

Figure 4 Plasmid genome base sequence

圖5 質粒基因組測序峰

Figure 5 Plasmid genome sequencing 3 討論

本文構建的目的基因LC3有關自噬活動，近年來，自噬在癌癥免疫因素感染炎癥和神經退行性變等領域的研究不斷增加，準確地檢測自噬基因對于研究自噬的生物學功能至關重要，根據LC3的特點構建重組質粒，從而獲取大量LC3基因可作為自噬研究的組成環節。

本實驗采用反轉錄的方法獲取cDNA后，依據PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳效果顯示第二對引物擴增的條帶比較清晰,由此選擇第二對引物進行擴增，得到相應目的基因。采用T載體連接方法，將目的基因引入感受態大腸桿菌，進行基因克隆。轉化子擴增后，將轉化成功的質粒提取出，進行電泳、測序等進一步鑒定。轉化后質粒的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示出現約600bp的明亮條帶,為目的基因條帶，說明目的基因成功導入細菌質粒并復制，進一步的基因測序鑒定結果表明實驗完成了鴨RFP-GFP-LC3重組質粒的構建。最后使用試劑盒提取并純化質粒，得到多量目的基因LC3。

整個過程的每個環節中皆包含影響實驗結果的因素，各個因素稍有變化既可能對實驗結果造成量或質的影響，現將需要注意的幾個重要因素及其影響討論如下： 3.1試劑

試劑使用前應當仔細閱讀說明書。如用于提取RNA的Omega RNA提取試劑盒，其中的緩沖液 W2 濃縮液在提取開始或貯存在室溫條件前，必須用無水乙醇稀釋，如果使用了未經處理濃縮液，則無法充分洗滌RNA，使得最后產物中存在大量雜質。3.2 核酸酶

注意保證實驗環境中RNA酶量最小化，操作過程應迅速且謹慎，始終戴一次性橡膠手套，并經常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶到試管或污染用具；避免在操作中說話聊天，戴口罩以防止引起RNA酶污染；配制溶液用的酒精、異丙醇等應采用未開封的新瓶，使用專門配制的無RNA酶制備管、收集管。酶如果沒有被充分隔絕，將減少甚至提取不出RNA。3.3 核酸電泳緩沖液

瓊脂糖核酸電泳的緩沖系統在高離子強度的緩沖液中，電導很高并產熱，可能導致DNA變性，因此應注意緩沖液的選擇和濃度，而且不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。

DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響，凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，否則將導致實驗結果參照不準。3.4 膠回收效率

將凝膠切成細小的碎塊可大大縮短凝膠融化時間，從而提高回收率；勿將含DNA的凝膠長時間地暴露在紫外燈下，減少紫外燈對DNA造成的損傷；融化凝膠時應當完全，避免殘留降低回收率，以及阻塞制備管濾膜影響后續步驟也會降低回收效率。3.5 DNA酶切位點

基因克隆時選擇載體DNA酶切位點時應注意兩個酶切位點的距離不應過小，否則影響限制性內切酶識別切點；目的基因片段內部不應含有所選的酶切位點；實驗后繼應用的所有載體都盡可能含有所選的酶切位點，并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）[20]；選擇較常用的酶切位點，兩個酶切點至少隔上3個堿基；使用酶切效率高，且雙酶切有共同緩沖液的酶。3.6 轉化效率

為了提高轉化效率, 實驗中要考慮細胞生長狀態和密度，不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液；細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600 來控制，DH5α菌株的OD600 為0.5 時,這時比較合適，密度過高或不足均會影響轉化效率。

質粒的質量和濃度方面應注意用于轉化的質粒DNA 應主要是超螺旋態DNA，轉化效率與外源DNA 的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA 的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低，1納克的超螺旋態DNA 即可使50微升的感受態細胞達到飽和，一般情況下,DNA 溶液的體積不應超過感受態細胞體積的二十分之一[

18、19]。

試劑的質量方面應注意所用的試劑,如氯化鈣等均需是最高純度的，并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處；防止雜菌和雜DNA 的污染，整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管,Tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所污染[20], 否則均會影響轉化效率或雜DNA 的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。3.7 試劑盒

本實驗使用了若干試劑盒，例如AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質粒DNA小量試劑盒、美國Omega RNA提取試劑盒，使操作能夠擺脫繁重的試劑配制及優化過程，試劑盒中配備有相應使用說明書，按照說明書不需或只需少量的優化即可得到滿意的結果，使用試劑盒時要根據自己的實驗需要選取專用提取試劑盒，如果不是專用試劑盒，提出的RNA不能確保其質量以及完整性，會影響RT-PCR、基因克隆、抽提質粒等后續實驗的結果。

參考文獻

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附錄1：離心力和離心轉速換算計算公式

RCF= 1.118 ×10-5×N2 ×R RCF表示相對離心力，單位為g N表示轉速，單位為rpm（轉/分）R表示離心半徑，單位為cm。

本實驗使用的離心機離心力和離心轉速換算如下： 12000rpm=13205rcf 13000rpm=15497rcf

附錄2：試劑穩定性

AxyPrep質粒DNA小量試劑盒，試劑穩定性及貯存條件如下：

RNA酶 A，室溫可以貯藏6個月，長期貯存于-20℃；緩沖液 S1為細菌懸浮液，加入RNA酶 A后，混合均勻，4℃貯存；緩沖液 S2為細菌裂解液，室溫密閉貯存；緩沖液 S3為中和液，室溫密閉貯存；緩沖液 W1為洗滌液，室溫密閉貯存；緩沖液 W2為濃縮液或去鹽液，使用前，按照試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存；Eluent為洗脫液，室溫密閉貯存。的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，試劑穩定性及貯存條件如下：

緩沖液 W1為洗滌液，室溫密閉貯存；緩沖液 W2 為濃縮液，又稱去鹽液，使用前，按照試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存；Eluent為洗脫液，室溫密閉貯存；緩沖液 DE-A為凝膠融化劑，含DNA保護劑，防止DNA在高溫下降解，室溫密閉貯存；緩沖液 DE-B為結合液，室溫密閉貯存。