基因工程的工具

一．基因工程

1.基因工程的別名：基因拼接技術或DNA重組技術

2.操作對象：基因

3.操作水平:DNA分子水平

4.原理：基因重組

5.不同生物DNA能拼接的原因：DNA規則的雙螺旋結構

6.一種生物的基因可以在另一種生物體內表達的原因：生物共用一套遺傳密碼子

二．DNA重組的基本工具

三種工具

限制酶

兩種工具酶

DNA連接酶

載體

1.限制酶（限制性核酸內切酶）

（1）來源：主要來自原核細胞

（2）作用：識別和切割特定DNA序列

（不能識別切割RNA和單鏈DNA）

（3）限制酶作用與磷酸二脂鍵，不作用氫鍵。

（4）限制酶是一類酶而不是一種酶，不同限制酶識別不同的DNA序列，限制酶具有特異性。

（4）末端：

平末端

粘性末端

（5）單酶切缺點：使目的基因和載體自身環化

使目的基因反向插入載體中

（6）雙酶切的優點：防止目的基因和載體自身環化

使目的基因和載體正確連接

（7）用同種酶處理載體和目的基因的原因：

切割后獲得的（粘性）末端相同。

2.DNA連接酶

（1）DNA連接酶連接的是磷酸二脂鍵，但不連接氫鍵。

（2）不具有特異性

（3）分類

E．coli

DNA連接酶（存在于大腸桿菌中）：

只連接粘性末端

T4DNA連接酶（存在T4噬菌體中）：

連接粘性末端和平末端，但連接平末端的效率低

3.載體

（1）載體的作用：

作為運輸工具將目的基因導入受體細胞

攜帶目的基因在受體細胞內大量復制

（3）具備條件

1)能在受體細胞中復制并穩定存在2)有一個或多個限制酶切割位點，供外源DNA片段插入

3)具有標記基因，供重組DNA的選擇與鑒定

基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟：

目的基因的獲取

基因表達載體的構建（關鍵步驟）

將目的基因導入受體細胞

目的基因的檢測與鑒定

一.目的基因的獲取

1.獲取目的基因常用的方法

（1）從基因文庫中獲取目的基因

（2）利用PCR技術擴增目的基因

（3）人工合成2.從基因文庫中獲取目的基因

基因組文庫

（1）基因文庫

部分基因文庫（如：cDNA文庫）

（2）基因組文庫與cDNA文庫的比較

基因組文庫中有啟動子，終止子，內含子

cDNA文庫中沒有啟動子，終止子，內含子

3.利用PCR技術擴增目的基因

（1）原理：DNA雙鏈復制

（2）條件：

要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。

（3）原料：模板DNA，Taq酶，引物，三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）

（4）過程：

變性：加熱至90～95℃，DNA解鏈；

退火：冷卻到55～60℃，引物結合到互補DNA鏈；

延伸：加熱至70～75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。

（5）注意

引物需要滿足條件：

引物1和引物2結構上不能互補，單個引物不能自身互補

引物GC含量高，則退火溫度高

三磷酸脫氧核苷酸轉變為脫氧核苷酸過程中，脫去磷酸基團釋放高能磷酸鍵中能量。

二．基因表達載體的構建

（基因表達載體的構建是基因工程的核心）

1.目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用。

2.組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因

目的基因：插入啟動子和終止子之間

啟動子

位置：基因的首端

功能：是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA

終止子

位置:基因的尾端

功能：終止轉錄

標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因

復制原點：起始復制

三．將目的基因導入受體細胞

1.轉化的概念：

是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。

2.受體細胞的選擇

動物：受精卵

受精卵具有全能性，能發育成完整的個體

植物：體細胞

植物的體細胞具有全能性，能發育成完整的個體

微生物：

原核（大腸桿菌）：繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少

真核（酵母菌）：真核細胞具有內質網高爾基體，能對蛋白質進行加工修飾

3.常用的轉化方法：

（1）將目的基因導入植物細胞：

農桿菌轉化法（用于雙子葉植物，裸子植物）植物細胞最常用的方法

基因槍法（常用于單子葉植物）

花粉管通道法

（2）

將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術

（3）

將目的基因導入微生物細胞：Ca離子處理

用Ca離子處理細胞的目的：

使大腸桿菌成為感受態細胞，更容易吸收重組DNA分子

4．注意

（1）受體細胞是植物細胞，需要經過植物組織培養技術

（2）受體細胞是動物細胞，需要經過早期胚胎培養和胚胎移植

顯微注射技術

早期胚胎培養

目的基因

受精卵

早期胚胎

胚胎移植

雌性動物的子宮

發育成具有新性狀的動物

5.重組細胞導入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據是標記基因是否表達。

6.農桿菌轉化法

四．目的基因的檢測與鑒定

（1）分子水平鑒定

1.檢測

轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因

方法是采用

DNA分子雜交技術。

2.檢測

目的基因是否轉錄出了mRNA

方法是采用核酸分子雜交技術

3.檢測

目的基因是否翻譯成蛋白質

方法是采用抗原－抗體雜交技術

DNA分子雜交技術，核酸分子雜交技術原理為堿基互補配對原則，探針為放射性同位素標記的目的基因。判斷依據：是否出現雜交帶。

抗原抗體雜交技術原理為抗原抗體特異性結合，例如檢測受體細胞是否表達出胰島素，用胰島素抗體檢測

（2）個體生物學水平的鑒定

轉基因生物

檢測方法

觀察指標

抗蟲植物

接種害蟲

害蟲是否死亡

抗病植物

接種病毒（菌）

是否出現病斑

抗鹽植物

鹽水澆灌

是否正常生長

抗除草劑植物

噴灑除草劑

是否正常生長

獲取目的基因產物的轉基因生物

提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較

細胞產物功能活性是否正常

一植物基因工程

1.抗病轉基因植物所采用的目的基因：

病毒外殼蛋白基因，病毒的復制酶基因，2.抗真菌轉基因植物所采用的目的基因：

幾丁質酶基因，抗毒素合成基因

二．動物基因工程

1.將腸乳糖酶基因導入奶牛基因組，獲得的轉基因牛能表達出腸乳糖酶，腸乳糖酶能將乳糖分解成半乳糖，從而降低牛奶中的乳糖含量。

2．乳腺生物反應器

顯微注射

早期胚胎培養

藥用蛋白基因+乳腺蛋白基因的啟動子

受精卵

早期胚胎

胚胎移植

泌乳期

子宮

轉基因動物

分泌乳汁

提取藥物

（2）藥用蛋白基因前插入乳腺蛋白基因的啟動子，目的是使藥用蛋白基因只在乳腺組織細胞中表達

（3）膀胱生物反應器的優點

不受性別限制

不受個體發育時期的限制

3.器官移植

器官移植的兩大難題：器官短缺和免疫排斥

從供體角度降低免疫排斥：

1）向器官供體基因組中導入某種調節因子，以抑制抗原決定基因的表達

2）設法除去抗原決定基因

4.基因治療

基因治療是把正常基因導入有基因缺陷的細胞中，使正常基因的表達產物發揮作用，原來的缺陷基因仍然存在。