第一篇：微生物學(xué)讀書匯報

微生物與植物抗逆性

自然環(huán)境的各種因素是經(jīng)常變化的，旱澇冷凍鹽堿蟲害病害以及大氣、水質(zhì)、土壤污染等不良環(huán)境條件即為逆境或脅迫。植物在長期的系統(tǒng)發(fā)育中逐漸形成了對逆境的適應(yīng)和抵抗能力，這種適應(yīng)和抵抗能力稱為抗逆性。任何植物的抗逆性都不是驟然形成的。遇到逆境使，植物會做出反應(yīng)，這個逐步適應(yīng)的變化過程稱為鍛煉。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對作物產(chǎn)量影響最大的是病蟲害和干旱等。日愈嚴(yán)重的環(huán)境污染問題、食品安全問題對要求對現(xiàn)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用的化學(xué)農(nóng)藥提出嚴(yán)峻挑戰(zhàn)；在中國這樣一個干旱缺水狀況嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)大國，增強(qiáng)植物抗旱性是從事自然科學(xué)研究者研究的熱點(diǎn)。微生物學(xué)的快速發(fā)張，微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、工業(yè)生產(chǎn)加工等各領(lǐng)域的廣泛運(yùn)用，為植物抗逆性研究提供了新的思路，新的可能。

微生物運(yùn)用于植物病蟲害的防治是現(xiàn)今“綠色農(nóng)業(yè)”發(fā)展的新的出路。除了現(xiàn)在在廣泛研究的運(yùn)用“生物農(nóng)藥”等外部施用的生物制劑（大部分是微生物次生代謝產(chǎn)物或直接是微生物本身）防治植物病蟲害，許多研究發(fā)現(xiàn)，與植物共生或是營寄生生活的真菌、細(xì)菌等都有增強(qiáng)植物抗病蟲害能力的作用。許多感染植物的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生多種生物堿和真菌毒素如黑麥草堿、麥角堿、波胺和覃青毒素等，這些次生代謝物因?qū)κ巢輨游锖屠ハx等具有毒性，阻抑昆蟲和食草動物的采食、抵抗病蟲害等，從而能提高植物對多種食草昆蟲的抗性。其中較為人熟知和運(yùn)用較廣的就是蘇云金桿菌。有學(xué)者從黃瓜、小麥、白菜以及番茄四種植物莖中發(fā)現(xiàn)兩株植物內(nèi)生放線菌Lj20和St24，用其粗提物處理番茄植株后，測定了根、莖、葉中過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，發(fā)現(xiàn) CAT、PPO和POD酶的活性都有所增強(qiáng)的。結(jié)果表明，Lj20和St24的代謝物不僅對病原菌具有直接抑制作用，而且可通過提高植物體內(nèi)防御性酶活性來提高植物的抗病性。

內(nèi)生真菌對植物抗逆性的增益作用既表現(xiàn)在生物脅迫(如阻抑昆蟲和食草動物的采食、抵抗 病蟲害等)，也表現(xiàn)在非生物脅迫(如抗高溫、抗干旱等)方面。與植物共生或是營寄生的微生物除了對病原菌、害蟲有直接的抑制甚至殺滅的作用之外，還可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生許多的抗性因子。植物產(chǎn)生的植物效應(yīng)因子如絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)脫乙酰基酶、22kD木聚糖酶等。有學(xué)者研究木霉發(fā)現(xiàn)，木霉能產(chǎn)生的揮發(fā)性和非揮發(fā)性的抗菌次生代謝產(chǎn)物多達(dá)幾百種，能對細(xì)菌、真菌類引起的植物病有有效的防治作用，還可以誘導(dǎo)植物免疫形同基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對病害的防治。木霉菌誘導(dǎo)植物抗性可通過以下三種途徑實(shí)現(xiàn)：增強(qiáng)MAMPs分子（植物效應(yīng)因子）激發(fā)的免疫反應(yīng)；減少效應(yīng)因子誘發(fā)的感病性；提高效應(yīng)因子激發(fā)的免疫反應(yīng)。Sml是從綠木霉分泌物中分離出的一種富含半胱氨酸的疏水蛋白，不僅對植物和微生物無毒，還能誘導(dǎo)睡到、棉花和玉米活性酶的釋放以及多種防御反應(yīng)基因的表達(dá)，如MAPK基因可受木霉菌特異性誘導(dǎo)，而MAPK表達(dá)的MAPK蛋白是絡(luò)氨酸受體激酶信號通路中重要的效應(yīng)物質(zhì)，可調(diào)控多個基因的表達(dá)。研究表明，植物受到干旱脅迫時，會產(chǎn)生特定的滲透物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿等，一些寄生在植物中的菌類可以分泌特定物質(zhì)誘導(dǎo)植物相應(yīng)基因表達(dá)，從而提高植物的抗逆性。

自然界存在著大量的對人類有益的充滿潛力的微生物。然而，我們除了不斷的發(fā)掘其用途同時，也應(yīng)該注意對生態(tài)的維持。微生物大都處在生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)地位，在物質(zhì)循環(huán)中的扮演至關(guān)重要的角色。對微生物的利用不是不知節(jié)制地發(fā)掘最大的益處，而是在確保生態(tài)平衡的基礎(chǔ)上尋求人類生存的有利因素。

第二篇：微生物學(xué)讀書報告

讀書報告

——環(huán)境條件對微生物生長的影響

微生物的生長和繁殖受環(huán)境影響非常之大。微生物的數(shù)量極其巨大驚人，僅僅是人體身上就存在著2千克左右的微生物；其生長范圍極其廣泛，有高等微生物在的地方就有微生物在。而且微生物與人類的關(guān)系十分密切，像一把雙刃劍，給人類帶來利益的同時也帶了殘酷的破壞。那么，為了讓微生物這種資源得到更好的利用，了解環(huán)境與微生物的存活關(guān)系將有助于人們控制微生物的活性，殺死有害微生物，更好利用有益微生物。

影響微生物生長環(huán)境因素主要有物理、化學(xué)等方面。

高溫、常溫、低溫對微生物生長都有著很大的影響。溫度影響著微生物體內(nèi)酶的活性，影響著微生物的代謝……依照溫度將微生物分類有嗜溫，嗜熱，嗜冷等種類，嗜熱微生物就對發(fā)酵工業(yè)有著很重要的用途。高溫有利于非氣體物質(zhì)在發(fā)酵液中的擴(kuò)散和溶解；高溫可以還可以降低冷卻發(fā)酵產(chǎn)生熱量所需要的成本；嗜熱微生物生產(chǎn)的酶制劑的反應(yīng)溫度和耐熱性都比嗜溫微生物高尤其是DNA聚合酶有較強(qiáng)的熱穩(wěn)性。低溫可以降低酶促反應(yīng)的速度因此限制微生物的生長，于是我們可以利用低溫度對微生物代謝活動的影響，在生產(chǎn)實(shí)踐中用低溫來保藏微生物菌種和食品等。寒冷溫度適宜蔬菜制品的儲藏；冷藏溫度用于果蔬、魚肉、禽蛋、乳制品的保存；冷凍溫度則可以使食品冷凍成為固態(tài)加以保存，同時也用作菌種保藏。就像家里的電冰箱一樣，根據(jù)不同的需要將不同的食品放在不同溫度下進(jìn)行儲藏。高溫可破壞細(xì)胞的部分組成成分，可引起蛋白質(zhì)和核酸的不可逆變性，還可使質(zhì)膜熱溶解從而內(nèi)含物泄漏死亡。可見，高溫對微生物有著致命的殺傷力，高溫滅菌成了一種普遍的滅菌方法，其主要有干熱滅菌法，濕熱滅菌法，這些對物品的保存起著相當(dāng)重要的作用。

水分是微生物細(xì)胞的主要成分，也是微生物的正常生長的條件。大多數(shù)微生物在高滲環(huán)境會使細(xì)胞原生質(zhì)脫水，發(fā)生質(zhì)壁分離因而抑制微生物的生長，而且一些微生物在完全干燥的情況下是不能生長的。在干燥和高滲壓的條件下會更好的對易被微生物感染的物品進(jìn)行保存。

其次，環(huán)境的酸堿度，氧氣和氧化還原電位和輻射對微生物的生命活動有很大的影響。pH值會改變微生物蛋白質(zhì)的性質(zhì)，會影響菌體細(xì)胞膜的帶電荷性質(zhì)，改變環(huán)境營養(yǎng)物的可給性和有害物的毒性。而氧氣則是對微生物的生長有著直接的影響，大多數(shù)微生物利用氧氣參與細(xì)胞的代謝，在水中氧氣的可溶性是十分有限的，因此，在靜止的液體中氧氣的可利用性可能會成為影響微生物生長的限制性因子，不同的微生物對氧的需求與否是不同的，氧氣對厭氧微生物有這毒害作用，對好氧微生物來說就是必需的，因此清除環(huán)境中的氧分子可以抑制好養(yǎng)微生物的生長。可利用這種方式對食物進(jìn)行真空包裝，能夠有效的消除好癢微生物引起的食物腐敗過程，延長貨架期。微生物對輻射是比較敏感的，控制輻射方式可以有效的控制微生物的生長。例如，紫外光可以做微生物育種的誘變劑；利用一些輻射的強(qiáng)穿透性可用于食物的滅菌，也可延長食物的貨架期。

利用化學(xué)因子對微生物的影響，人們制造出了化學(xué)殺菌劑和抑制劑，據(jù)用途和模式主要有消毒劑、防腐劑和化學(xué)治療劑。其中，較為突出的醛類化學(xué)藥劑因其殺菌效力高常常用于醫(yī)用器械和用具；表面活性劑在臨床上用于皮膚和黏膜的消毒；分離和培養(yǎng)某些菌體時在培養(yǎng)基中添加染色劑可以提高分離效果。還有很多的藥劑都可殺死很多細(xì)菌。而防腐劑的利用更加充分，尤其在一些食品中。還有一類化學(xué)治療劑，廣泛的用于醫(yī)療事業(yè)，利用化學(xué)藥劑對微生物的選擇性毒性，很好得控制了由微生物引起的疾病，對人類做出了巨大貢獻(xiàn)。

但是，在利用這些藥劑的同是也要注意一些問題。例如，防腐劑在食品方面的利用對食品品質(zhì)和對人們健康的影響。最近，食品的安全衛(wèi)生問題引起了人們的廣泛關(guān)注，雖然防腐劑可以延長食品的保存期，但是要注意方式與量的使用。并且，我國對抗生素的依賴已經(jīng)達(dá)到了非常嚴(yán)重的地步，抗生素的濫用已經(jīng)使微生物對很多抗生素產(chǎn)生了抗性，迫使人們用更大劑量的抗生素解決微生物造成的醫(yī)療問題，如此反復(fù)形成了惡性循環(huán)。由此，希望這種情況的到及時的制止。

利用微生物的一些性質(zhì)，可以處理環(huán)境污染問題，解決一些醫(yī)療事故，制作加工食品，制造能源物質(zhì)等，但是在利用的同時要注意方式和量，凡事不可過度，水能載舟亦能覆舟。凡事有利必有弊，利用對微生物生長環(huán)境的控制來控制微生物必定會有一些弊端，若是控制不當(dāng)，導(dǎo)致微生物突變，而人類無法控制，那么，也許對人類對世界都會是災(zāi)難！所以，適當(dāng)利用這些資源，使其為人類所用的同時，盡量將其“副作用”降到最低！

第三篇：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌群體生長表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產(chǎn)物的測定等。總之，測定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。

一 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

（一）目的要求

1．明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。

2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

（二）基本原理

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點(diǎn)是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。

用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。

圖15—1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造

（一）圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造

（二）A.正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室

1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；2.蓋玻片；3.計(jì)數(shù)室

計(jì)數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。

設(shè)五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計(jì)數(shù)板，則

1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個）

同理，如果是16個中方格的計(jì)數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個）

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母

2．儀器或其他用具 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)滴管。

（四）操作步驟

l．菌懸液制備

以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?/p>

2．鏡檢計(jì)數(shù)室

在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3．加樣品

將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。

取樣時先要搖勻菌液；加樣時計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。

4．顯微鏡計(jì)數(shù)

加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。

調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。

在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個菌體為宜。每個計(jì)數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時，即作為兩個菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個樣品要從兩個計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。

5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

（五）實(shí)驗(yàn)報告

l．結(jié)果

將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。

各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml

12345

第一室

第二室

2．思考題

(1)根據(jù)你的體會，說明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準(zhǔn)確?

(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請?jiān)O(shè)計(jì)1～2種可行的檢測方法。

二平板菌落計(jì)數(shù)法

（一）目的要求

學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細(xì)胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。

平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。

（三）器材

1．菌種 大腸桿菌菌懸液。

2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。

3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。

（四）操作步驟

l．編號

取無菌平皿9套，分別用記號筆標(biāo)明10-

4、10-

5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標(biāo)是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀釋

用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。……其余依次類推，整個過程如圖15-3所示。

放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。

3，取樣

用三支1mL無菌吸管分別吸取10-

4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復(fù)平板間的操作誤差。

圖15—3平板菌落計(jì)數(shù)操作步驟

4．倒平板．

盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。

待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5．計(jì)數(shù)

培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復(fù)對照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗(yàn)不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對照平板不能少于三個，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。由10-

4、10-

5、10-6三個稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。

平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。

平板菌落計(jì)數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當(dāng)吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。

涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。

五、實(shí)驗(yàn)報告

1．結(jié)果

2．將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入下表

稀釋度10-410-510-6

Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考題

(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個關(guān)鍵?為什么?

(3)試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用。

(4)當(dāng)你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認(rèn)為問題出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法計(jì)數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時間(48h)后觀察結(jié)果?

三 光電比濁計(jì)數(shù)法

一、目的要求

1．了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。

2．學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法。

二、基本原理

當(dāng)光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對應(yīng)的菌數(shù)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，菌體計(jì)數(shù)可采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，平板菌落計(jì)數(shù)或細(xì)胞干重測定等方法。本實(shí)驗(yàn)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

光電比濁計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是簡便、迅速，可以連續(xù)測定，適合于自動控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進(jìn)行光電比濁計(jì)數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過最大吸收波長以及穩(wěn)定性試驗(yàn)來確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進(jìn)行測定。

圖15—4 比濁法測定細(xì)胞濃度的原理

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液

2．儀器或其他用具 721型分光光度計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。

（四）操作步驟

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。

（2）調(diào)整菌液濃度 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)培養(yǎng)24小時的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調(diào)整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數(shù)的細(xì)胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。

（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，并將OD值填入下表

管號12345678

細(xì)胞數(shù)106/ml

光密度（OD）

每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定

(4)以光密度(OD)值為縱坐標(biāo)，以每毫升細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．樣品測定

將待測樣品用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。

各種操作條件必須與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數(shù)就不準(zhǔn)確。

3．根據(jù)所測得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的含菌數(shù)。

（五）實(shí)驗(yàn)報告

l．結(jié)果

每毫升樣品原液菌數(shù)=從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的菌數(shù)×稀釋倍數(shù)

2．思考題

(1)光電比濁計(jì)數(shù)的原理是什么?這種計(jì)數(shù)法有何優(yōu)缺點(diǎn)?

(2)光電比濁計(jì)數(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中有何應(yīng)用價值?

(3)本實(shí)驗(yàn)為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實(shí)驗(yàn)中需要測定大腸桿菌生長的OD值，你將如何選擇波長?

四 大腸桿菌生長曲線的測定

(一)目的要求

1．通過細(xì)菌數(shù)量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長線。

2．復(fù)習(xí)光電比濁法測量細(xì)菌數(shù)量的方法。

(二)基本原理

大多數(shù)細(xì)菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時期的大腸桿菌細(xì)胞每20min分裂一次。將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期，對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細(xì)菌的生長曲線。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同。測定細(xì)菌的生長曲線，了解其生長繁殖規(guī)律，這對人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細(xì)菌的生長具有重要意義。

用于測定細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的方法已在上述實(shí)驗(yàn)作了介紹。本實(shí)驗(yàn)用分光光度計(jì)(spectrophotometer)進(jìn)行光電比濁測定不同培養(yǎng)時間細(xì)菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線。也可以直接用試管或帶有測定管的三角瓶(圖15-5)測定“klett units”值的光度計(jì)。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個帶測定管的三角瓶，在不同的培養(yǎng)時間(橫坐標(biāo))取樣測定，以測得的klett units為縱坐標(biāo)，便可很方便地繪制出細(xì)菌的生長曲線。如果需要，可根據(jù)公式1 klett units=OD/0.002換算出所測菌懸液的OD值。

圖15—5 帶側(cè)臂試管的三角燒瓶

(三)器材

1．菌種 大腸桿菌

2．培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。

3．儀器或其他用具 722型分光光度計(jì)，水浴振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。

圖15—6 直接用試管測OD值

(四)操作步驟

1．標(biāo)記

取11支無菌大試管，用記號筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接種

分別用5ml無菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液(培養(yǎng)10~12h)轉(zhuǎn)入盛有50ml LB液的三角瓶內(nèi)，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標(biāo)記的11支無菌大試管中。

3．培養(yǎng)

將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率250r/min)，分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標(biāo)有相應(yīng)時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密度值。

4．比濁測定

用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對照，選用600nm波長進(jìn)行光電比濁測定。從早取出的培養(yǎng)液開始依次測定，對細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，使其光密度值在0.1~0.65之內(nèi)(測定OD值前，將待測定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布)。

本操作步驟也可用簡便的方法代替：

1．用1ml無菌吸管取0.25ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入盛有3~5ml LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計(jì)的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環(huán)境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調(diào)零點(diǎn)，測定樣品中培養(yǎng)0h的OD值。測定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。

2．分別在培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養(yǎng)物試管按上述方法測定OD值。該方法準(zhǔn)確度高、操作簡便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測定的準(zhǔn)確度愈高。

(五)實(shí)驗(yàn)報告

1．結(jié)果

(1)將測定的OD600值填入下表：

培養(yǎng)時間對照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)繪制大腸桿菌的生長曲線。

2．思考題

(1)如果用活菌計(jì)數(shù)法制作生長曲線，你認(rèn)為會有什么不同？兩者各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？

(2)細(xì)菌生長繁殖所經(jīng)歷的四個時期中，哪個時期其代時最短？若細(xì)胞密度為103/ml，培養(yǎng)4.5h后，其密度高達(dá)2×108/ml，計(jì)計(jì)算出其代時。

(3)次生代謝產(chǎn)物的大量積累在哪個時期？根據(jù)細(xì)菌生長繁殖的規(guī)律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多？

評論這張

第四篇：環(huán)境微生物學(xué)

一．緒論

1）微生物：微生物是肉眼看不見的，必須在電子顯微鏡或光學(xué)顯微鏡下才能看見的所有微小生物的總稱。

2）微生物的特點(diǎn)：1個體極小2分布廣種類繁多3繁殖快4易變異 3）原核微生物與真核微生物區(qū)別：真核微生物有發(fā)育完好的細(xì)胞核，原核微生物只有擬核。第一章

4）病毒：病毒是沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，專性寄生在活的敏感宿主體內(nèi)的超微小生物。

5）病毒的特點(diǎn)：只能在電子顯微鏡下看見。沒有核糖體，沒有酶系統(tǒng)，不具備代謝能力，必須專性寄生在活的敏感宿主細(xì)胞內(nèi)。

6）病毒的分類：按專性宿主分類：動物病毒，植物病毒，細(xì)菌病毒，放線菌病毒，藻類病毒，真菌病毒。按核算分類：DNA病毒，RNA病毒。7）類病毒：類病毒是比病毒更加小的致病感染因子。

8）朊病毒：朊病毒是一種引起牛，羊疾病的感染因子（蛋白質(zhì)感染顆粒）。9）病毒的繁殖過程：1吸附2侵入3復(fù)制與聚集4宿主細(xì)胞裂解和成熟噬菌體粒子的釋放。10）噬菌體的溶原性：毒性噬菌體，侵入宿主細(xì)胞后，隨即引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體。溫和噬菌體，侵入宿主細(xì)胞后，其核算附著并整合在宿主染色體上，和宿主的核酸同步復(fù)制，宿主細(xì)胞不裂解而繼續(xù)生長，不引起宿主細(xì)胞裂解。含有溫和噬菌體宿主細(xì)胞被稱作溶原細(xì)胞。溶原細(xì)胞內(nèi)的溫和噬菌體核酸，稱為原噬菌體。

11）噬菌體：噬菌體是感染細(xì)菌，真菌，放線菌或螺旋體微生物的病毒。第二章

12）細(xì)菌的形態(tài)：球狀，桿狀，螺旋狀和絲狀。分別稱為球菌，桿菌，螺旋菌和絲狀菌。13）細(xì)菌：一大類細(xì)胞核無核膜包裹，只存在稱作擬核區(qū)的裸露DNA的原始單細(xì)胞生物。14）細(xì)菌的結(jié)構(gòu)：細(xì)菌為單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所有的細(xì)菌均有如下結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)膜，細(xì)胞質(zhì)及其內(nèi)含物，擬核。部分細(xì)菌有特殊結(jié)構(gòu)：芽孢，鞭毛，莢膜，黏液層，衣鞘及光合作用片等。

15）細(xì)胞壁：細(xì)胞壁是包圍在細(xì)菌體表最外層的，堅(jiān)韌而有彈性的薄膜。16）原生質(zhì)體：原生質(zhì)體包括細(xì)胞質(zhì)膜，細(xì)胞質(zhì)及其內(nèi)含物，擬核。

17）細(xì)胞質(zhì)膜：細(xì)胞質(zhì)膜是緊貼在細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)而包圍細(xì)胞質(zhì)的一層柔軟而富有彈性的膜。（半滲透膜），含有蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和多糖。脂質(zhì)是由磷脂，甘油，脂肪酸和含氮堿組成。18）細(xì)胞質(zhì)膜的生理功能：1,維持滲透壓的梯度和溶質(zhì)的轉(zhuǎn)移2，膜上含有合成細(xì)胞壁和形成橫膈膜組分的膜，故在膜的外表面合成細(xì)胞壁3，膜內(nèi)的中間體含有細(xì)胞色素，參與呼吸作用。4，細(xì)胞質(zhì)膜上含有酶，進(jìn)行物質(zhì)代謝和能量代謝5，細(xì)胞質(zhì)膜上有鞭毛基粒，鞭毛由此長出，為鞭毛提供附著點(diǎn)。19）核糖體;合成蛋白質(zhì)

20）擬核：細(xì)胞的核因沒有核膜和核仁，故稱為原始核或擬核。21）鞭毛：有細(xì)胞質(zhì)膜上的鞭毛基粒長出穿過細(xì)胞壁伸向體外的一條纖細(xì)的波浪狀的絲狀物叫鞭毛。

22）細(xì)菌的染色方法簡單染色法和復(fù)合染色法 23）革蘭氏染色法：步驟1在無菌的條件下，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于干凈的載玻片上涂布均勻，固定。2用草酸銨結(jié)晶紫染色1MIN，水洗去掉浮色。3用碘-碘化鉀溶液媒染1MIN，傾去多余染液。4用中性脫色劑如乙醇或丙醇脫色，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。5，用番紅溶液復(fù)染1MIN，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。24）革蘭氏染色的機(jī)制：1）革蘭氏染色與細(xì)菌等電點(diǎn)有關(guān)系：革蘭氏陽性菌的等電點(diǎn)比革蘭氏陰性菌的等電點(diǎn)低，說明革蘭氏陽性菌帶的負(fù)電荷比革蘭氏陰性菌多。革蘭氏陽性菌的等電點(diǎn)低，與草酸銨結(jié)晶紫結(jié)合的牢固，對乙醇脫色抵抗力強(qiáng)，所以革蘭氏陽性菌呈紫色。2，革蘭氏染色與細(xì)胞壁有關(guān)：革蘭氏陽性菌的脂質(zhì)的含量很低，肽聚糖含量高，革蘭氏陰性菌則相反，因此用乙醇脫色時革蘭氏陰性菌的脂質(zhì)被乙醇溶解，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的孔徑和通透性，乙醇很易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)將結(jié)晶紫和碘-碘化鉀復(fù)合物提取出來，噬菌體呈現(xiàn)無色。3,*革蘭氏陽性菌含特殊的RNA-Mg2+鹽與革蘭氏染色有關(guān)。25）放線菌：放線菌因在固體培養(yǎng)基上呈輻射狀生長而得名。分為三類營養(yǎng)菌絲，氣生菌絲，孢子絲。

26）放線菌的結(jié)構(gòu)：放線菌的菌體由纖細(xì)的，長短不一的菌絲組成，菌絲分枝，為單細(xì)胞，在菌絲生長過程中，核物質(zhì)不斷復(fù)制分裂，然后細(xì)胞不形成橫膈膜，也不分裂，而是無數(shù)分枝的菌絲組成很細(xì)密的菌絲體。第三章

27）原生動物：原生動物是動物中最原始，最低等，結(jié)構(gòu)最簡單的單細(xì)胞動物。28）原生動物的營養(yǎng)類型：1全動性營養(yǎng)2植物性營養(yǎng)3腐生性營養(yǎng)

29）原生動物的繁殖：有性生殖和無性生殖（二分裂發(fā)，多分裂法，縱分裂或橫分裂）30）原生動物的作用：所有原生動物在污水生物處理過程中都起著指示生物的作用。31）主要的原生動物：P71 32）微型后生動物：原生動物以外的多細(xì)胞動物叫后生動物。因有些后生動物體型微小，要借助光學(xué)顯微鏡方可看得清楚，故叫微型后生動物。33）藻類的繁殖;有性生殖和無性生殖。P84 34）真菌：真菌屬低等生物，種類繁多，形態(tài)，大小各異，包括酵母菌，霉菌及各種傘菌。真菌屬真核微生物，有單細(xì)胞和多細(xì)胞之分。

35）酵母菌：酵母菌是單細(xì)胞真菌。分發(fā)酵型和氧化型兩種。氧化型的酵母菌則是無發(fā)酵能力或發(fā)酵能力弱而氧化能力強(qiáng)的酵母菌。球擬酵母菌，白色假絲酵母菌，類酵母的阿氏囊霉屬，短梗霉屬在石油加工業(yè)中起積極作用，如石油脫蠟，降低石油的凝固點(diǎn)等。處理廢水及用酵母菌檢測重金屬。

36）酵母菌的繁殖：有性生殖和無性生殖（芽生殖和裂殖)37）霉菌：分為腐生和寄生

38）霉菌的繁殖：有性孢子和無性孢子繁殖，也可借助菌絲的片段繁殖。39）傘菌：無毒的有機(jī)廢水可用于培養(yǎng)食用菌的菌絲體。40）酶：酶是由細(xì)胞產(chǎn)生的，能在體內(nèi)或體外起催化作用的一類具有活性中心和特殊構(gòu)想的生物大分子。

41）酶的分類：化學(xué)組分；單成分酶（只含有蛋白質(zhì)）和全酶（蛋白質(zhì)及輔基或輔酶的熱穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)小分子有機(jī)物或金屬離子，全酶要在酶蛋白和輔酶同時存在起作用）

42）全酶的分類：1酶蛋白+非蛋白質(zhì)小分子有機(jī)物2酶蛋白+非蛋白質(zhì)小分子有機(jī)物+金屬離子3酶蛋白+金屬離子

43）酶的分類：六類，氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶類，裂解酶類，異構(gòu)酶類和合成（連接）酶類。

44）酶的反應(yīng)通式：氧化還原酶類：AH2+B=A+BH2

轉(zhuǎn)移酶類：AR+B=A+BR

水解酶類：AB+H2O=AOH+BH

裂解酶類：AB=A+B

異構(gòu)酶：---------葡萄糖=果糖（例）

合成酶：A+B+ATP=AB+ADP+Pi

或

A+B+ATP=AB+AMP+Pii 45）酶的特性：1酶具有一般催化劑的共性2酶的催化作用具有高度的專一性（只作用一種或以類物質(zhì)）3酶的催化反應(yīng)條件溫和4酶對環(huán)境條件的變化極為敏感5酶的催化效率極高

46）酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程式：

E酶S底物ES中間產(chǎn)物P最終產(chǎn)物

47）酶的濃度對酶促反應(yīng)速率的影響：下圖

48)底物濃度對酶促反應(yīng)速率的影響：P116 49)溫度對酶促反應(yīng)速率的影響：上圖 50)PH對酶促反應(yīng)速率的影響：P117 51)激活劑對酶促反應(yīng)速率的影響：凡能激活酶的物質(zhì)稱酶的激活劑。分為無機(jī)離子激活劑和有機(jī)化合物兩類。

52)抑制劑對酶促反應(yīng)速率的影響：引起抑制作用的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。抑制作用是指由于某些物質(zhì)與酶的活性部位結(jié)合。分為不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。

53)培養(yǎng)基;根據(jù)各種微生物對營養(yǎng)的需要，包括水，碳源，能源，氮源，無機(jī)鹽及生長因子等按一定的比例配置而成的，用以培養(yǎng)微生物的基質(zhì)，稱為培養(yǎng)基。

54)培養(yǎng)基配制的原則：1不同微生物，不同培養(yǎng)基2各種營養(yǎng)物的濃度及配比3調(diào)PH值4考慮加生長因子5培養(yǎng)基物美價廉

55)培養(yǎng)基的種類：按培養(yǎng)基組成物的性質(zhì)分類：合成培養(yǎng)基，天然培養(yǎng)基（天然有機(jī)物配制而成的培養(yǎng)基），復(fù)合培養(yǎng)基。按物理性質(zhì)分為;液體培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基對微生物的功能和用途不同：選擇培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基，加富培養(yǎng)基。56)營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入微生物細(xì)胞的方式：單純擴(kuò)散，促進(jìn)擴(kuò)散，主動運(yùn)輸，基團(tuán)轉(zhuǎn)位

57)單純擴(kuò)散：單純擴(kuò)散是物理過程，不包括細(xì)胞的主動代謝。雜亂運(yùn)動的，水溶性的溶質(zhì)分子（水，無機(jī)鹽，O2，CO2）通過細(xì)胞質(zhì)膜中含水的小孔從高濃度區(qū)向低濃度區(qū)擴(kuò)散，不與膜上的分子發(fā)生反應(yīng)，這種擴(kuò)散是非特異的，擴(kuò)散速度慢。

58)促進(jìn)擴(kuò)散：細(xì)胞膜上的載體蛋白分子有和被運(yùn)輸物質(zhì)特異結(jié)合的位置，這樣載體在膜的外表面能夠和物質(zhì)結(jié)合，形成的底物-載體蛋白復(fù)合體，便從高濃度向低濃度區(qū)域擴(kuò)散或越膜。由于被運(yùn)輸物質(zhì)的濃度在膜的內(nèi)表面較低，所以復(fù)合體傾向解離，被運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)就留在細(xì)胞內(nèi)，而載體回到膜的外表面，只要存在需要運(yùn)輸物質(zhì)的越膜濃度梯度，這個過程就將繼續(xù)進(jìn)行，從而加快了物質(zhì)的運(yùn)輸速度。不消耗能量。

59)主動運(yùn)輸：當(dāng)微生物細(xì)胞內(nèi)積累的營養(yǎng)物質(zhì)濃度高于細(xì)胞外的濃度時，營養(yǎng)物質(zhì)就不能按濃度梯度擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，而是逆濃度梯度被“抽”進(jìn)細(xì)胞內(nèi)。這一過程需要滲透酶和消耗能量。滲透酶在此過程中起改變平衡點(diǎn)的作用，這種需要能量和滲透酶的逆濃度梯度積累營養(yǎng)物質(zhì)的過程。60)基團(tuán)轉(zhuǎn)位：基團(tuán)轉(zhuǎn)位是存在于某些原核生物中的一種物質(zhì)運(yùn)輸方式。與主動運(yùn)輸相比，有一個復(fù)雜的運(yùn)輸系統(tǒng)，被運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)發(fā)生了化學(xué)變化，主要用于糖的運(yùn)輸，運(yùn)輸總效果與主動運(yùn)輸相似，可以逆濃度梯度將營養(yǎng)物質(zhì)移向細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的物質(zhì)濃度大大超過未改變結(jié)構(gòu)的同類物質(zhì)的濃度。需要代謝能量。61)微生物的能量代謝：P135-P150

62）微生物的生長：微生物在適宜的環(huán)境條件下，不斷吸收營養(yǎng)物質(zhì)，按照自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝活動。正常情況下，同化作用大于異化作用，微生物的細(xì)胞質(zhì)量不斷迅速增長，稱為生長。

63）微生物的發(fā)育：從生長到繁殖這個由量變到質(zhì)變的過程叫發(fā)育 64）代時：細(xì)菌兩次細(xì)胞分裂之時的時間。65）生長曲線：

66)微生物的生存因子：微生物除了需要營養(yǎng)外，還需要環(huán)境中合適的生存因子，例如：溫度，PH，氧化還原電位，溶解氧，太陽輻射，活度與滲透壓，表面張力等。

67)根據(jù)微生物對溫度的最適生長需求，可將微生物分為4大類：嗜冷菌，嗜中溫菌，嗜熱菌及嗜超熱菌。

68)大多數(shù)細(xì)菌，藻類和原生動物的最適PH為6.5-7.5，他們對PH的適應(yīng)范圍為4-10。69)任何兩種濃度的溶液被半滲透膜隔開，均會產(chǎn)生滲透壓。

70)微生物之間的關(guān)系：微生物之間的關(guān)系有種內(nèi)的關(guān)系和種間的關(guān)系。相同種內(nèi)的關(guān)系有競爭和互助。不同種間關(guān)系有6種，競爭關(guān)系，原始合作關(guān)系，共生關(guān)系，偏害關(guān)系，捕食關(guān)系，寄生關(guān)系。

71)競爭關(guān)系：競爭關(guān)系是指不同的微生物種群在同一環(huán)境中，對食物等營養(yǎng)，溶解氧，空間和其他共同要求的物質(zhì)互相競爭，互相收到不利影響。

72)原始合作關(guān)系：原始合作關(guān)系是指兩種可以單獨(dú)生活的生物共存于同一環(huán)境中，相互提供營養(yǎng)及其他生活條件，雙方互為有利，相互受益。當(dāng)兩者分開時各自可單獨(dú)生存。

73)共生關(guān)系：共生關(guān)系是指兩種不能單獨(dú)生活的微生物共同生活于同一環(huán)境中，各自執(zhí)行優(yōu)勢的生理功能，在營養(yǎng)上互為有利而所組成的共生體，這兩者之間的關(guān)系就叫共生關(guān)系。74)偏害關(guān)系：共存于同一環(huán)境的兩種微生物，甲方對乙方有害，乙方對甲方無任何影響。一種微生物在代謝過程中產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，其中有的產(chǎn)物對一種（或一類）微生物生長不利，或者抑制或者殺死對方。上述這種微生物與微生物之間的對抗關(guān)系叫偏害關(guān)系。分非特異性偏害和特異性偏害。

75)捕食關(guān)系：有的微生物不是通過代謝產(chǎn)物對抗對方，而是吞食對方，這種關(guān)系稱為捕食關(guān)系。

76)寄生關(guān)系：一種生物需要在另一種生物體內(nèi)生活，從中社區(qū)營養(yǎng)才得以生長繁殖，這種關(guān)系成為寄生關(guān)系。77)微生物在土壤中的分布：土壤中微生物的類群、數(shù)量與分布，由于土壤質(zhì)地發(fā)育母質(zhì)、發(fā)育歷史、肥力、季節(jié)、作物種植狀況、土壤深度和層次等等不同而有很大差異。土壤微生物中細(xì)菌最多，作用強(qiáng)度和影響最大，放線菌和真菌類次之，藻類和原生動物等數(shù) 量較少，影響也小。土壤中微生物的水平分布取決于碳源。土壤中微生物的垂直分布與紫外輻射的照射，營養(yǎng)，水，溫度等因素有關(guān)。78)遺傳和變異是一切生物最本質(zhì)的屬性。

79)遺傳有保守性，是微生物在它的系統(tǒng)發(fā)育過程中形成的系統(tǒng)。80)遺傳可改變的一面是變異

81)遺傳是相對的，變異是絕對的。82)遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)DNA：P203 83)基因突變：基因突變即微生物的DNA被某種因素引起堿基的缺失，置換或插入，改變了基因內(nèi)部原有的堿基排列順序，從而引起其后代表現(xiàn)型的改變。當(dāng)后代突然變現(xiàn)和親代顯然不同的，能遺傳的性狀時，就稱為突變。

84)自發(fā)突變：自發(fā)突變是指某種微生物的自然條件下，沒有人工參與而發(fā)生的基因突變。原因有多因素低劑量的誘變效應(yīng)，互變異構(gòu)效應(yīng)。

85)誘發(fā)突變：誘發(fā)突變是利用物理或化學(xué)的因素處理微生物群體，促使少數(shù)個體細(xì)胞的DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在基因內(nèi)部堿基配對發(fā)生錯差，引起微生物的遺傳性狀發(fā)生突變。分物理誘變，化學(xué)誘變，復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)，定向培育和馴化。

86)基因重組：兩個不同形狀個體細(xì)胞的DNA融合，使基因重新組合，從而發(fā)生遺傳變異，產(chǎn)生新品種，此過程稱為基因重組。

87)雜交;雜交是通過雙親細(xì)胞的融合，使整套染色體的基因重組；或者是通過雙親細(xì)胞的溝通，使部分染色體基因重組。

88)轉(zhuǎn)化：受體細(xì)胞直接吸收來自供體細(xì)胞的DNA片段，并把它整合到自己的基因組里，從而獲得了供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象，成為轉(zhuǎn)化。

89)轉(zhuǎn)導(dǎo);通過溫和噬菌體的媒介作用，把供體細(xì)胞內(nèi)特定的基因攜帶至受體細(xì)胞中，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。

90)質(zhì)粒：質(zhì)粒在原核微生物中除有染色體外，還含有另一種較小的，攜帶少量遺傳基因的環(huán)狀DNA分子，稱為質(zhì)粒，也叫染色體外DNA。質(zhì)粒在基因工程中常被用作基因轉(zhuǎn)移的運(yùn)載工具-載體。

91)基因工程：基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，又叫基因剪接或核酸體外重組。基因工程是用人工方法把所需要的某一供體生物的DNA提取出來，在離體的條件下用限制性內(nèi)切酶將離體DNA切割成帶有目的的基因的DNA片段，每一段平均長度有幾千個核苷酸，用DNA連接酶把它和質(zhì)粒的DNA分子在體外連接成重組DNA分子，然后將重組體導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，以便外來的遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行復(fù)制，擴(kuò)增和表達(dá)，再進(jìn)行重組體克隆的篩選和鑒定；最后對外源基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離提純，從而獲得新品種。92)基因工程操作分5步：1先從供體細(xì)胞中選擇獲取帶有目的基因的DNA片段（基因分離）； 2將目的DNA的片段和質(zhì)粒在體外重組；（體外重組）3將重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（載體傳遞）；4重組體克隆的篩選與鑒定（復(fù)制表達(dá)）；5外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與提純（篩選，繁殖）

93）天然淡水水體是人類生活和工業(yè)生產(chǎn)用水的水源，也是水生動物和植物生長繁殖的場所。

94）水體自凈過程;1有機(jī)污染物排入水體后被水體稀釋，有機(jī)和無機(jī)固體物沉降至河底。2水體中好氧細(xì)菌利用溶解氧把有機(jī)物分解為簡單有機(jī)物和無機(jī)物，并用以組成自身有機(jī)體，水中溶解氧急速下降至零，此時魚類絕跡，原生動物，輪蟲，浮游甲殼動物死亡，厭氧細(xì)菌大量繁殖，對有機(jī)物進(jìn)行厭氧分解。3水體中溶解氧在異樣菌分解有機(jī)物時被消耗，大氣中的氧剛?cè)苡谒捅谎杆儆玫簦M管水中藻類在白天進(jìn)行光合作用放出氧氣，但復(fù)氧速率小于耗氧速率，氧垂曲線下降。在最缺氧點(diǎn)，有機(jī)物的耗氧速率等于河流的復(fù)氧速率。再往下游的有機(jī)物減少，復(fù)氧速率大于耗氧速率，氧垂1曲線上升。如果河流不再被有機(jī)物污染，河水中溶解氧恢復(fù)到原來的水平，甚至達(dá)到飽和。4隨著水體的自凈，有機(jī)物缺乏和其他原因（例如陽光照射，溫度，PH變化，毒物及生物的抗?jié)嵶饔玫龋┦辜?xì)菌死亡。據(jù)測定，細(xì)菌死亡數(shù)大約為80%-90%.95）碳循環(huán)：

96）脂質(zhì)的轉(zhuǎn)化：P274 97）氮循環(huán)：P278 98）顯微鏡的分辨率：指顯微鏡能分辨出物體兩點(diǎn)間的最小距離

分辨力=0.61xλ/N.A.計(jì)算題

采用目鏡為16X，物鏡為40/0.65的光學(xué)系統(tǒng)，直徑為0.3μm的微生物在顯微鏡下是否可分辨 解：

分辨率=0.61xλ/N.A.由題目知：N.A.=0.65

λ=0.55

分辨率=0.61x（0.55/0.65）=0.516μm>0.3μm

不可分辨

第五篇：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報告

微 生 物 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 報 告（格式標(biāo)準(zhǔn)）

(生命科學(xué)專業(yè))

教 師：黎 勇

目錄索引

實(shí)驗(yàn)一 油鏡的使用和細(xì)菌的簡單染色法 3

實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革氏染色與芽孢染色 5

實(shí)驗(yàn)三 常用培養(yǎng)基的配制 7

實(shí)驗(yàn)四 酵母菌霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及酵母死活細(xì)胞的鑒別 8

實(shí)驗(yàn)

五、微生物大小的測定與顯微計(jì)數(shù) 10

實(shí)驗(yàn)六 環(huán)境中微生物的檢測和分離純化 11

實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng) 12

實(shí)驗(yàn)八（綜合實(shí)驗(yàn)）化能異養(yǎng)微生物的分離與純化 13

課程名稱： 微生物學(xué)

實(shí)驗(yàn)班級：化生系生命科學(xué)本科

實(shí)驗(yàn)日期：

指導(dǎo)教師：黎勇 實(shí)驗(yàn)一 油鏡的使用和細(xì)菌的簡單染色法

〔目的要求〕學(xué)習(xí)并熟練掌握油鏡的使用技術(shù)；觀察細(xì)菌的基本形態(tài)；學(xué)習(xí)觀察細(xì)菌的運(yùn)動性的基本方法。

〔基本原理〕

1.N2A=n2sinα

2.D=λ/2N.A

3.目鏡可提高放大倍數(shù)，但有效放大率取決于鏡口率。已經(jīng)分辨的物體不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。

4.用懸滴法或凹玻片法觀察細(xì)菌的運(yùn)動性時，可以通過真運(yùn)動能定向地由一處快速運(yùn)動來區(qū)別于顆粒的布朗運(yùn)動。

〔器材用具〕顯微鏡、載玻片、凹玻片、蓋玻片、接種環(huán)、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水紙、擦鏡紙；細(xì)菌、放線菌等固定裝片；培養(yǎng)18小時左右的B.subtilis.S.arueus菌斜面培養(yǎng)物；無菌水、生理鹽水。

〔方法步驟〕：

（一）油鏡的使用

鏡檢裝片在中倍（或高倍鏡）下找到目的物，并使位于視野正中

聚光鏡上升到最高位置，虹彩光圈開到最大，鏡頭轉(zhuǎn)開成八字形

在玻片的鏡檢部位（光斑處）滴一滴香柏油

油鏡轉(zhuǎn)入正下方

側(cè)視小心上升載物臺（縮短鏡頭與裝片距離，鏡頭浸入油中，至油圈不擴(kuò)大為止鏡頭幾與裝片接觸）粗調(diào)器徐徐下降載物臺（密切注視視野，當(dāng)捕捉到物像時，立即用細(xì)調(diào)器校正）仔細(xì)觀察并繪圖

取出裝片，清洗油鏡：擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油

擦鏡紙沾少許二甲苯擦去殘留（用手指輔助，迅速拭擦一、二次）

用清潔擦鏡紙仔細(xì)擦干二甲苯（2-3次）。

（二）細(xì)菌的簡單染色法：涂片

干燥

火焰固定

染色

水洗

干燥

油鏡觀察

（三）細(xì)菌運(yùn)動性的觀察 取潔凈蓋玻片，四周涂上凡士林

滴加一小滴菌懸液

凹玻片的凹窩向下蓋于蓋玻片上

翻轉(zhuǎn)觀察

〔結(jié)果分析〕

1、畫一圓圈表示視野，選取所觀察的微生物繪圖，注意特殊結(jié)構(gòu)、形狀和排列。（描繪時按視野實(shí)際大小5－10倍繪制）

菌名：大腸桿菌

菌名：金黃色葡萄球菌

放大倍數(shù)：100310（35）

放大倍數(shù)：100310（35）

特殊結(jié)構(gòu)：無 特殊結(jié)構(gòu)：無

視野觀察下微生物的形態(tài)

2、油鏡使用時為什么必須干燥裝片？

防止水油分層，光受到折射而影響油鏡性能的發(fā)揮

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

首次實(shí)驗(yàn)中有幾個要點(diǎn)：一是按無菌操作取用菌；二是涂片技術(shù)的掌握；三是油鏡使用技術(shù)。凡實(shí)驗(yàn)中學(xué)生的所思所想，如無菌操作技術(shù)要點(diǎn)、自行處理實(shí)驗(yàn)材料、失敗與思考等均可進(jìn)行討論（如涂片時蒸餾水不宜過多、取用菌時防止菌被灼燙變形、取菌宜少不宜多等均是可以討論的內(nèi)容）。

實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革氏染色與芽孢染色

〔目的要求〕觀察細(xì)菌菌落的特征；掌握簡單染色法、革蘭氏染色法的原理及操作步驟；在油鏡下觀察細(xì)菌個體形態(tài)；學(xué)習(xí)環(huán)境中微生物的檢查方法，并加深對微生物分布廣泛性的認(rèn)識

〔器材用具〕E.coliB.subtilisS.aureus.的斜面培養(yǎng)物（18－24小時）以及菌落平板各一個；染液：草酸銨結(jié)晶紫、劃蘭氏染液、盧戈氏碘、95%的乙醇、蕃紅；無菌水、顯微鏡、載片、濾紙、液體石蠟是、、擦鏡紙、接種環(huán)。

〔方法內(nèi)容〕：

（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中微生物的檢查

（二）革蘭氏染色法 涂片固定

冷卻

結(jié)晶紫染色1min 水洗

碘媒染1min 95%乙醇30-60s 水洗

番紅復(fù)染2－3min

水洗

干燥

油鏡鏡檢

（三）芽孢染色 涂片固定

孔雀綠加熱染色（勿干）5min 水洗

番紅復(fù)染1min

水洗

鏡檢

〔結(jié)果分析〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果被染成紫色者即為革蘭氏陽性，被染成紅色者為革蘭氏陰性；菌體染成紅色，芽孢被染成綠色。

菌名：大腸桿菌

菌名：金黃色葡萄球菌

放大倍數(shù)：100310（35）

放大倍數(shù)：100310（35）

染色反應(yīng)：紅色（陰性）染色反應(yīng)：紫色（陽性）

菌名：枯草芽孢桿菌

放大倍數(shù)：100310（35）

染色反應(yīng)：紫色（陽性）

圖1 視野觀察下細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)

圖2 枯草芽孢桿菌芽孢形態(tài)圖

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

嚴(yán)格掌握脫色程度，是成敗的關(guān)鍵。若脫色時間過度，則陽性菌初時之紫色脫出，復(fù)染成紅色，誤成陰性，反之脫色時間不足，陰性菌在初染時的紫色未能脫出，復(fù)染時不能染成紅色，誤以為陽性菌；涂片不能厚；盧弋氏碘即用即配。

作業(yè)

1、繪出所觀察到到細(xì)菌的視野圖，并說明染色反應(yīng)。

2、哪些因素會影響到革蘭氏染色結(jié)果的正確？其中是關(guān)鍵的一步是什么？ 菌齡及培養(yǎng)條件和染色技術(shù)是最主要的，關(guān)鍵是脫色。

3、怎樣對未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，以證明你的結(jié)果的正確？

與已知菌混合涂片比較。

實(shí)驗(yàn)三 常用培養(yǎng)基的配制

〔目的要求〕了解培養(yǎng)基的配制原理；了解培養(yǎng)基常規(guī)配制程序；了解培養(yǎng)基過程各環(huán)節(jié)的要求和注意事項(xiàng)。了解半合成培養(yǎng)基的配制原理，學(xué)習(xí)掌握肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基的配制方法。

〔器材用具〕等配各種培養(yǎng)基的組成成分，瓊脂、1N NaoH溶液 1N HCl天平或臺秤高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙報紙等。

〔方法步驟〕

(一)玻璃器皿的洗滌和包裝 以小組為單位清洗、控水，按9個為一組，分別用報紙包好并放入烘箱中等待滅菌。

(二)液體及固體培養(yǎng)基的配制過程

原料稱量（按配方次序）

溶解

調(diào)節(jié)ｐH 過濾澄清

分裝

塞棉塞和包札

滅菌

分別按教材配方配制牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯液體及固體培養(yǎng)基。

(三)培養(yǎng)基的分裝 用玻璃漏斗，橡皮管，小玻璃管及彈簧夾制作分裝裝置

選用153150平口試管或150mL錐形瓶貼上標(biāo)簽

分裝（至試管高度1/4-1/3，斜面制作用1/5，半固體用1/3）

要求：每人制作斜面3支。其余分裝至錐形瓶中。

(四)棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎 分別制作試管及錐形瓶棉塞并塞好好以牛皮紙包裝頭部。

(五)培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基用濕熱法滅菌；皿用干熱法分別滅菌。

(六)斜面和平板的制作（下次試驗(yàn)完成）

(七)培養(yǎng)基的無菌檢查（下次實(shí)驗(yàn)完成）

(八)無菌水的制備 同時制作無菌生理鹽水，置錐形瓶中備用。

〔結(jié)果分析〕

以斜面接種培養(yǎng)驗(yàn)證培養(yǎng)基配制效果；

以平板制作及接種24小時培養(yǎng)驗(yàn)證滅菌效果；

簡述移液管包裝的注意事項(xiàng)。

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

滅菌器的滅菌效果必須間隔一段時間，加以驗(yàn)證，主要方法除無菌檢查外，還通過壓力試紙同時滅菌來驗(yàn)證其壓力與溫度；培養(yǎng)基通常成批制作備用。但制作后，其貯藏時間有一定限制，一般室溫條件下不超過三周；冰箱4℃條件下可貯藏半年，過期不能用。

作業(yè)：

1、記錄培養(yǎng)基的成分和名稱

2、分析所配制培養(yǎng)基的碳源、氮源、能源及無機(jī)鹽、維生素的來源。所配制均為天然培養(yǎng)基，各成分主要來自有機(jī)質(zhì)，微量元素可以由自來水提供。

3、什么是天然培養(yǎng)基？什么是半合成、合成培養(yǎng)基？

實(shí)驗(yàn)四 酵母菌霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及酵母死活細(xì)胞的鑒別

〔目的要求〕觀察并掌握酵母菌霉菌的菌落特征、個體形態(tài)、生長及繁殖方式。學(xué)習(xí)酵母死活細(xì)胞的鑒別方法。

〔材料用具〕釀酒酵母、紅酵母、假絲酵母；(釀酒酵母和紅酵母菌落平板各一個。釀酒酵母豆芽汁斜面及釀酒酵母醋酸鈉斜面各一支，假絲酵母加蓋片培養(yǎng)的平板)；7.6%孔雀綠染液，0.5%蕃紅染液，蘇丹黑染液，二甲苯，中性紅染液，碘液；目鏡測微尺、鏡臺測微尺；載片及蓋片。

〔方法步驟〕

(一)菌落特征的觀察

(二)個體形態(tài)與出芽

(三)子囊孢子的觀察

(四)酵母死活細(xì)胞的觀察。

〔結(jié)果分析〕描述釀酒酵母霉菌的菌落形態(tài)特征；繪圖釀酒酵母的菌體、出芽方式及細(xì)胞細(xì)節(jié)；

（一）酵母的菌落濕潤，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一致，不透明，邊緣整齊；

菌名：釀酒酵母

放大倍數(shù)：100310（35）

特殊結(jié)構(gòu)：芽（出芽繁殖）

（二）霉菌

菌落特征：干燥，正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。

（如右圖）

菌名：青霉（Penicillium）

菌名：毛霉（Circinella）

放大倍數(shù)：100310（35）

放大倍數(shù)：100310（35）

特殊結(jié)構(gòu)：分生孢子梗（帚狀分枝）

特殊結(jié)構(gòu)：孢子囊

菌名：曲霉（Aspergillus）

菌名：根霉（Rhizopus）

放大倍數(shù)：模式圖

放大倍數(shù)：100310（35）

特殊結(jié)構(gòu)：足細(xì)胞 特殊結(jié)構(gòu)：假根

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

作業(yè)：

1、繪圖說明所觀察到的酵母菌、霉菌的形態(tài)特征。

實(shí)驗(yàn)

五、微生物大小的測定與顯微計(jì)數(shù)

〔目的要求〕學(xué)習(xí)并掌握用測微尺測定微生物細(xì)胞大小的方法；了解血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造及計(jì)數(shù)原理，掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

〔材料用具〕啤酒酵母；顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺；血球計(jì)數(shù)板；蓋玻片，載玻片，滴管，試管，無菌水，〔方法步驟〕

(一)酵母細(xì)胞大小測定

(1)目鏡測微尺的校正(2)細(xì)胞大小的測定

(二)顯微計(jì)數(shù)法

(1)鏡檢計(jì)數(shù)室

(2)菌懸液制備及加樣

(3)計(jì)數(shù)

(4)清洗計(jì)數(shù)板

〔結(jié)果分析〕結(jié)果記錄入表中。

1、目鏡測微尺的標(biāo)定結(jié)果（精確到零點(diǎn)幾小格）物鏡倍數(shù)

（目鏡均為10倍）目鏡測微尺的格數(shù)（小格）

鏡臺測微尺的格數(shù)（小格）

目鏡測微尺的每格的長度（μm）40倍

2、酵母菌大小測定結(jié)果 菌號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 目鏡測微尺的格數(shù)（小格）長軸

短軸

酵母大小平均值＝±（保留小數(shù)點(diǎn)后2位）

長軸＝

3、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對酵母菌懸液計(jì)數(shù)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)次數(shù) 各中格中菌數(shù) 總菌數(shù) 稀釋倍數(shù)平均值

菌數(shù)(個/mL)1

短軸＝

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

作業(yè)：

1.什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺校正。2..根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會說明血細(xì)胞計(jì)數(shù)法的誤差主要來自哪些方面？如何減少誤差？ 3..在滴加菌液時，為什么要先置蓋玻片然后滴加菌液？能否先加菌液再置蓋玻片？ 4..用血球計(jì)數(shù)板測定微生物數(shù)量時，哪些步驟易造成誤差？如何預(yù)防？計(jì)算細(xì)胞數(shù)目時此法是否可以適用？ 實(shí)驗(yàn)六 環(huán)境中微生物的檢測和分離純化 〔目的要求〕

1、學(xué)習(xí)并掌握各種無菌操作技術(shù)，并用此技術(shù)進(jìn)行微生物的劃線分離接種

2、學(xué)習(xí)掌握平板菌落計(jì)數(shù)法 〔基本原理〕

土壤是微生物生活的大本營，是生物多樣性的重要場所，也是發(fā)揚(yáng)微生物資源的重要基地，可以從中分離純化得到許多的菌株。劃線法是常用的分離與純化方法，通過無菌操作條件下，“漸劃漸稀”的效應(yīng)而得到菌落純的菌株。

平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測樣品經(jīng)過適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散形成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品含菌量。這種方法為活菌計(jì)數(shù)法，廣泛應(yīng)用于生物制品及污染程度（含菌指數(shù)）的檢測。

〔材料與用品〕

土樣10g，無菌平皿（20套）及無菌水，牛肉膏蛋白胨平板（2只）；取液器（0.5mL及1mL各三支）；無菌有帽試管，三角瓶，無菌涂棒，接種環(huán)，記號筆，酒精燈，火柴，試管架 〔方法步驟〕

1、周圍環(huán)境中微生物的檢測

平板分4個區(qū)做好標(biāo)記

用未洗的手指及肥皂洗過的手指（1次、2次、3次，或其它）分別在四個區(qū)上涂抹

倒置到37℃培養(yǎng)24小時觀察結(jié)果。

2、土壤中微生物分離純化及平板計(jì)數(shù)

采土樣（5－20cm）土10g，裝入到已滅菌的牛皮袋（信封）中，封好袋口

1.0g加入99mL無菌水（三角瓶）中

1mL無菌吸管0.5mL加入到4.5mL無菌水試管中，吹吸三次，振蕩均勻(10-3)。同法得10－4－10－6土壤溶液

用接種環(huán)沾取10-2土壤懸液在已經(jīng)凝固的平板表面進(jìn)行劃線分離

分別取各濃度土壤懸液0.1mL對號均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨平板，用無菌涂棒涂勻（多涂幾遍）。每個濃度做3個平板。〔結(jié)果分析〕

1、有較大片菌苔生長時，棄用。

2、選擇平均菌落數(shù)在30－300之間的平板。只有一個濃度符合此范圍時，以該平均菌落數(shù)為準(zhǔn)；有兩個濃度的平板菌落數(shù)在30－300之間時，按兩者的總數(shù)平均決定，比值小于2，取平均，比值大于2則取較少的菌落總數(shù)。所有菌落數(shù)大于300，取稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)；所有菌落數(shù)均小于30，取稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)（即當(dāng)所有菌落數(shù)均不在30－300之間時，此實(shí)驗(yàn)的精確度要求下，可以最接近30或300的菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)）。

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

土壤中的菌數(shù)量在哪個數(shù)量級？你分離的微生物主要有哪些種類？為什么？

105數(shù)量級，主要是細(xì)菌，也有酵母。主要通過其菌落特征來判斷。細(xì)菌的菌落為濕潤，其正反面顏色一般一致，普遍比較小。酵母的菌落濕潤，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一致，不透明，邊緣整齊；而霉菌菌落特征：干燥，正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。

實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)

〔目的要求〕了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)方法；通過對不同細(xì)菌對不同含碳、氮化合物的分解利用情況，了解基代謝多樣性；學(xué)習(xí)不同培養(yǎng)基基中的不同生長現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義。

〔實(shí)驗(yàn)原理〕各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對營養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物存在差別。細(xì)菌的這種代謝方式可供鑒別細(xì)菌之用。用生理生化試驗(yàn)的方法檢測細(xì)菌對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱為細(xì)菌的生理生化反應(yīng)。有些細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖，而不能分解乳糖；有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸和氣體；有的細(xì)菌則只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。在配制培養(yǎng)基時預(yù)先加入溴甲酚紫（ｐH4.4紅色～ｐH6.2黃色），當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基由紫色變黃，氣體的產(chǎn)生則可由試管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來判斷。大腸桿菌不產(chǎn)生丁二醇，V.P.試驗(yàn)為陰性。其進(jìn)行混合酸發(fā)酵，故甲基紅試驗(yàn)為陽性。產(chǎn)氣桿菌則進(jìn)行丁二醇發(fā)酵，V.P試驗(yàn)為陽性，甲基紅試驗(yàn)為陰性。

〔材料用具〕E.coli，變形桿菌，枯草芽孢桿菌，產(chǎn)氣桿菌，糞水中分離的未知菌種斜面，糖發(fā)酵培養(yǎng)基；超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，試管，移液管，杜氏小管。甲基紅試劑、V.P.試劑。

〔實(shí)驗(yàn)步驟〕各取4支相應(yīng)的培養(yǎng)基，標(biāo)記好發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱、所接菌種名及組號，1支接大腸桿菌，1支接變形桿菌，1支接未知斜面菌種，1支不接。

1、糖發(fā)酵試驗(yàn)

2、甲基紅試驗(yàn)

3、V.P.試驗(yàn)

接種后37℃分別培養(yǎng)24h、48h、48h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入表中。〔實(shí)驗(yàn)結(jié)果〕

表7－1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 編號 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 產(chǎn)氣桿菌 未知菌 CK 葡萄糖發(fā)酵

乳糖發(fā)酵

甲基紅實(shí)驗(yàn)

V.P.試驗(yàn)

〔實(shí)驗(yàn)討論〕

如：討論通過哪些生理生化反應(yīng)可以區(qū)分大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌？

大腸桿菌不產(chǎn)生丁二醇，V.P.試驗(yàn)為陰性。其進(jìn)行混合酸發(fā)酵，故甲基紅試驗(yàn)為陽性。產(chǎn)氣桿菌則進(jìn)行丁二醇發(fā)酵，V.P試驗(yàn)為陽性，甲基紅試驗(yàn)為陰性。

實(shí)驗(yàn)八（綜合實(shí)驗(yàn)）化能異養(yǎng)微生物的分離與純化 [目的要求]

1．掌握細(xì)菌、放線菌、酵母苗和霉菌稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。

2．學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。

3．學(xué)習(xí)并掌握平板傾注法和斜面接種技術(shù)，了解培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間。

4．學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)法。[基本原理]

土壤是微生物生活的大本營，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥，偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中放線苗數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離細(xì)菌、放線菌和霉菌；白面曲(發(fā)面用的引子)或酒曲或果園土中分離酵母菌。

為了分離和確保獲得某種微生物的單苗落，首先要考慮制備不同稀釋度的苗懸液。各類菌的稀釋度因菌源、采集樣品時的季節(jié)、氣溫等條件而異。其次，應(yīng)考慮各類微生物的不同特性，避免樣品中各類微生物的相互干擾。細(xì)菌或放線苗在中性或微堿性環(huán)境較多．但細(xì)菌比放線萌生長快，分離放線菌時，一般在制備土壤稀釋液時添加10%酚或在分離培養(yǎng)基中加相應(yīng)的抗生素以抑制細(xì)菌和霉菌(如加鏈霉素25-50μg mL以抑制細(xì)菌；添加制霉菌素50μg／mL或多菌靈30μ／mL以抑制霉菌)；酵母苗和霉菌都喜酸性環(huán)境，一般酵母菌只能以糖為碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5時生長極快。而細(xì)菌生長適宜的酸堿度為pH7，所以分離酵母菌時只要選擇好適宜的培養(yǎng)基和pH，可降低細(xì)菌增殖率，霉菌生長慢，也不干擾酵母菌分離。若分離霉菌，需降低細(xì)菌增殖率，一般培養(yǎng)基臨用前須添加滅過菌的乳酸或鏈霉素。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計(jì)數(shù)，分離霉菌時常在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抑制劑。要想獲得某種微生物的純培養(yǎng)，還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。四大類微生物的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間見表所示。[材料與用品] 1.菌源 選定采土地點(diǎn)舌。鏟去表土層2～3cm，取3～10cm深層土壤10g，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內(nèi)．封好袋口，并記錄取樣地點(diǎn)、環(huán)境及日期。土樣采集后應(yīng)及時分離，凡不能立即分離的樣品，應(yīng)保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌種的變化。從面曲中分離酵母菌。也可用酒曲等替代。

2．培養(yǎng)基 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏合成一號培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基(制平板和斜面，3．無菌水或無菌生理鹽水 配制生理鹽水．分裝于250mL錐形瓶中，每瓶裝99mL(或95mL分離霉菌用)，每瓶內(nèi)裝10粒玻璃珠；分裝試管，每管裝約4.5-5mL(不超過試管高度的1／5)。

4．其他試劑與用品 無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌玻璃涂棒(刮刀)、稱量紙、藥匙、洗耳球、10％酚溶液。[實(shí)驗(yàn)步驟]

1．稀釋分離法平板分離菌有傾注法和涂布法兩種。本次實(shí)驗(yàn)分離細(xì)菌、放線菌、霉菌時采用傾注法，酵母菌分離采用涂布法：

(1)細(xì)菌的分離 1)制備土壤稀釋液 稱取土樣1 g，在火焰旁加入盛有99mL并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．振蕩10一20min，使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，制成10-2稀釋度的土壤稀釋液。然后按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋分離，以制備10-2稀釋度為例，具體操作過程如下：取4.5 mL無菌水試管6支，按10-2......10-7順序編號，放置在試管架上。取無菌移液管一支，從移液管包裝紙?zhí)?中間撕口，將包裝紙?zhí)追殖缮稀⑾聝啥危コ露伟b紙?zhí)祝谝埔汗苌隙斯芸谘b橡皮頭，取出下段移液管紙?zhí)追胖米烂妫杂沂帜粗浮⑹持浮⒅兄改米∫埔汗懿范说南鹌ゎ^，將吸液端口及移液管外部表面迅速通過火焰2～3次，殺滅撕紙?zhí)讜r可能污染的雜菌，切忌不要用手指去觸摸移液管吸液端口及外部。左手持錐形瓶底，以右手掌及小指、無名指夾住錐形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夾在于上，不能亂放在桌上)，將lmL移液管的吸液端伸進(jìn)振蕩混勻的錐形瓶土壤懸液底部，用手指輕按橡皮頭，在錐形瓶內(nèi)反復(fù)吹吸二次(吹吸時注意第二次液面要高于第一次吹吸 的液面)，然后準(zhǔn)確吸取0.5mL10-2土壤稀釋液，右手將棉塞插回錐形瓶上，左手放下錐形瓶，換持一支盛有4.5mL無菌水的試管，依前法在火焰旁拔除試管帽(或棉塞)，將0.5m10-2土壤稀釋液注入4.5m1無菌水試管內(nèi)，制成l0-3的土壤稀 釋液，將此移液管通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。另取一只未用過的無菌移液管在試管內(nèi)反復(fù)吹吸三次，然后取出移液管，并將其通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。蓋上試管帽。右手持10-3稀釋液試管在左手十敲打20～30次。混勻土壤稀釋液。再從紙?zhí)兹〕鲈瓉淼囊埔汗埽迦胂♂屢阂褤u勻的試管內(nèi)，再吹吸三次，然后準(zhǔn)確吸出o.5mL 10-3的稀釋液。置第二支裝有4.5 m1無菌水試管，制成10-4：土壤稀釋液。用同法再制成 10-

5、10-

6、10一7的土壤稀釋液(為避免稀釋過程誤差，進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)時，最好每一個稀釋度更換一支移液管)：最后用的移液管重新放人紙?zhí)變?nèi)。待滅菌后，再洗刷或?qū)⒂眠^的移液管放在廢棄物筒中．用3%-5%來蘇爾浸泡l h后再滅菌洗滌。2)傾注法分離 取無菌培養(yǎng)皿6-9套，分別于培養(yǎng)皿底面按稀釋度編號。稀釋完畢后，用原來的移液管從菌液濃度最小的10-7土壤稀釋液開始吸取1mL稀釋液，按無菌操作技術(shù)加到和應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。再依同方法分別吸取1mLl0-

6、10-5的土壤稀釋液，各加到和應(yīng)編號為10-

6、10-5的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。將已滅菌的肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化，待冷卻至45-50度左右，分別傾入到已盛有I0-

5、10-

6、10-7土壤稀釋液的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意：溫度過高易將菌燙死，且皿蓋上冷凝水太多，會影響分離效果；低于45％培養(yǎng)基易凝固，平板易出現(xiàn)凝塊、高低不平。傾倒培養(yǎng)基時注意無菌操作，要在火焰旁進(jìn)行。左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶底部，左手同時用小指和手掌將棉塞拔開，灼燒瓶口．用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入培養(yǎng)基約12-15 mL，將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕轉(zhuǎn)動，使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合均勻．混勻后靜置桌上，待凝。3)培養(yǎng) 待平板完全冷凝后，將平扳倒置于35-37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。

(2)放線菌的分離

1)制備土壤稀釋液 稱取土樣l g，加入盛有99m1并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．并加人lo滴10％酚溶液(抑制細(xì)菌生長，可用l％的重鉻酸鉀溶液代替lo%酚溶液．效果更好)。振蕩后靜置5min，即成10-2土壤稀釋液。

2)傾注法分離 按前法將土壤稀釋液分別稀釋為10-

3、10-

4、10-5三個稀釋度，然后用無菌移液管依次分別吸取lmL 10-

5、l0-

4、10-3土壤稀釋液于對應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用高氏合成1號培養(yǎng)基依前法傾倒平板，每個稀釋度做2～3個平行培養(yǎng)皿。理鹽水內(nèi)，振蕩20min，即成10-2的面曲稀釋液。若選用果園上樣，也依前法稱取土樣，制成10-2壤稀釋液。3)涂布法分離 依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化并冷卻至45-50℃的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取上述l0-

6、l0-

5、10-4三個稀釋度苗懸液0.1mL，依次滴加于對應(yīng)編號已制備好的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基平板上。右手持無菌玻璃涂棒，左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破。4)培養(yǎng) 接種后，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3 d觀察結(jié)果。

2劃線分離法 菌種被其他雜苗污染時或混合菌懸液常用劃線法進(jìn)行純種分離。此法將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線，使混雜的微生物細(xì)胞在平板表面分散，經(jīng)培養(yǎng)得到分散成由單個微生物細(xì)胞繁殖而成的菌落，從而達(dá)到純化目的。平板制作方法如前所述。但劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；為便于劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法兩種。(1)連續(xù)劃線法 連續(xù)劃線法是從平板邊緣一點(diǎn)開始，連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當(dāng)中不需灼燒接種環(huán)上的菌。以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處，取出接種，燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸人平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻．然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線。劃線時平板面與接種環(huán)面成30～40°的角度，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線。接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊。劃線完畢，關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(以免培養(yǎng)過程中皿蓋冷凝水滴下，沖散巳分離的菌落)。培養(yǎng)后在劃線甲板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài)，涂片鏡檢為純種后再接種斜面。(2)分區(qū)劃線法平板分四區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。劃線時每次將平板轉(zhuǎn)動60一70°劃線，每換一次角度，應(yīng)將接種環(huán)上的菌燒死后，再在上次劃線末尾處繼續(xù)劃線。取菌、接種、培養(yǎng)方法與連 續(xù)劃線法相似。分區(qū)劃線法劃線分離的平板分4個區(qū)，其中第四區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第四區(qū)內(nèi)劃線與l、2、3區(qū)線條和接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與l區(qū)線條和平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120度左右。先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃3～5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋．將平板轉(zhuǎn)動60～70°，右手把接種環(huán)上多余苗體燒死，將燒紅的接種環(huán)在子板邊緣冷卻，再按以上方法以1區(qū)劃線的苗體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)作第二次早行劃線。第二次劃線完畢，同時再把平皿轉(zhuǎn)動約60一70°，同樣依次在5、1區(qū)劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，同上法培養(yǎng)，在劃線區(qū)觀察單菌落。本次實(shí)驗(yàn)在分離細(xì)菌的平板上選取單菌落。于肉膏蛋白胨平板上再次劃線分離，使菌進(jìn)一步純化。劃線接種后的平板，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

3．微生物菌落計(jì)數(shù)(平板菌落計(jì)數(shù)法)含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個活苗細(xì)胞可以在平板上繁殖形成一個肉眼可見的菌落。故可根據(jù)平板上菌落的數(shù)目．推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數(shù)。每克菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)＝(同一稀釋度的3個平板上菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù))/含菌樣品克數(shù)。一般由三個稀釋度計(jì)算出的每克含菌樣品中的總活菌數(shù)和同一稀釋度出現(xiàn)的 總活菌數(shù)均應(yīng)很接近，不同稀釋度平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)應(yīng)呈規(guī)律性地減少。如相差較大，表示操作不精確。通常以第二個稀釋度的平板上出現(xiàn)50個左右菌落為好。也可用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

4．平板菌落形態(tài)及個體形態(tài)觀察 從不同平板上選擇不同類型菌落用肉眼觀察，區(qū)分細(xì)菌、放線菌、酵母茵和霉菌的菌落形態(tài)特征。并用接種環(huán)挑菌，看其與基質(zhì)結(jié)合緊密程度。再用接種環(huán)挑取不同菌落制片，在顯微鏡下進(jìn)行個體形態(tài)觀察。記錄所分離的含菌樣品中明顯不同的各類菌株的主要菌落特征和細(xì)胞形態(tài)。

5.分離純化菌株轉(zhuǎn)接斜面(斜面接種)在分離細(xì)菌、放線菌，酵母苗和霉菌的不同平板上選擇分離效果較好，認(rèn)為已經(jīng)純化的苗落各挑選一個用接種環(huán)接種斜面。將細(xì)菌接種于肉膏蛋白胨斜面，放線菌接種于高氏1號斜面，酵母菌和霉菌接種于豆芽汁葡萄糖斜面上。貼好標(biāo)簽，在各自適宜的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)后觀察是否為純種，記錄斜面培養(yǎng)條件及苗苔特征。置冰箱保藏。[實(shí)驗(yàn)報告] 1.簡述分離微生物純種的原則及列出分離操作過程的關(guān)鍵無菌操作技術(shù)。2.四大類微生物的分離方法及培養(yǎng)條件

3.分離的微生物平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

4.樣品中單菌落菌株的菌落培養(yǎng)特征與鏡檢形態(tài) 5.斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征(包括純化結(jié)果)。

[思考題] 1.稀釋分離時．為什么要將已融化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45～50℃左右才能傾入到裝有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)? 2.劃線分離時為什么每次都要將接種環(huán)上多余的菌體燒掉?劃線時為何不能重疊? 1.3.在恒溫箱中培養(yǎng)微生物時為何培養(yǎng)皿均需倒置? 4.分離某類微生物時培養(yǎng)皿中出現(xiàn)其他類微生物，請說明原因。應(yīng)該如何進(jìn)一步分離和純化；經(jīng)過-次分離的菌種是否皆為純種，若不純，應(yīng)采用哪種分離方法最合適? 5.根據(jù)哪些菌落特征可區(qū)分細(xì)菌、放線苗、酵母菌與霉菌?它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在菌落形態(tài)上有什么聯(lián)系？