第一篇：細胞培養(yǎng)步驟

細胞培養(yǎng)前需要準備的物品

提前開啟37℃水浴鍋和超凈臺的紫外燈；

滅菌吸頭、1.5mL的離心管、空玻璃瓶；

無菌的15mL、50mL離心管；

無菌的10cm培養(yǎng)皿、16孔板、32孔板、96孔板、培養(yǎng)瓶等。

5mL、10mL的移液管；

橡膠手套、普通移液器、電子移液器、裝有99.9%-100%CO2鋼瓶

70%酒精、DMEM培養(yǎng)基（37℃提前溫浴）、FBS血清、二抗生素（10,000Unit/mL penicillin和10,000ug/mL Streptomycin混合液）、0.05% typsin-EDTA（上述培養(yǎng)細胞所用試劑都用GIBCO的產(chǎn)品，國產(chǎn)的產(chǎn)品沒有辦法保證質(zhì)量）細胞培養(yǎng)步驟

1.取一瓶液體DMEM培養(yǎng)液（GIBCODMEM液體低糖培養(yǎng)基）、FBS血清、二抗，在放入超凈臺前用70%的酒精消毒；

2.向500mL的DMEM培養(yǎng)基中加入55mL的FBS血清，至終濃度為10%，再向其中加入雙抗生素，一般保證抗生素的單位達到100Units（即500mL培養(yǎng)基中加入5mL 10,000單位的雙抗生素，如果用于保藏的細胞培養(yǎng)最好不加），放置于4℃冰箱中保藏待用；

3.細胞培養(yǎng)使用前培養(yǎng)基應先放入37℃水浴中溫浴，提前打開超凈臺的紫外燈殺菌，然后從水浴鍋中取出培養(yǎng)基，噴上70%酒精后放入超凈臺中待用；

4.從液氮中取出凍存管，立刻放入37℃的水浴鍋中晃動，直至細胞凍存液完全溶解；

5.將細胞凍存懸液轉移到離心管內(nèi)，加入約5mL培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；

6.將細胞懸液經(jīng)500rpm/min離心5min，棄上清液。

7.向細胞沉淀內(nèi)再加入適量培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉移到培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。

8.取出在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的細胞（一般BMSCs傳代3次左右就不太好了，所以較難培養(yǎng)）顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，在超凈臺中吸去表面的培養(yǎng)基，此時加入少量的培養(yǎng)基清洗一下，然后向培養(yǎng)基內(nèi)加入1-2 ml 0.05%胰蛋白

酶后放入37℃培養(yǎng)箱中處理1-2分鐘使細胞與培養(yǎng)皿脫離。

9.取出培養(yǎng)皿，觀察胰酶處理的效果，一般以視野中出現(xiàn)均勻的單細胞為宜，如果有多個細胞聚集的現(xiàn)象可以繼續(xù)處理1-2分鐘，然后吸去胰酶，加入適量的培養(yǎng)基進行終止胰蛋白酶活性，用電子移液器套移液管進行吹打，使細胞懸浮。

10.顯微鏡下觀察細胞懸浮程度，最好是可以看到均勻的單細胞，如果有多個細胞聚集的現(xiàn)象可以用手動移液器進行吹打。

11.向事先準備好的培養(yǎng)皿中加入8-9ml的培養(yǎng)基（此過程加入的培養(yǎng)基的量與加入細胞時所帶入的培養(yǎng)基的量有關），一般10cm的平板中總量有10ml的培養(yǎng)基。向含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中加入1-2ml的細胞懸液，然后放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)

注意事項：

1.加入FBS血清時要考慮血清本身的體積，使FBS血清的終濃度達到10%；

2.FBS血清和二抗生素提前1天放入4℃的冰箱中融化，可以用50mL無菌的離心管分裝，以免多次融化造成血清變性。每50mL的離心管中最多裝入40-45mL的FBS血清，因為血清凍存后會膨脹；

3.凍存管中的細胞溶化過程要迅速，減少DMSO對細胞的破壞作用；

第二篇：動物細胞培養(yǎng)總結! !!!

動物細胞培養(yǎng)總結 一．實驗準備

1.實驗器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包裝

離心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，凍存管若干放進鋁飯盒，用牛皮紙包裹，系緊棉繩，用筆在飯盒上和牛皮紙上標記盒內(nèi)所裝物品名稱、數(shù)量、日期和所屬人名稱。

藍槍頭兩盒，黃槍頭白槍頭各一盒用牛皮紙包裹，用棉繩扎緊。取適量蒸餾水于4L玻璃瓶，瓶蓋擰松半圈。

過濾器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自來水毛刷洗滌劑刷洗，蒸餾水潤洗，烘干。

過濾器兩部分分別包裹，先將瓶口部位用錫紙包裹后，再罩以牛皮紙，再用棉布密包起來，用棉繩扎緊。

玻璃瓶擰下瓶蓋，瓶身浸酸。浸酸時應注意安全，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁以便浸酸結束后清洗耐酸手套，防止走動時酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意緩慢降低瓶身，使液體慢慢浸入瓶內(nèi)，以免產(chǎn)生氣泡濺出酸液，發(fā)生危險。浸酸時器皿要充滿酸液，勿留氣泡，浸泡過夜。取出瓶身時，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁，取出后將瓶身放入盆內(nèi)水中在轉移至水池邊清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。換水洗幾次，待水澄清后開始沖洗，每瓶都用自來水灌滿，倒掉，重復15次，再用蒸餾水漂洗5次，去離子水漂洗3次，烘干備用。（2）消毒滅菌

1>全自動高壓滅菌鍋：插電源，打開開關，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補足，放入物品，瓶類物體須擰松蓋子后放最上面一筐，蓋上滅菌鍋蓋，擰緊蓋子至溫度顯示欄的左上角有一紅點亮燈，按start開始升溫。若滅有無菌水或玻璃瓶待降溫至常溫再打開，打開后立即擰緊，無菌水瓶口封上封口膜。若沒滅瓶類物品，降溫至80度左右即可打開滅菌鍋，須戴上線手套取出。

2>手提式高壓滅菌鍋：插電源，打開開關，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補足，檢查設定是否為121度20分鐘，放入物品，蓋上滅菌鍋蓋，注意導氣管一定插到鍋底并不能堵塞，用手對稱地擰緊鍋蓋螺栓，再用扳手繼續(xù)擰緊。加溫升壓之前，先打開排氣閥門，加溫約半小時后見排氣閥處開始排殘留在鍋內(nèi)的冷空氣，排氣五分鐘，關閉排氣閥，繼而開始升壓。滅菌后不要立即打開氣閥放氣以免水汽噴出。待自然降溫至常壓才能打開氣閥。

玻璃瓶須擰緊，飯盒，槍頭滅菌后放入烘箱烘干備用。2.無菌間消毒及設備檢查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兌水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔細擦拭CO2培養(yǎng)箱，超凈臺，超凈臺內(nèi)物品，顯微鏡，桌面，若培養(yǎng)箱內(nèi)未培養(yǎng)細胞可以再打開高溫滅菌模式將培養(yǎng)箱滅菌一次。

用蒸餾水擦拭清洗水浴鍋內(nèi)壁，注意底座不要沾水。檢查CO2總壓力表，若讀數(shù)不足四分之一提前預定CO2瓶，換瓶時需要扳手。CO2培養(yǎng)箱最下層的增濕盤須定期觀察加水，將增濕盤內(nèi)注入1/2無菌蒸餾水，并將盤直接放置在培養(yǎng)箱中央。啟動培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱接通電源，增濕盤加水，連接好氣體供給，檢查有無漏氣，輸入系統(tǒng)設置。設置溫度和二氧化碳。

紫外照射無菌間30分鐘，注意屋內(nèi)不要有人以及培養(yǎng)基等試劑。3.細胞培養(yǎng)用液的配置及分裝

RPM1640培養(yǎng)基配制：將干粉型RPM1640培養(yǎng)基溶于總量1/3的去離子水中，再用1/3水沖洗包裝內(nèi)2次，倒入培養(yǎng)基中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液，根據(jù)產(chǎn)品說明的要求和實驗補加谷氨酰胺和NaHCO3 ,傾斜三角瓶輕輕放入轉子，用磁力攪拌器攪拌2h。用泵使培養(yǎng)基在超凈臺內(nèi)通過滅菌的過濾器，過濾除菌，分裝后置4度冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们罢{(diào)pH至7.0，加雙抗于培養(yǎng)液中濃度為1%，使用時加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的處理：使用前應做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體，將胎牛血清放入56度水浴中30分鐘，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。分裝前提前2天放4度冰箱解凍，溶解完全后于超凈臺內(nèi)分裝為25ml每管，留2管放四度備用，余下放-20度凍存。配制含血清培養(yǎng)基或凍存液前務必提前一天取出分裝后的血清四度溶解備用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸餾水，NaHCO3溶于水后，過濾除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超凈臺內(nèi)分裝成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度備用。

雙抗溶液配制：80萬單位青霉素加4ml滅菌D-Hanks液，即成20萬單位/ml溶液。100萬單位鏈霉素加5ml滅菌的D-Hanks液，即成20萬單位/ml溶液。兩溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，則成含青鏈霉素各1萬單位/ml，分裝后置于4度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二．操作步驟 注意事項：

1、所有實驗用的器械，儀器滅菌，消毒，烘干。

2、打開溶劑，培養(yǎng)瓶瓶蓋時，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下。

3、用完溶劑，培養(yǎng)瓶時，瓶口及瓶蓋也要在酒精燈上烤一下。

4、所有物品放入超凈臺需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗內(nèi)時需要重新用酒精棉擦拭。開始工作：

1、實驗前換紫外照過的白大褂和拖鞋。

2、戴橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺面，點燃酒精燈。

3、取待用的細胞，旋緊瓶蓋。

4、胰酶消化緩慢時可以將細胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促進消化。1.細胞復蘇

提前預冷離心機，設參數(shù)為4度，1000r/min,5min。

將槍頭，裝有離心管的飯盒，垃圾盒放入超凈臺，酒精棉擦一遍超凈臺臺面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時取出無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基37度水浴加熱。

關閉紫外，打開風機，升高窗高，點燃酒精燈，用鑷子從飯盒中取2個15ml離心管放至試管架，每管加入3ml無血清培養(yǎng)基，提前剪好2條封離心管的封口膜備用。

戴上橡膠手套再套上線手套，用鑷子從液氮中取出塑料凍存管，用手拿凍存管迅速浸入37度水浴中，劇烈急速搖晃凍存管，因為有防水膠布纏裹不用擔心進水染菌，使其急速融化，注意管內(nèi)凍存細胞的融化情況。基本轉為液態(tài)時將凍存管取出，摘下線手套，凍存管轉移至超凈臺內(nèi)，用酒精擦手，擦拭凍存管尤其管口，撕下膠布和封口膜，再擦拭管口，整個溶解過程盡量在30s至1min內(nèi)完成。(注意：這一步對細胞存活率至關重要。既要盡快融化以減少融化過程對細胞的損害，又要盡可能減少細胞在較高溫度停留的時間以減少DMSO對細胞的毒害，切不可將凍存管放在燒杯內(nèi)不管。)打開凍存管管蓋，逐滴加入1ml無血清培養(yǎng)基，輕柔地將凍存管內(nèi)的細胞懸液吸取出來，轉移至已備好的離心管內(nèi)，輕輕搖混勻，蓋上管蓋，輕輕地上下顛倒混勻。封上封口膜。

低俗離心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液盡可能吸走，同時又不觸及管底沉淀的細胞。（較高要求時可以用手指輕彈離心管管底，將細胞團分散，加入10ml無血清培養(yǎng)基混勻離心10min棄上清再洗一次，有助于減少DMSO殘留。）加3至5ml培養(yǎng)液至沉淀的細胞，輕輕搖晃使分散成細胞懸液，將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，擰緊蓋子，轉移至培養(yǎng)箱中再反旋擰松半圈，以利于瓶口內(nèi)外進行氣體交換，注意取出培養(yǎng)瓶時須先擰緊瓶口。37度恒溫箱中培養(yǎng)。第二天觀察細胞生長情況。培養(yǎng)基瓶蓋過火，擰緊后封上封口膜。收好物品，擦一遍臺子，滅酒精燈。2傳代培養(yǎng)

附著型胞(adherentcell)傳代培養(yǎng)

離心法提前預冷離心機，設置好參數(shù)4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

將滅菌槍頭，裝有離心管的飯盒，新培養(yǎng)皿/瓶,垃圾盒放入超凈臺，酒精棉擦一遍超凈臺臺面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時從冰箱取出PBS,胰酶，含血清培養(yǎng)基于37度水浴加熱。關閉紫外，打開風機和照明，升高窗高，點燃酒精燈，將所需試劑先擦瓶底，放在臺子上再擦側壁一圈，擦瓶口瓶蓋，撕下封口膜，再仔細擦一遍瓶口。用噴過酒精的塑料筐將細胞培養(yǎng)瓶擰緊蓋子拿到超凈臺旁的椅子上放平放穩(wěn)，每三瓶/皿一摞拿入超凈臺先擦最下面一個的底部，擦好后放在臺面上，擦一摞的側面一圈，在分別擦底面頂面瓶口，直到所有培養(yǎng)瓶各個面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker標記字跡的部位，酒精會擦掉字跡，若擦到字跡待酒精干后立即補寫上以防事后記不清。

輕輕倒掉舊培養(yǎng)液，注意不要使液體倒流回來沖擊細胞，掛在外壁的殘留液滴用酒精棉擦掉,培養(yǎng)瓶可以輕輕翻轉瓶子使細胞生長的面在上，頂面在下，液體留至頂面后直接倒掉液體。加1ml PBS，注意槍沖著不長細胞的培養(yǎng)皿側壁或翻轉培養(yǎng)瓶朝瓶的頂壁或側壁打入PBS，盡量不碰到瓶口或培養(yǎng)皿，若懷疑碰壁，棄掉槍頭。輕輕搖晃培養(yǎng)皿或瓶，使PBS沾到所有細胞，洗滌細胞一遍，輕輕倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀釋（0.25%為1X胰酶），37℃作用數(shù)分鐘。等待消化期間準備好新的培養(yǎng)皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培養(yǎng)基。消化中的皿蓋好蓋子或瓶擰緊蓋子，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀，有10%細胞漂動時，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用。(若細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀且80%細胞漂動，則不移去胰酶，在胰酶作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用，吹打成細胞懸液轉移至離心管，封上封口膜，離心后再吸掉上清液。）

輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，以吸管上下輕輕吸放數(shù)次以打散細胞團塊，注意吹打時有系統(tǒng)性的將所有面積都打到不要集中只吹打一處而一些地方?jīng)]吹打到，吸和吹時槍頭都不要離開液面以減少氣泡，氣泡多破裂時對細胞有沖擊且會增加體積不利于操作，培養(yǎng)瓶吹打時操作角度小不方便，用倒液法（10%細胞漂動即倒掉胰酶加含血清培養(yǎng)基終止消化）時吹打細胞要用二檔多吹打幾次，用皿或離心法（80%細胞飄動不棄胰酶直接加含血清培養(yǎng)基再離心棄上清）時細胞很容易脫落，可以用一檔輕輕吹打，保證所有面積都吹打到即可。混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，鏡下觀察細胞數(shù)量多，培養(yǎng)液澄清，若細胞密度過低將影響生長可適當補充細胞懸液，若細胞密度過大將影響迅速生長一天后即需傳代，可根據(jù)實驗適當添加培養(yǎng)基或細胞懸液使生長速度符合預期，轉移至CO2培養(yǎng)箱，擰松半圈瓶蓋，37度培養(yǎng)。試劑瓶瓶蓋過火，擰緊后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍臺子，滅酒精燈。

3細胞換液

取待用的細胞，旋緊瓶蓋。

棄去舊的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶放回原處。

用微量槍加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細胞，然后將PBS緩沖液棄掉。

用微量槍加入適量的細胞培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中。旋緊瓶蓋。將細胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱，反旋擰松瓶蓋半圈，培養(yǎng)。

4細胞凍存 1>準備工作：

提前一天將血清FBS從-20度取出放在4度冰箱解凍。選取對生增生期細胞（鏡下密密麻麻，胞體突觸明顯），在收集細胞24h前換液一次。

進入細胞室前，首先用75%酒精擦試工作臺，接著紫外滅菌30，過后，關閉紫外燈，通風10min。從冰箱中取出胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基，血清37度水浴。取出室溫放置的DMSO。找到防水的醫(yī)用膠布，濾菌膜，針管和所需槍頭飯盒等物品，噴一遍酒精，放入臺子照紫外。2>開始工作：

實驗前在更衣間換上紫外照過的白大褂和拖鞋。戴上橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺面，點燃酒精燈。酒精擦拭胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基放入超凈臺。過火鑷子取出離心管于試管架，剪好封口膜備用。用濾菌膜和針管過濾DMSO以除菌。

75%無血清培養(yǎng)基，20%的血清，5%過濾除菌的DMSO，混勻配制成所需的凍存液。

取待用的細胞，旋緊瓶蓋。

棄去舊的培養(yǎng)液，掛壁殘液注意用酒精棉擦去，用微量槍朝不長細胞的側壁或頂部打槍，加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細胞，然后將PBS緩沖液棄掉。用微量槍朝不長細胞的側壁或頂部打槍，加入適量胰酶約2ml，棄掉槍頭。消化數(shù)分鐘，等待期間，用過火鑷子從飯盒中取出凍存管和管蓋標記好細胞名稱和凍存日期，直立于臺面?zhèn)溆谩?/p>

用微量槍加入適量的完全培養(yǎng)液沖洗（吹散細胞）細胞，將瓶底粘著的細胞吹散下來，再將細胞懸液移入的離心管中，封口，標簽。離心5min，1000轉/min。

細胞離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液。用微量槍將凍存液平均加入離心管中，混勻離心管中細胞凍存液。用微量槍將含細胞的凍存液移入凍存管中，封口膜封口，防水醫(yī)用膠布再纏一圈，標簽時間，細胞名稱。

凍存，需緩慢凍存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱過夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 鋪板和細胞計數(shù)

用傳代方法制成細胞懸液。倒掉培養(yǎng)基，用PBS液洗滌后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培養(yǎng)液吹打制成待測細胞懸液轉至離心管，封上封口膜，離心1000r/min,5min。

等待離心其間，取細胞計數(shù)板，蓋玻片酒精擦拭，均在酒精燈上烤一下，將蓋玻片蓋在細胞計數(shù)槽上，使覆蓋細胞計數(shù)板上的上下兩個“十字”區(qū)域。取一只新的15ml離心管，做好標記，擺放好。離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液，加入全培養(yǎng)液吹散沉淀細胞成細胞懸液，擰緊管蓋，上下顛倒混勻。用槍吹打混勻離心管中含完全培養(yǎng)液的細胞，再從離心管中取1ml細胞懸液移入新的15ml離心管，加入4ml完全培養(yǎng)液，即稀釋五倍，吹打混勻細胞懸液，上下顛倒混勻細胞懸液。

上下顛倒混勻新15ml離心管內(nèi)細胞懸液，計數(shù)前將待測液吹打均勻，用微量槍從新15ml離心管中取出細胞懸液（約10μl），滴入計數(shù)板上蓋玻片的一側縫隙旁，虹吸作用液體會吸入蓋玻片下（不能有氣泡，不然會影響細胞計數(shù)，注意滴入懸液量不能太大致使細胞懸液流入旁邊的槽中），鏡下觀察細胞，數(shù)出計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)（16個小格×4個大格），用計數(shù)器計數(shù)（約200個）

細胞數(shù) 萬個/mL原液=（4大方格細胞數(shù)之和/4）×稀釋倍數(shù)（常稀釋5倍，若細胞過多不能數(shù)清則加大稀釋倍數(shù)，不斷調(diào)整新離心管中細胞懸液的細胞濃度，直至鏡下觀察細胞數(shù)目符合要求。）每皿/瓶需鋪板50-100萬個細胞，根據(jù)細胞計數(shù)算出每皿所細胞懸液需毫升數(shù)，加入懸液時注意混勻，不得有氣泡，吸時注意每次槍尖是否都吸滿液體。每皿加入細胞懸液后，用含血清培養(yǎng)基補足至2ml/皿/瓶。24h后觀察細胞長至八成滿時即可加藥處理。

6檢驗判斷細胞狀態(tài)與加藥處理

細胞復蘇或傳代后24內(nèi)不可傳代，傳代4小時后開始貼壁。1>培養(yǎng)基顏色澄清度：

正常生長的細胞培養(yǎng)基澄清透明，傾斜使培養(yǎng)基聚集，對著燈看可透光，若出現(xiàn)絲狀沉淀或傾斜培養(yǎng)基對著燈看出現(xiàn)渾濁不透光且鏡下細胞之外的部分有密密麻麻的小黑點，很可能是染菌，應棄掉。若鏡檢在細胞之外部分有一些渾濁，可能因為細胞代謝旺盛分泌物堆積，或者因為消化時間不夠以至于過度強硬吹打細胞，造成細胞損傷產(chǎn)生大量細胞碎片，應換液。

新鮮培養(yǎng)基呈粉紅色，代謝代謝旺盛的細胞的培養(yǎng)基會變黃，此時若細胞貼壁應換液，若此時細胞已長滿，應傳代。2>密度：

細胞密度過低，鏡下觀察稀稀疏疏，則生長緩慢，甚至死亡。較大的細胞密度可促進細胞之間相互作用，促進細胞增殖生長。密度過大，密密麻麻，部分細胞不能伸展成圓形，必須傳代，此時不傳代，一兩天后細胞狀態(tài)持續(xù)不好，開始死亡，鏡檢漂浮細胞增多。3>狀態(tài)：

鏡下觀察細胞，當左右上下移動鏡頭時漂動的是未貼壁細胞或死細胞，固定不動的是貼壁細胞，貼壁細胞是活細胞。

狀態(tài)良好的貼壁SY5Y細胞有圓形的胞體和細細分支的突觸，突觸分明。狀態(tài)不好的SY5Y細胞，突觸不明顯，看不到什么細細的分支，甚至成圓形。

消化時快離壁的細胞呈亮亮的圓形。

加藥前應提前計算好藥品濃度體積，根據(jù)實驗處理要求的濃度換算出每皿應加藥品稀釋液體積和無血清培養(yǎng)基體積，列成表格以備加藥時明確操作。將藥品儲備液稀釋成稀釋液，再與相應體積的無血清培養(yǎng)基在離心管中混合好。加COS時，倒掉含血清培養(yǎng)基，PBS蕩洗一遍，加以混合好的藥品。加COS 3小時后加Ab，Ab須提前37度水浴5小時，加藥時采用半數(shù)放液法，棄去1ml原培養(yǎng)基，加入1ml已混合好的藥品。

第三篇：細胞培養(yǎng)技術總結

血清使用問題的總結

一、血清滅活問題。

1、問：加到培養(yǎng)基中的血清必須滅活嗎？ 答：不是必須的，看做什么實驗了。

2、問：四季青胎牛血清滅活是56℃30分鐘嗎？

答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長因子。但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補體受體的細胞，如內(nèi)皮細胞，血清是需要滅活，一般是56℃，30min。

3、問：我要做滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)，胎牛血清要滅活嗎？

答：進口的一般都已滅活，國產(chǎn)的不一定，最好還是滅活一下再用較安全。

4、問：我用病毒上清轉染細胞，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因為血清中可能有些補體和抗體，是不是會影響轉染？我想未滅活的血清中含些抗體補體可能會和病毒相結合，影響轉染，正確嗎？細胞是單核細胞白血病細胞，病毒是病毒包裝細胞PT67收集的病毒上清。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時，目的是什么？

答：血清一定要滅活，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時以后再加血清。避免雜蛋白對病毒和宿主結合過程的干擾，一般是2-6小時，根據(jù)細胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補體滅活！這要根據(jù)實際情況而定，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個小時。

5、問：(1)我買的是杭州四季青的新生牛血清，要滅活嗎？有些說法是需要，有些說直接解凍后就可以加入到培養(yǎng)基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有關系嗎？

答：關于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭議的話題。大多數(shù)實驗室將血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，因為有兩個作用，第一是滅活補體，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實驗者并沒有考慮熱處理對血清中的生長因子、氨基酸等成分帶來的負面影響。

我在實驗室處理血清的時候，有一次水浴箱在滅活過程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80℃，血清變成了凝膠狀，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對比，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56℃下滅活半小時以上，肯定也會對里面的蛋白起到破壞作用。下次有機會我做個延長滅活時間的實驗試試，看看到底有多大的影響。熱滅活之后，血清放在四度冰箱久了，就會有沉淀產(chǎn)生，這常常會被認為是微生物污染或者是黑膠蟲污染。為了驗證到底有沒有污染，常常又會把血清放置37℃溫育，但是血清中的蛋白會進一步析出，最后還是要做鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗，和革蘭氏染色試驗，非常麻煩。

我看過一份資料，里面提到70%的實驗者認為滅活是理所當然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時間則從15分鐘到60分鐘不等。其中最常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高，許多早先認為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對血清進行熱滅活的研究者在實驗中證實了這一步驟的有效性和必要性。有人比較過11個不同細胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對6 個細胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細胞，MRC-5)的生長帶來負面影響，三個細胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個細胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細胞生長有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對細胞的生長沒有明顯的促進作用。

你可以摸索一下，血清從-20℃冰箱拿出來之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活，比較這兩種血清對細胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個過程最多也就一個星期。同時你還要考慮血清滅活與否對你后續(xù)的實驗有沒有影響。

問：(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化，卻見血清比較混濁，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎？ 答：正常。

二、血清滅活時溫度問題。

1、問：因為實驗室水浴鍋失控，血清滅活時，溫度到了61.7℃，這血清還能用嗎？

答：多長時間啊？短時間應該可以吧，我有一次加熱了一個多小時，還照樣用。

2、問：我滅活胎牛血清時，用的電磁爐，定在了70℃，本來說調(diào)溫度到56℃再放血清的，后來忘了，就把血清放進去了，所以滅活的溫度肯定超過56℃了，不知道這樣對血清有沒有影響？

答：常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時間則從15分鐘到60分鐘不等，其中最常用的手法是56℃熱處理30分鐘。看看你養(yǎng)的細胞是什么，一般的話估計問題不大，要是很珍貴的細胞還是慎重一點啊。熱滅活目的是為了去除血清中補體等對熱敏感的物質(zhì)，在對補體滅活以外，熱處理同時也對血清中可能存在的支原體具有滅活作用。現(xiàn)在好像不主張熱滅活，熱滅活經(jīng)常給血清產(chǎn)品帶來負面影響，對血清的加熱經(jīng)常導致血清中沉淀的產(chǎn)生，此外，有研究結果證實熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對細胞的促粘附作用。

三、血清的制備方法問題。

1、問：我的實驗需要自己制備一些血清用于培養(yǎng)細胞，有沒有人知道用于培養(yǎng)細胞的血清需要怎樣的制備過程？

答：自己制備血清當心污染啊。如果無菌條件好的話，用靜置析出方法就行。

2、問：一般我們用得胎牛血清用前還要滅活，我想用大鼠的血，不知道要不要滅活？

答：你直接把采來的血液在離心管里4℃過夜，離心，取上清，在無菌過濾，也可滅活，然后分裝凍存，用時再配。

3、問：如果滅活會不會對血清中的一些因子有損傷？

答：加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。滅活一般不會對血清中的一些因子損傷的。

四、血清的保存問題。

1、問：2006年6月到期的GIBCO胎牛血清到2007年5月還能用嗎？ 答：只有試試了，如果一直在-20℃凍著來者，應該還可以，先少用點看看。養(yǎng)細胞系應該沒問題，原代不行。

2、問：請問我自然溶化好的胎牛血清和1640培養(yǎng)基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室溫下一晚行嗎？100毫升培養(yǎng)瓶加多少培養(yǎng)基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、問：4℃冰箱內(nèi)保存3個月的胎牛血清，能否繼續(xù)使用？相關細胞和其它試劑的代價比較高，不敢輕易嘗試。

答：需要長期保存的胎牛血清必須要保存在-20至-70℃的低溫冰箱中，4℃冰箱中保存時間不要超過1個月。

五、FBS可否代替人AB型血清？

問：我現(xiàn)在在做人的外周血b淋巴細胞的培養(yǎng)，文獻上要求用人的AB型血清，但是我覺得很多代理商都沒有。我想FBS代替，但不知道可否，我先是擔心免疫排斥之類，但是我查了些資料后，應該不會(我覺得)。但是我又不能夠TRY。因為細胞因子確實太貴了，所以咨詢一下。謝謝！答：你最好照文獻的做。除非你系列實驗證明你用代用品的結果與文獻的相同(你還是要用到文獻的試劑)。細胞培養(yǎng)的影響因素很多，特別是培養(yǎng)基的成分。

六、血清和培養(yǎng)基的種類及品牌問題。

1、問：細胞培養(yǎng)的胎牛血清用哪個公司的產(chǎn)品比較好呢？周圍有人用PAA或Hyclone的，這兩種跟Gibco或sigma出品的差別大嗎？ 答：如果是長得非常快得細胞如pa317，293，c6等惡性腫瘤細胞，一般得國產(chǎn)血清就可以，如果是原代培養(yǎng)的細胞，最好應用胎牛血清或類標準胎牛血清，Hyclone公司血清的質(zhì)量不如GIBCO(同類血清)。國產(chǎn)的杭州四季青和甘肅民海(中美和資)不錯。有些細胞(如：sf9，293還有其他一些元代細胞)，用Gibco的比其他兩種好很多，會大大加速試驗進度。對于其他一些細胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的還要看產(chǎn)地。

2、問：最近要訂一瓶胎牛血清，實驗室之前都在用小牛血清，沒有買過胎牛血清。請問哪個公司的好一些？問過試劑公司，有兩種：一種是PAA的(分普通級和優(yōu)級)，一種是Hyclone的(只有普通級，而且是新西蘭產(chǎn)的)。試劑公司推薦使用PAA優(yōu)級的，但看好多文獻都用Hyclone的，公司說是因為現(xiàn)在Hyclone的都不是美國進口的了。請問用的哪種胎牛血清比較好？

答：民海的效果還不錯，要是不放心國產(chǎn)的，那就買進口的。進口的好多公司都有，新西蘭產(chǎn)的效果一般。Hyclone和Gibco的都還可以。民海的似乎比四季青的要好些。復蒙的感覺也不錯。

3、問：四季青“無噬菌體、低內(nèi)毒素胎牛血清”與“無支原體胎牛血清”的區(qū)別？培養(yǎng)腫瘤傳代細胞用哪一個比較好些？ 答：用無支原體胎牛血清就可以啦。

4、問：SKBR-3細胞培養(yǎng)用哪種型號的1640培養(yǎng)基及胎牛血清？ 答：我一直用GIBCO的1640，你可以買含HEPES的1*10L的包裝，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。請查閱： www.tmdps.cn

七、培養(yǎng)基血清濃度問題。

問：在1640里加血清時加多了，90ml里加了20ml血清，約為18%，以前都是加10ml的，查了網(wǎng)上多建議用10%-15%，有關系嗎？

答：我認為一般來說血清濃度的較大波動對細胞的狀態(tài)影響較大，建議再加90ml1640調(diào)成10%。血清濃度大當然細胞狀態(tài)感覺要好，但是高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜，影響后續(xù)實驗的結果。10%的濃度培養(yǎng)鼻煙癌細胞很好。

八、心肌細胞原代培養(yǎng)時血清的使用問題。

1、問：在進行心肌細胞原代培養(yǎng)時，需要用含血清的培養(yǎng)基中止胰酶的消化作用，我現(xiàn)在使用的是含血清10%的培養(yǎng)液，但近日看北醫(yī)一個細胞培養(yǎng)的課件發(fā)現(xiàn)，有用1%血清培養(yǎng)液進行中止消化的，想問一下，1%的是否可以，效果是否有保證？這樣確實能節(jié)省不少血清的。答：關于心肌細胞元代培養(yǎng)的FBS問題：

(1)1%的血清完全培養(yǎng)基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌細胞元代培養(yǎng)就不行。10%的FBS完全培養(yǎng)基效果都不太好，開始心肌細胞元代培養(yǎng)需要高濃度的FBS，20%左右，但這就有出現(xiàn)另一個問題，在FBS完全培養(yǎng)基中，成纖維細胞呈優(yōu)勢細胞，須得在培養(yǎng)基加入適量的BrdU以抑制其生長，純化心肌細胞。

(2)FBS的作用不僅僅是拿來中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白質(zhì)如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌細胞培養(yǎng)的FBS使用，有講究：剛開始使用20%左右的高濃度的FBS，后逐漸遞減為無血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2、問：我胰酶的用量是0.08%，并混和了0.08%的膠原酶。FBS要高濃度遞減是否是說的在細胞培養(yǎng)中啊，難道在消化時終止也需要如此高的濃度嗎，還有，我的BRDU只用到48小時就不用了，因為擔心其損傷太大，可以持續(xù)用多久呢？

答：我用10%FBS終止的，然后差速1h，然后還是用10%FBS的HG-dmem養(yǎng)的，沒有用brdu，心肌細胞還是比較多和穩(wěn)定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就會有搏動。

九、牛血清污染噬菌體的問題。

1、問：有誰知道小牛血清制造過程中怎樣能夠避免噬菌體的污染，以及對已污染噬菌體的牛血清怎樣能夠除去噬菌體？

2、問：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌體，它對細胞培養(yǎng)到底有什么影響？ 暫無回答。

十、問：MTT加藥的時候加不加血清？加藥時要用無血清的培養(yǎng)基嗎？ 答：我的藥就是用含血清的培養(yǎng)基稀釋的，不含血清的培養(yǎng)基對細胞有毒性或抑制作用，無形中對細胞造了一個serum-free的模型，細胞在提內(nèi)本來就是有血清供應，如果該藥物都不能對抗，那該藥物就沒有什么臨床價值了，這是我的理解。

十一、AB血清的制備問題。

問：本人想從人的外周血中分離AB血清的，用于B淋巴細胞的培養(yǎng)。謝謝大家給點建議。人的血，來之不易啊。答：是AB血型人的血清嗎？這種血清即沒有抗A型抗原抗體，也沒有抗B型抗原抗體。分離血清時將采集的血液注入試管中，待血液凝固后離心分離血清。可將采集的血液放在37℃水浴箱中促進血液凝固，減少凝固時間。離心可在2500～3000rpm，10min，足可以分離血清。分離后將血清吸出保存即可。分離血清的量可按采集血液的50%左右計算，因為紅細胞占總血液的50%左右。當然整個過程要注意無菌操作。

十二、PC12細胞培養(yǎng)所用血清問題。

問：我正準備購買上海細胞所的未分化的PC12細胞，需要滅活的馬血清，可現(xiàn)在買血清很困難，好像是海關有封鎖，代理商這么說的，我原定購買的Gibco的horse surum，現(xiàn)在無法買到了，好容易找到一個目前可以進血清的公司Hyclone，有一種Donor Equine serum是馬血清嗎？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是這個。我當時是在鼎國(重慶辦事處)買的，100ml大概140元，具體不記得了。當時是看它比別的進口的馬血清便宜。另外：我買了以后滅活的。

十三、血清或培養(yǎng)基產(chǎn)生了顏色或沉淀的問題：

1、問：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分鐘滅活后出現(xiàn)了白色少量絮狀沉淀，是不是污染？還能不能再用？血清的生產(chǎn)日期是2006年7月(現(xiàn)在是2007年6月11日)。

答：應該問題不大。你可以取少量血清放入培養(yǎng)皿中，37℃過夜培養(yǎng)看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。

2、問：我用MTT法測細胞的增殖，用DMSO裂解細胞，發(fā)現(xiàn)把DMSO加入到孔中就會形成乳白色(用的含胎牛血清的1640培養(yǎng)基，由于沒有離板子的離心機，所以沒有去除培養(yǎng)基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培養(yǎng)基沒有看到有這種情況。該怎么解決？

答：為什么要用離心機離心呢？難倒你養(yǎng)的是懸浮細胞嗎？如果是貼壁細胞的話直接將MTT倒掉，再加DMSO即可，我們就是這么做的，效果很好！并且測細胞的增殖的話如果不去掉MTT就加DMSO的話誤差應該很大！有時不一定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的時間或以及其他成分有關！

3、問：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解凍后沒有混勻直接分裝，結果使得前面的幾管是清亮的，后面就帶有棕色的，不知有沒有影響？估計有什么影響？前面的成分好還是棕色的成分好啊？

答：肯定有。最好還是重新混合重新分裝，我覺得有效成分會集中在棕顏色部分。

問：(2)為什么會出現(xiàn)棕色呢？

答：血清中的棕色多一些可能是因為紅蛋白的含量高些的緣故吧。問：(3)血清滅活之后可以存放嗎？我的是前天滅活的，但是沒有加到培養(yǎng)基里，而是放在冰箱里，那下次可以直接用嗎？還是再次滅活啊？ 答：當然可以，如果多的話，分裝后最好放在－20℃，下次用時再解凍，也不用再滅活。最好用一管拿一管，少許血清可以放在4℃。分裝時還要注意不要裝得太滿，以免溢出污染。

十四、問：懸浮細胞培養(yǎng)時能否加血清？如果加了會有什么結果？為什么懸浮細胞培養(yǎng)時就不能加血清？

答：血清是細胞培養(yǎng)基中重要的培養(yǎng)成份之一，對細胞生長有廣泛影響。在細胞培養(yǎng)時，我們通常會加入10%的血清。血清的質(zhì)量對細胞培養(yǎng)的成功至關重要。一般說來，牛血清包括以下成分：生長因子(如激素，白細胞介素等)，他們可以促進細胞生長；貼附因子，他們可以促進細胞的貼壁，往往只有細胞貼壁才能增值(懸浮培養(yǎng)的細胞除外)；蛋白質(zhì)(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作為營養(yǎng)物質(zhì)，又可以中止胰酶的作用；還有很多成分不明的物質(zhì)。血清還可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細胞免受機械損傷。因此，無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，血清是必不可少的。除非因?qū)嶒炓鬅o血清培養(yǎng)時，例如：為使細胞同步化時，我們會采用無血清培養(yǎng)的。單純的說懸浮細胞培養(yǎng)不能加血清就沒有太多的道理了。

十五、Gibico的胎牛血清內(nèi)是否含糖？

問：我想做糖誘導細胞凋亡的試驗。細胞培養(yǎng)液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖對我實驗的培養(yǎng)液糖終濃度影響比較大。今天打電話問GIBCO公司的技術顧問，回答我糖濃度少于5μg/ml，因此基本可認為是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我們醫(yī)院檢液科，結果卻是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。難道是檢測人血清的血糖濃度的方法不能用于檢查牛血清嗎？(另起茶水驗尿事件？)檢驗科沒有給我回答。答：應該是不含糖的。請參照gibco的網(wǎng)站：http://www.tmdps.cn/content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五頁我做了個記號。直接點擊鏈接就可以看到它的說明書頁面。我想我們肯定要以公司的說明書為準。至于為什么檢驗科測起來有誤差，我想可能是樣本不一樣，需要用標志品矯正有關。具體需要檢驗科的戰(zhàn)友解釋了。

十六、關于中和消化液需要的血清量。

問：用胰蛋白酶消化細胞后，需要用血清中和。具體這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是多少？

答：做了很久的試驗，真的沒有想過胰酶和血清的對應關系。不過細想下來，這個應該也沒有固定的比值。血清的品種都是不同的，成分必然有差異，如何能確定其與胰酶的比值關系？我們消化細胞的時候，如果是傳代，細胞變形后，吸出胰酶直接加入適量的hanks液或者全培，這個量看自己的喜好和吹打細胞方便而定。一般都可以中止消化的。不會存在繼續(xù)消化的事情。如果是從組織上消化細胞做原代培養(yǎng)，我一般都使用全培進行中止，而且加的很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例應該是足夠的。當然全培是2，一般我養(yǎng)細胞的時候，會用國產(chǎn)的比較便宜的血清配制全培，專門用于中止消化，這樣有幾個好處：一是中止消化的效果應該好于hanks液吧，再是也有利于維持細胞活性。而且這部分液體會被離心去掉，血清便宜，離心掉了不會心疼。而養(yǎng)細胞的時候用好血清。個人觀點，僅供參考。

十七、血清中的懸浮物問題。

1、問：發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細胞瓶中背景有許多的小黑點，培養(yǎng)液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以為是膠原蟲。本打算換液，換液前特意看了下前些天配的培養(yǎng)液，肉眼發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有懸浮的顆粒狀物質(zhì)(不多)，于是放在鏡下觀察，新鮮培養(yǎng)液中有一些懸浮的小顆粒，不多。(培養(yǎng)液是R1640+20%牛血清+1%雙抗)于是又將分裝在4℃保存的小牛血清拿出觀察，肉眼可見5、6個白色小小球狀的物質(zhì)，在血清瓶稍靠下的部位懸浮。鏡下觀察，也有少量的不知什么物質(zhì)的東西漂浮。小牛血清是Hyclone新西蘭的，標簽上寫已經(jīng)經(jīng)過2μm濾膜過濾處理。根據(jù)上述培養(yǎng)液的情況，是否說明培養(yǎng)液已被污染？如果是正常的血清是不是在鏡下不應該看到雜物，哪怕是極少量的？根據(jù)上述血清的描述，是不是說明血清也存在問題，還能用嗎？補充：細胞培養(yǎng)以來生長狀態(tài)就不好。買血清的時候廠家說明不用滅活，所以未滅活。

答：(1)血清應該-20℃保存，解凍血清時，請按照的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。(2)血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白在血清解凍后，也會存在于血清中，亦可造成沉淀物。(3)若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清，再放回冷凍，若存放于4℃時，請勿超過一個月，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。

(4)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(5)排出了血清的原因，在考慮實驗用品和無菌操作的問題。

(6)細菌病毒、衣原體、黑膠蟲污染也很常見，如果細胞死的太多，影響較大建議更換培養(yǎng)液。

2、問：今天在配培養(yǎng)液時，發(fā)現(xiàn)血清里面有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮，不渾濁。不知道是什么，問了實驗室的學長，說仍然可以用，但還是不放心，沒有用血清。求助園子的各位達人，這可能是血清出了什么問題？我的血清用了一個月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培養(yǎng)液配置時Votex不夠，當時是清亮的，但過一段時間會析出來；(2)真菌污染。

十八、污染和過濾的問題。

1、問：懷疑血清染菌，想用濾膜過濾一下，可否自己用0.22μm濾膜過濾？對血清性質(zhì)有多大影響？有做過的么？

答：可以過濾的，血清當出廠時都是0.22μm或0.1μm過濾除菌。想證明有沒有染菌不用過濾這么麻煩，只要放置于37℃過夜就可以了，如果有微生物污染會變渾濁的，如果還是澄清的就說明沒有問題的。實驗室中血清很難直接過濾，一般要加到培養(yǎng)基中再過濾。我們實驗室制備培養(yǎng)基時，都使用濾膜過濾，一般而言如果制備1-2瓶培養(yǎng)基，一個濾膜及一支30ml注射器可以過濾50ml小牛血清。如果大量制備培養(yǎng)基也可以將血清加到培養(yǎng)基中，使用0.22微米的大濾膜一起過濾。

2、問：我懷疑我用的完全1640培養(yǎng)液被污染了，準備重新過濾消毒，過濾后是否需要補充胎牛血清？如需又如何補充？

答：完全1640培養(yǎng)液被污染了，如果是支原體的話，過濾沒有作用，支原體可以通過濾膜。我們用1640液，都是配液后保留500ml，然后其他的分裝100-200ml，現(xiàn)用現(xiàn)配因為血清比1640要貴，如果你想過濾的話，建議你加原比例血清，因為血清不會很容易通過濾膜。最主要的還是找到可能污染的原因。

3、問：加好了血清雙抗的培養(yǎng)基由于污染了再過濾后還能用嗎？ 答：建議不要用了。在加了雙抗的情況下已經(jīng)污染，那么細菌污染的可能性會較小了。一般的過濾除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、問：我準備把使用的完全1640培養(yǎng)液重新過濾一遍，不知道培養(yǎng)液中的血清成分是否能通過濾膜，過濾后是否還需要補充胎牛血清？如需又如何補充？

答：可以透過，但是隨著液體量的增多會很慢，如果不加壓會比較麻煩，還有最好用低蛋白吸附的，不然損失是比較大的。

十九、更換無血清培養(yǎng)基后細胞大量死亡的問題。

問：我使用Lipofectamine2000轉染成骨細胞，在轉染前要換上無血清的培養(yǎng)基。本來條件模的好好的，轉染效率也可以接受。但是寒假一回來就發(fā)生了怪事：細胞在有血清的培養(yǎng)基中長的好好的，一換無血清的培養(yǎng)基就死亡。大概4個小時就能看到較多的細胞飄起來。但是原來我換無血清培養(yǎng)基，就算放那里10個小時都是沒問題的啊。已經(jīng)換了不同批次的培養(yǎng)基，甚至吸管什么的都換過了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)兩周后的培養(yǎng)液應補加谷氨酰胺，或者重新配液，轉染時應不含抗生素。

(2)確認操作方法和環(huán)境，建議檢查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂質(zhì)體的毒性很大，如果有質(zhì)粒參與對細胞損傷更大，如果Lipofectamine2000在常溫放置過，對細胞更大，假期冰箱是否斷過電。

(4)培養(yǎng)箱的溫度、c02濃度，濕度。

二十、完全培養(yǎng)液的相關定義。

問：“完全培養(yǎng)液一詞”，是指加了血清的培養(yǎng)液嗎？我在做含藥血清的實驗，涉及到血清添加量的問題。所以想弄明白文中所指的“完全培養(yǎng)液”是否是含藥血清。

答：原液是指配置后過濾除菌。不完全培養(yǎng)液是指不含有血清的原液，其他成分已補充。完全培養(yǎng)液是指不完全培養(yǎng)液加入血清后稱完全培養(yǎng)液。二

十一、血清相關知識總結。使用胎牛血清的注意事項：

血清是細胞培養(yǎng)中最重要的元素之一。下面是實驗室里常會遇到的問題，僅供大家參考：

1、保存血清最好的方法： 建議血清應保存在-5℃ 至-2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

2、如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損：

建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室溫下使之全溶。但必須注意的是，溶解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

3、血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理：

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。

若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。

4、何謂熱滅活：

一般是以 56℃，30 分鐘來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活化，而補體所參與的反應有 : 溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。

5、關于胎牛血清的滅活： 有必要做熱滅活嗎？ 實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱處理這一步。如此一來，不但節(jié)省您寶貴的時間，更確保您血清的質(zhì)量！

6、血清相關知識： 如何避免沉淀物的產(chǎn)生？

我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作 :(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-2O℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30 分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

第四篇：HSC-T6細胞培養(yǎng)及鑒定實驗報告

HSC-T6大鼠肝星狀細胞培養(yǎng)及鑒定實驗報告

前言

肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的名稱有多種多樣，如肝貯脂細胞（fat-storing cell，F(xiàn)SC）、脂細胞（1ipocyte）、維生素A貯存細胞（vitamin A-storing cell）、竇周細胞（perisinusoidal cell）、Ito細胞等。HSC位于Disse間隙內(nèi)，緊貼著肝竇內(nèi)皮細胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）和肝細胞。其形態(tài)不規(guī)則，胞體呈圓形或不規(guī)則形，常伸出數(shù)個星狀胞突包繞著肝血竇。此外，HSC還伸出胞突與肝細胞、鄰近的星狀細胞相接觸。HSC胞質(zhì)內(nèi)有1～14個直徑約1.0～2.0μm的富含維生素A和甘油三酯的脂滴，胞漿中有豐富的游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及發(fā)達的高爾基復合體。胞核形態(tài)不規(guī)則，由于脂滴的擠壓，常致細胞核有一個或多個凹陷，核內(nèi)可見1～2個核仁。正常肝臟中HSC的數(shù)目很少，只占肝細胞總體數(shù)目的5%～8%及總體體積的1.4%，但HSC的立體分布和伸展足以覆蓋整個肝竇微循環(huán)。

正常情況下HSC表現(xiàn)為富含Vitamin A脂滴的靜止型，其功能主要有：

（1）代謝和貯存Vitamin A：肝臟儲存有體內(nèi)80%左右的維生素A，對體內(nèi)維生素A的代謝起著重要作用。視黃醛在小腸內(nèi)酯化后被運輸?shù)礁闻K并與特異的視黃醛結合蛋白結合，然后轉運到鄰近的HSC儲存。

（2）儲存脂肪：正常HSC胞質(zhì)內(nèi)的脂滴含有大量的甘油三酯，為肝細胞提供能源。（3）合成和分泌膠原及糖蛋白、蛋白多糖等基質(zhì)成分。目前的研究認為，HSC是正常及纖維化肝臟中細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）的主要合成細胞。正常肝臟中HSC合成的膠原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型為主，其合成量是肝細胞的10倍、內(nèi)皮細胞的20倍以上。HSC還能合成纖維連接蛋白、層連蛋白和粗纖維調(diào)理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸等蛋白多糖。

（4）合成基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase, MMP）及其組織抑制劑（tissue inhibitor of metallo proteinase，TIMP）:正常情況下，HSC能分泌多種膠原酶和基質(zhì)降解蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-

1、MMP-2等以降解各種細胞外基質(zhì)，同時分泌組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1防止膠原過度降解，使肝臟ECM的合成和分解處在一個動態(tài)平衡中。

（5）表達細胞因子及受體：正常情況下，HSC可以分泌肝細胞生長因子（HGF），參與肝細胞再生的調(diào)控。此外，HSC還能表達少量的轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生的生長因子（Platelet derived growth factor，PDGF）和胰島素樣生長因子（IGF）等，同時HSC能表達TGF-β1的II、III型受體和PDGF受體的α亞單位等。

（6）參與肝竇血流調(diào)節(jié)：HSC伸出胞突包繞著肝竇，通過其纖長突起的收縮功能調(diào)節(jié)肝竇內(nèi)微循環(huán)，從而影響著肝臟的血流分布和門靜脈壓力。

一、材料與方法

1.實驗材料

1.1實驗材料

大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自與中國科學院上海細胞所。

1.2主要儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱：上海力康儀器有限公司 Smart Cell HF-90 生物安全柜：上海力康儀器有限公司 HF1200LC 臺式高速冷凍離心機：上海力康儀器有限公司 Neofuge 15R 臺式低速離心機：上海飛鴿儀器有限公司 TGL-16GB 熒光倒置顯微鏡：日本尼康公司 Eclipse TS100-F 顯微鏡：日本尼康公司 E200 病理圖文分析系統(tǒng)（工作站）：上海千屏公司 恒溫水浴鍋：上海精宏儀器廠 DK-80 液氮罐：成都金鳳儀器廠 YDS-50-125-20℃低溫冰箱：合肥美菱公司 DW-HL388 單子分析天平（0.01mg）：德國梅特勒 AB304-S 手動單道移液器：德國Eppendorf公司 Research plus

1.3主要試劑 名稱

PBS磷酸鹽緩沖液粉劑 胎牛血清 DMEM培養(yǎng)基 0.25%胰酶

貨號/批號

PBS0060, Lot#13061706 16000044，Lot#1183723 C11995599BT，Lot#8113238 25200056，Lot#1268598

廠家

福州邁新生物技術開發(fā)有限公司 美國Life technologies公司 美國Life technologies公司 美國Life technologies公司 美國Hyclone公司 美國Santa Cruz公司 青霉素-鏈霉素雙抗（10000U）SC30010，Lot#J130071 小鼠抗a-SMA單克隆抗體

小鼠兩步法免疫組化試劑盒 濃縮型DAB試劑盒 FITC標記山羊抗小鼠二抗 油紅O染色試劑盒 蘇木素染液 油酸 中性樹膠

KIT9902，Lot#1301319902 DAB0031，Lot#1307290031 D027

20120702

福州邁新生物技術開發(fā)有限公司 福州邁新生物技術開發(fā)有限公司 北京中衫金橋有限公司 南京建成生物工程有限公司 福州邁新生物技術開發(fā)有限公司 西安化學試劑廠 中國上海標本模型廠

2.實驗方法

2.1試劑配制及抗體稀釋

10%血清完全培養(yǎng)基：10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培養(yǎng)基中，添加1ml的青-鏈霉素雙抗溶液。

0.2mM的油酸完全培養(yǎng)基：1ml的20mM的油酸加入99ml的完全培養(yǎng)基中。a-SMA抗體工作液：a-SMA一抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。FITC標記的山羊抗小鼠二抗工作液：FITC標記的山羊抗小鼠二抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。

20%DMSO細胞凍存液：2ml的DMSO溶液加入8ml的完全培養(yǎng)基中。

油紅O染液：油紅O儲存液與雙蒸水以3:2的比例混合，并用濾紙進行過濾，使用前2h內(nèi)配制。

2.2 HSC-T6細胞培養(yǎng)基本操作方法

細胞傳代：觀察培養(yǎng)瓶（25cm）中細胞貼壁融合達90%時，即可進行細胞的傳代，操作步驟如下。開啟生物安全柜紫外消毒30min，以75%乙醇擦拭臺面滅菌，并預先準備3個細胞培養(yǎng)瓶（25cm）、15ml離心管、無菌過濾的PBS、0.25%胰酶溶液、完全培養(yǎng)基，取出長滿細胞的培養(yǎng)瓶，倒空瓶中的培養(yǎng)基，加入2ml過濾滅菌的PBS緩沖液反復沖洗2遍，倒空PBS緩沖液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平鋪在細胞層面上，緩緩搖動細胞培養(yǎng)瓶，待細胞70%脫落時加入1ml的完全培養(yǎng)基終止胰酶的消化作用，并用吸頭反復沖洗培養(yǎng)瓶底將未脫落的細胞沖洗下來，轉移液體至15ml的離心管中，1800r/min離心5min，小心吸棄離心管中的液體，并用1ml的完全培養(yǎng)基重懸沉淀的細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞調(diào)整合適的細胞密度接種到培養(yǎng)瓶中,37℃，飽和濕度，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h后持續(xù)觀察細胞貼壁狀態(tài)，待細胞達到50%～70%貼壁融合時倒空瓶中培養(yǎng)基，重新加入5ml的22含0.2mM油酸的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞凍存：消化、離心、重懸步驟同細胞傳代，取1ml的細胞重懸液，加入1ml的20%DMSO的細胞凍存液顛倒混勻，并移至2ml的凍存管中，凍存管中細胞經(jīng)4℃（20min）、-20℃（20min）的程序降溫后，轉移至液氮中凍存。

細胞復蘇：從液氮中取出凍存的細胞，立刻置于37℃水浴中快速晃動凍存管使細胞快速解凍，倒置顯微鏡下觀察細胞密度并接種到培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 HSC-T6細胞a-SMA免疫組化染色

細胞接種于直徑33mm的細胞培養(yǎng)皿中，待細胞達到50%貼壁融合時，進行a-SMA免疫組化實驗，步驟如下：

2.3.1 細胞固定：培養(yǎng)皿中加入1ml 1:1的冷的丙酮和甲醇，置于-20℃進行細胞固定，20min后棄固定液，用PBS反復漂洗3遍，每次5min。2.3.2細胞通透化：

培養(yǎng)皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液，室溫放置20min后棄去通透液，PBS反復漂洗3遍，每次5min。2.3.3封閉

用免疫組化筆在培養(yǎng)皿中劃圈，并在圈中滴加山羊血清50μL 37℃孵育20min，然后取出PBS漂洗3次，每次5min。2.3.4一抗孵育

培養(yǎng)皿中滴加稀釋后的小鼠抗a-SMA單克隆抗體50μL，4℃孵育過夜，經(jīng)過夜孵育后取出用PBS漂洗3次，每次5min。2.3.5二抗孵育

培養(yǎng)皿中滴加Elivision試劑盒中的增強劑1滴（大約50μL），并于室溫孵育20min，PBS漂洗3次，每次3min，然后每張組織切片滴加Elivision試劑盒中的二抗1滴（大約50μL），37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次3min。2.3.6 DAB顯色

培養(yǎng)皿中滴加新鮮配制的DAB溶液50μL，室溫孵育10min，顯微鏡下觀察有細胞中有明顯的棕黃色顆粒狀沉淀時，立刻將組織切片放入自來水中漂洗以終止反應。2.3.7蘇木素復染

蘇木素復染3min，自來水沖洗使培養(yǎng)皿中的細胞核返藍。2.3.8封片

培養(yǎng)皿中滴加甘油，并以蓋玻片封片。2.3.9觀察拍片

在正置光學顯微鏡下觀察HSC-T6細胞胞漿中alpha平滑肌激動蛋白染色，并于40倍、100倍、200倍下拍照。

2.4 HSC-T6細胞a-SMA細胞免疫熒光

細胞接種于直徑33mm的細胞培養(yǎng)皿中，待細胞達到50%貼壁融合時，進行a-SMA細胞免疫熒光實驗，步驟如下：

2.4.1 細胞固定：培養(yǎng)皿中加入1ml 1:1的冷的丙酮和異丙醇，置于-20℃進行細胞固定，20min后棄固定液，用PBS反復漂洗3遍，每次5min。2.4.2細胞通透化：

培養(yǎng)皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液，室溫放置20min后棄去通透液，PBS反復漂洗3遍，每次5min。2.4.3封閉

用免疫組化筆在培養(yǎng)皿中劃圈，并在圈中滴加山羊血清50μL 37℃孵育20min，然后取出PBS漂洗3次，每次5min。2.4.4一抗孵育

培養(yǎng)皿中滴加稀釋后的小鼠抗a-SMA單克隆抗體50μL，4℃孵育過夜，經(jīng)過夜孵育后取出用PBS漂洗3次，每次5min。2.4.5二抗孵育

培養(yǎng)皿中滴加50μL稀釋后的FITC標記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min。2.4.6觀察拍片

設置熒光倒置顯微鏡激發(fā)波長為488nm，觀察細胞alpha-平滑肌肌動蛋白熒光顯色，并在100倍、200倍、400倍視野下拍照。

2.5 HSC-T6細胞油紅O染色

細胞接種于直徑33mm的細胞培養(yǎng)皿中，并以含0.2mM油酸的完全培養(yǎng)基進行干預，使

細胞富集脂肪滴，細胞待細胞達到50%貼壁融合時，進行油紅O染色實驗，步驟如下： 2.5.1 細胞固定：培養(yǎng)皿中加入4%多聚甲醛溶液，室溫固定30min，棄固定液，用PBS反復漂洗3遍，每次5min。2.5.2油紅O染色：

培養(yǎng)皿中加入1ml新鮮配制的油紅O染液，室溫放置10min后棄去染液，PBS反復漂洗3遍，每次5min。2.5.3蘇木素復染

培養(yǎng)皿中加入1ml蘇木素染液室溫染色30s，棄去蘇木素染液，以雙蒸水漂洗3遍，每次5min，加入1ml的自來水反藍。2.5.4封片

培養(yǎng)皿中滴加一滴甘油并以蓋玻片封片。2.5.5觀察拍片

正置光學顯微鏡下觀察肝星狀細胞胞漿中紅色脂肪滴染色，并在100倍、200倍、400倍視野下拍照。

2.6 HSC-T6細胞Vitamin A脂滴熒光觀察

設置熒光倒置顯微鏡激發(fā)波長為328nm，觀察培養(yǎng)的HSC-T6細胞胞漿中Vitamin A脂滴熒光。

二、結果與分析

1.HSC-T6細胞培養(yǎng)傳代的形態(tài)學特征基本情況

HSC-T6細胞株培養(yǎng)5-8代時能觀察到細胞較大，呈多邊形、多核，且胞漿富含脂滴及Vitamin A形態(tài)（見圖1），8代以后繼續(xù)培養(yǎng)HSC-T6細胞表現(xiàn)為肌成纖維樣細胞的形態(tài)學特征，即HSC-T6貼壁后即開始伸展，胞體增大呈不規(guī)則的多邊形，并伸出許多偽足與其他HSC-T6細胞相連形成片狀（見圖2）。HSC-T6細胞大量增殖，細胞密度變大后，細胞形態(tài)變小，略呈梭形的多邊形，且有偽足與相鄰細胞相連，在培養(yǎng)表面均勻的分布(見圖3)。

A

B

C

D

圖1 5-8代HSC-T6細胞形態(tài)特征

A、B：熒光倒置顯微鏡下，HSC-T6形態(tài)，100×； B、C：熒光倒置顯微鏡下，HSC-T6形態(tài)，200×

（箭頭所標示處為多核的HSC-T6細胞）

A

B

C

D

圖2 8代后HSC-T6細胞形態(tài)特征

A、B：熒光倒置顯微鏡下，HSC-T6形態(tài)，100×； B、C：熒光倒置顯微鏡下，HSC-T6形態(tài)，200×

（箭頭所標示處為多核的HSC-T6細胞）

A

B

C

D

圖3 HSC-T6細胞密度加大時形態(tài)特征

A、B：熒光倒置顯微鏡下，HSC-T6形態(tài)，100×； B、C：熒光倒置顯微鏡下，HSC-T6形態(tài)，200×

2.HSC-T6細胞鑒定

2.1 HSC-T6細胞脂肪滴油紅O染色

含0.2mM的油酸的完全培養(yǎng)基使HSC-T6細胞富集脂滴，并用油紅O染液染色，光學正置顯微鏡下觀察胞核呈藍色，胞漿中有點狀紅色，為脂滴著色（見圖4）。

圖4 HSC-T6細胞脂滴的油紅O染色 400×

2.2 HSC-T6細胞Vitamin A脂滴紫外激發(fā)的自發(fā)熒光

HSC-T6細胞中的脂滴在328nm紫外波長的激發(fā)光下發(fā)出極易淬滅的藍綠色熒光（見圖5）。

圖5 HSC-T6細胞Vitamin A脂滴328nm紫外激發(fā)熒光 200× A、B：暗場Vitamin A脂滴熒光； C、D疊加場Vitamin A脂滴熒光

2.3 HSC-T6細胞a-SMA免疫組化

HSC-T6細胞株為激活的肝星狀細胞，細胞爬片顯示HSC-T6細胞胞漿均可見棕黃色顆粒狀沉淀，alpha-平滑肌肌動蛋白免疫組化染色為陽性。

A B C D 圖6 HSC-T6細胞a-sma免疫組化染色（A：100×； B、C、D：400×）

2.4 HSC-T6細胞a-SMA免疫熒光

HSC-T6細胞株為激活的肝星狀細胞，a-SMA免疫熒光顯示HSC-T6細胞胞漿均可見FITC的激發(fā)的綠色熒光，alpha-平滑肌肌動蛋白免疫熒光為陽性。

A1 A2 B1 B2 C1 C2

D1

圖6 HSC-T6細胞a-sma免疫組化染色

D2（A1、B1、C1：熒光倒置顯微鏡下明場觀察 200×；A2、B2、C2：熒光倒置顯微鏡下490nm激發(fā)，熒光觀察200×；D1熒光倒置顯微鏡下明場觀察 400×；C2：熒光倒置顯微鏡下490nm激發(fā)，熒光觀察400×）

第五篇：實驗總結-細胞培養(yǎng)方法

一、培養(yǎng)細胞常用配置

培養(yǎng)基的配置：基礎培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml 凍存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超凈工作臺常規(guī)配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精燈1盞，液器1臺，斜架1臺，酒精噴壺1個，酒精棉球缸1個，污缸1個，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200μl、10μl），培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，凍存管 所需試劑：培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

實驗前準備：所需的各項高壓后的耗材及污物缸放于超凈工作臺內(nèi)，用酒精噴壺噴灑實驗臺面，并關閉工作臺打開紫外燈照射30min后開始實驗操作。培養(yǎng)基及胰酶恢復常溫后使用，可37℃水浴5-10min

二、細胞復蘇 步驟：

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。超凈臺內(nèi)準備一支15ml離心管備用。

3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液融化至黃豆粒大小后迅速取出。

5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。6.取出2個培養(yǎng)皿并做好標記（復蘇日期等），提前加入5-10ml培養(yǎng)液；離心結束后用1ml培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞后分別加入培養(yǎng)皿內(nèi)。

7.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

注意事項：

1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進口產(chǎn)品。

3.離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。

4.離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。

5.凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液

6.復蘇細胞分裝的問題：復蘇1管細胞一般可分裝到2-3只培養(yǎng)皿中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。

7.加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵毎麤]有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度

8.原理：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

三、培養(yǎng)液的更換

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸 5．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取5-10ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次后蓋上。6.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代。

四、細胞傳代

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液，胰酶，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。

4.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內(nèi)。

5.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min（消化時間根據(jù)細胞不同時間不同），對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。（若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。

7.取1或2個新的培養(yǎng)皿，然后將細胞培養(yǎng)基均勻的分到2或3個培養(yǎng)瓶內(nèi)（注意原來傳代時使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進行1傳2或1傳3的培養(yǎng)。8.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基皿內(nèi)吸取5-10ml培養(yǎng)基懸空移入每個培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次蓋上，在皿蓋上做好實驗標記。

9.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

10.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。注意整個培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。

每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代或保株。

五、細胞株的保存

原理：細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細胞內(nèi)部空間結構紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內(nèi)結構成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內(nèi)容物丟失。如果細胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構型發(fā)生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內(nèi)水分，減少細胞內(nèi)冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少胞內(nèi)形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。

實驗步驟：

選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。加入凍存管中，再加入1ml配置好的凍存液后放入梯度降溫盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液，胰酶，二甲基亞砜DMSO，胎牛血清（解凍），梯度降溫盒恢復常溫，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。

4.將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。

5.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內(nèi)。6.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min（消化時間根據(jù)細胞不同時間不同），對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。（若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。

7.將懸浮細胞吸入15ml離心管內(nèi)，加入4ml培養(yǎng)基離心1000r/min，5min 8.預先配制凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定數(shù)量備用 9.棄去培養(yǎng)基，用凍存液進行重懸混勻后，將1ml含有細胞的凍存液移入凍存管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。

10.將培養(yǎng)基，胰酶瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

8.將凍存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長期保存。或直接放入梯度降溫盒內(nèi)，放入-80℃冰箱內(nèi)過夜后最后存放于液氮罐內(nèi)。（梯度降溫盒內(nèi)為甲醇，使用5次需要更換，每次使用需做好標記，使用前需恢復常溫）

六、細胞轉染

RNA干擾（RNA interference, RNAi）: ? 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。基因沉默，主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常錄;

? PTGS是啟動了細胞質(zhì)內(nèi)靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導致TGS和PTGS。

? 由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，（長度超過三十的dsRNA會引起干擾素毒性）所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。

? 病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應。

作用機制

1)其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。

4)siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

5)RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內(nèi)。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應基因沉寂。所以正常機體內(nèi)各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。

脂質(zhì)體轉染原理：

1.脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時形成的脂質(zhì)雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質(zhì)體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內(nèi)吞作用，因而可用作外源物質(zhì)進入細胞的載體 2.陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內(nèi)，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放，并進入細胞質(zhì)中，再進一步進入核內(nèi)轉錄、表達

DNA轉染步驟

1.轉染前一天接種細胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉染時細胞達到90-95%每孔。

2.轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。

4.B液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5.B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6.將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7.孵箱37℃培養(yǎng)48h（轉染時間待定）。8.第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。9.同時設立細胞對照組，空白轉染組。

siRNA轉染步驟

1)轉染前一天接種細胞于6孔板（40x104），2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉染時細胞達到50-60%每孔。

2)轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。（siRNA按照說明書稀釋）4)B液：脂質(zhì)體（RNAimax）使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5)B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6)將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7)孵箱37℃培養(yǎng)48h（轉染時間待定）。8)第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。9)同時設立細胞對照組，空白轉染組。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上進行轉染實驗

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀釋液，取附贈的DEPC水至管內(nèi)，打開離心管前先離心，將附在管壁上的凍干粉離心下來 2)溶解時滴加適量的DEPC水后蓋上管蓋，震蕩溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分別標記GAPDH，NC，NV-FAM，三個片段名稱，從管內(nèi)吸取20ul的稀釋液分裝后

4)將稀釋液至于-80度冰箱保存。

? 轉染前一天，在6孔板上接種40x104AGS cell，再取一個35mm培養(yǎng)皿接種40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生長培養(yǎng)基。使細胞在轉染的時候有50-60%的融合率

? 從細胞中除去生長培養(yǎng)基

? 每個孔中加入1.5ml新鮮不含血清的培養(yǎng)基，并準備如下混合物 1)A液：(取7個EP管，分別標記空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三個片段)。在250ul的opti-mem終加入100pmol siRNA（稀釋好的siRNA濃度為20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均勻

2)B液：（取一個EP管標記RNAiMAX），RNAiMAX 使用前搖勻，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀釋RNAiMAX混勻后并在室溫下溫育5min 3)混合A液和B液，混勻B液后吸取256ul至A液中室溫下溫育20min ? 將混合物混勻后加入到含AGS的6孔板與35mm培養(yǎng)皿中，每孔終體積為2ml，則加入混合液500ul，并輕搖混勻 ? 在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時 ? 更換含血清的培養(yǎng)基并培養(yǎng)細胞24-48小時 24-48小時后收細胞跑WB，看沉默效果