第一篇：斑馬魚早期胚胎背腹發育中ripply1的作用論文

胚軸（embryonic axes）形成是多細胞生物軀體模式（body plan）建立的一個重要過程，主要包括前-后軸（anterior-posterior axis）、背-腹軸（dorsal-ventral axis）和左-右軸（left-right axis）.對兩棲動物胚胎的研究發現背-腹軸早在受精后即可觀察到，如爪蛙胚胎皮層轉動形成的灰色新月區在后期發育成背部。德國發育生物學家 Hans Spemann 和他的學生 Hilde Mangold 將原腸早期蠑螈胚胎的背部組織移植到另一種蠑螈胚胎的腹部，得到了形成雙體軸的胚胎，次級體軸的脊索來自于供體胚胎，而神經管和體節多數來自于受體，這說明該背部組織能誘導周圍受體胚胎的細胞形成神經管，首次提出了胚胎誘導的概念并稱該背部組織為組織者（or-ganizer）.ripply 家族蛋白在 2005 年被發現并揭示了其部分功能[1],研究發現 ripply1 和 ripply2 特異表達于體節，其中 Ripply1 蛋白與轉錄輔抑制因子 Groucho 結合，能夠終止分節基因的表達，維持體節的前后極性。之后對 ripply1 的研究都集中在其在體節時期對體節發生的作用，而其在早期胚胎模式發生的作用卻研究甚少。但最近在爪蛙中的研究發現 ripply家族蛋白能通過其 WRPW 區域結合多梳蛋白（Polycomb group proteins）起轉錄去抑制的作用，并且在背-腹軸形成過程中起重要作用[2].然而，rip-ply 家族基因在胚胎發育早期的表達圖式和調節方式還不清楚。并且，ripply3 是人的唐氏綜合征關鍵區域基因 6（Down syndrome critical region gene 6,dscr6）的同源基因[3].因此，研究 ripply 家族基因的功能和作用機制能為人類遺傳疾病的致病機理提供信息。我們通過原位雜交技術發現 ripply1 在斑馬魚早期胚胎中特異表達在背部，因此推測其可能參與背腹發生。故而通過過 表 達 ripply1,并 調 取1.2 kb的啟動子片段，初步研究其在胚胎早期背腹發生的作用。材料和方法

1.1 材料

AB 品系的斑馬魚養殖在 28.5℃ 的循環水系統中，如早期工作所描述[4].1.2 方法

1.2.1 獲取 ripply1 cDNA取斑馬魚胚盾（shield）時期的胚胎 50 枚，用 Tr-izol 方法提取胚胎總 RNA,使用 Transgene 公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒反轉錄，詳細步驟參見使用說明書。

1.2.2 斑馬魚 ripply1 整胚原位雜交調取 ripply1 全長 cDNA,引物序列如下 ripply1-F: 5 '-CAGCGCCAAACAAAACG-3 ',ripply1-R: 5 '-TCAAATTCGCACAGACGG-3',使用 Taq 酶擴增后將其連入 pGEM-T 載體中。根據測序方向合成地高辛標記的反義 RNA 作為探針使用。其他探針如goosecoid（gsc）、chordin（chd）、floating head（flh）、even-skipped-like 1（eve1）、T-box6（tbx6）、wnt8a 詳見作者以前的工作[5].合成的 ripply1 反義 RNA 用原位雜交液 hyb+（50%甲酰胺，5 × SSC,0.1% Tween-20,0.5 mg/mL酵母 RNA,0.05 mg/mL 肝素）稀釋至 1 ng/μL.收集不同時期的斑馬魚胚胎，固定于 4% 多聚甲醛中過夜。過渡到含 0.1% Tween-20 的 PBST 中，并在PBST 中將胚胎膜剝去，用 PBST 洗過后在原位雜交液 hyb-（50% 甲酰胺，5 × SSC,0.1% Tween-20）中65℃ 孵育 10 min,之后在 hyb+中 65℃孵育 4 h.探針 60℃ 孵育過夜。第 2 天吸出探針以重復使用。

胚胎用洗液 I（50% 甲酰胺，2 × SSC,0.1% Tween-20）洗 30 min（60℃）,重復 1 次； 用洗液 II（5% 甲酰胺，0.2 × SSC,0.1%Tween-20）洗15 min（60℃）,重復 1 次； 用洗液 III（0.5% 甲酰胺，0.02 × SSC,0.1% Tween-20）洗 30 min（60℃）,重復 1 次。然后用 MABT 在室溫下洗3 次，用封閉液封閉4 h.偶聯堿性磷酸酶的地高辛抗體 1∶ 2500 稀釋于封閉液中，4℃ 孵育過夜。第 3 天吸出抗體以重復使用，用MABT 在室溫下洗 30 min,重復 1 次； 用 PBST 在室溫下洗 30 min,重復 1 次； 在平衡緩沖液（0.1 mol/LNaCl,0.1 mol / L Tris-HCl pH 9.5,0.05 mol / L MgCl2,0.1% Tween-20）中平衡 10 min,加顯色液（5 mL平衡緩沖液中加100 μL 60 mg/mL 左旋咪唑，100 μLNBT / BCIP）,室溫避光，待信號足夠強加多聚甲醛終止反應，在70%酒精中脫去浮色，拍照觀察。

1.2.3 顯微注射 ripply1 mRNA顯微注射方法詳見早期工作[5].ripply1 mRNA注射劑量為每個胚胎 200 pg.1.2.4 ripply1 啟動子序列及轉基因魚的獲得從基因組中調取 ripply1 基因組上游約 1.2 kb的片段，引物如下： promoter-F: 5'-ATTCTCGAGG-GATCCAAAACAGCTTAT-3',promoter-R: 5 '-ATTA-GATCTGAATGAATGAAGGCGCGT-3'.并且在上下游引物中分別引入 Xho I 和 Bgl II 酶切位點，雙酶后切連入 pT2A200R150G 載體。

單獨注射該質粒觀察胚胎是否有熒光。有熒光后將該質粒和轉座酶 mRNA 共注射，劑量均為 50pg,待該批注射的斑馬魚 F0 代性成熟后外交，篩選后代胚胎有特異熒光的 F1 代。結果

2.1 整胚原位雜交揭示 ripply1 在斑馬魚早期胚胎發育過程中的表達模式為了明確 ripply1 是否參與早期背-腹軸的形成，我們首先利用整胚原位雜交檢測該基因的時空表達圖式。結果顯示 ripply1 母源表達，但表達水平低。在原腸作用早期即胚環期表達增強且集中在預定背部的胚盾位置，在胚盾期 ripply1 在背部的表達繼續增強，并且向側部延伸。在原腸期，隨著細胞運動的進行，ripply1 主要表達在前脊索板中胚層和后部將要形成的體節中，但在脊索中胚層中沒有表達（圖 1）.這個表達圖式暗示 ripply1 基因可能在背-腹軸和前-后軸形成過程中起調節作用。

2.2 高表達 ripply1 導致胚胎背部化

我們下一步對 ripply1 在背-腹軸形成中的作用進行了功能檢測。在胚胎 1 細胞期通過注射 rip-ply1 mRNA 進行高表達，收集胚盾時期的胚胎進行原位雜交。分別檢測背部標記基因 gsc、chd、flh 和腹部標記基因 eve1、tbx6、wnt8a 的表達。我們發現幾乎所有 ripply1 注射的胚胎背部標記基因 gsc、chd、flh 表達不但在背部增強并且明顯向腹側擴增。

相反，腹部標記基因 eve1、tbx6、wnt8a 表達明顯減弱（圖 2）.這個結果說明高表達 Ripply1 改變了背腹細胞的命運，使背部區域擴大。顯示 ripply1 能調節斑馬魚背部的發育。在 10 hpf（胚芽期）時觀察胚胎的表型，發現原本呈球形的胚胎前后伸長，呈現明顯的橢球形，這是典型的背部化表型（圖 3A,B）.24 hpf 后觀察胚胎，大多數胚胎（82/99）表現出背部化，其中 36 枚胚胎頭部增大，尾部缺失（圖 3C,D）,而 46 枚胚胎頭部明顯增大，體軸變短，尾部變短，無腹部尾鰭（圖 3E）,一小部分胚胎（6/99）甚至呈現雙體軸（結果未顯示）.這些表型進一步說明 ripply1 通過抑制胚胎后部發育來促進前部的發育。

2.3 ripply1 啟動子及轉基因斑馬魚

為了研究 ripply1 時空表達的調節機制，我們開展了對其啟動子的研究。獲得 ripply1 轉錄起始位點上游 1.2kb 的片段后，將其后加 EGFP,然后克隆到 pT2A200R150G 轉基因載體上（圖4A,B）.質粒注射后發現在胚盾期在胚盾處有特異的熒光表達（圖 4C,D）,體節期在體節處有特異的表達（結果未顯示）,說明該 1.2 kb 的片段能夠調控 ripply1 在斑馬魚胚胎中時空特異的表達。與轉座酶共注獲得轉基因魚 ripply1: EGFP 的 F0 代，發現其子代在 1細胞期即有熒光，直到胚盾期仍是泛表達（圖 5A-C‘）,可能是由于 EGFP 比較穩定，而母源的 ripply1比較容易降解。在體節期該熒光則特異定位在軀干（圖 5D,D’）.在 24 hpf,EGFP 信號主要集中在體節中（圖 5E）,而在成魚中，EGFP 信號主要集中在整個軀干部分（圖 5F-G‘）.