第一篇：環境水體中腸的道感染菌群與幾種典型致病菌的QPCR檢測及相關性分析

環境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的QPCR檢

測及相關性分析

第 卷 第 期 生 態 科 學 :.年 月

張愛寧,劉麗,史艷丹,劉永軍.環境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的 檢測及相關性分析.生態科學，:.?， ,.., , :.環境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的 檢測及相關 性分析

張愛寧,劉 麗,史艷丹,劉永軍

西安建筑科技大學環境與市政工程學院,教育部西北水資源生態與環境重點實驗室,西安

【摘要】利用定量 方法,對環境水體中的腸道感染菌群及幾種致病菌進行 個月的連續檢測。結果表明:在污染

嚴重的水體中,埃希氏大腸菌 是水中腸道感染菌群的主體,其強度接近于用通用引物檢測出的腸道感染菌群強度。

當腸道感染菌群拷貝數超過 時,沙門氏菌 和志賀氏痢疾桿菌 也持續被 檢出,可以認為是水體病原污染的標志之一:在輕度污染和清潔水體中,當腸道感染菌群拷貝數低于時,通

過通用引物檢測到的腸道感染菌群主要是上述 種病原細菌以外的細菌,且 種病原細菌的出現頻度和強度與腸道感染菌群之 間沒有明顯的相關性。

關鍵詞:地表水;腸道感染菌群;病原細菌;定量;相關性:./......中圖分類號:.文獻標識碼: 文章編號: ?.?.，.,‘ :.,.,..。~..,‘ 一,..: ，,收稿日期:?.收稿, ? 接受

基金項目:國家自然科學基金項目 ,陜西省教育廳項目 ,陜西省重點實驗室項目作者簡介:張愛寧 ?,女,學士,工程師,研究方向為污染環境的分析與評價.?通訊作者,劉永軍 一 ,博士,教授,研究方向:環境生物技術與應用.: 期 張愛寧,等:環境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的 檢測及相關性分析引言 下游: ’..’;痢疾桿菌

上游: 由于水環境污染而引起的病原體感染仍是當今 一

世界上危害范圍最廣的環境問題,全世界每年由于腸 ’,下游: ’..’;道感染引起痢疾的病例多達 億人次,死亡人數多 傷寒沙門氏菌【’上游: ’.達萬人,成為全球疾病之首【。由此,水域性病.’,下游: ’..’:大腸桿菌 ,上游: 原菌的常規監測,對于公共健康來說是非常重要的。

據統計,在中國發生的腸道傳染病主要有 種, ’..’,下游: ’..’。包括甲類傳染病中的霍亂,乙類傳染病中的傷寒、細 菌性痢疾、阿米巴痢疾和甲、戊型病毒性肝炎,丙類

傳染病中的除霍亂、痢疾、傷寒、副傷寒以外的感染.品處理 性腹瀉病,年平均發病率為每 萬人有.例, % 標準菌株:本研究所用的沙門氏菌

以上的腸道傳染病是細菌性痢疾。其次是甲肝和傷寒,標準菌株購自美國菌種保藏中心,痢疾

霍亂一直處于散發流行狀態。近年來,其它感染性腹 桿菌 和大腸桿菌 購白 瀉病發病率有上升趨勢【】。然而這些病原細菌潛在的 陜西省微生物研究所,細菌培養用 肉湯培養基致病風險,沒有列入常規水質評價指標之內。水中 蛋白胨, , 酵母膏 在。下

對于水體中病原菌的檢測主要基于選擇性培養 培養后,離心.收集菌體。和標準的生物化學方法,但這些方法存在一系列的缺 細菌的提取:菌株培養液.或

陷【。人們開始研究分子生物學方法的可行性,以求 地表水樣用滅菌離心管離心., 縮短檢測和報告時間【。其中之一就是定量聚合酶鏈 后,棄去上清液:沉淀物加入 的裂解緩沖液

式反應 方法研究【,用這一方法可使從測樣.~ ,.,.乙酸鈉, 到出結果的時間縮短到幾個小時圳。本研究利用包括., ,反復吹打使之重懸,加入

痢疾桿菌,沙門氏菌 ?.混勻,.離心后

將上清轉入一只新管中,加入等體積的酚:氯仿:異戊醇 和大腸桿菌 類腸道病原細菌在

內的腸道感染細菌通用引物【 同時利用上述幾種病: : 體積比 ,混勻,離心., 原細菌的特異性引物,通過定量方法檢測西安市;取上清后,加入.倍體積的異丙醇后離心;不同地表水體中多種病原菌的分布情況,為進一步對 沉淀用 的%乙醇洗滌,離心棄乙醇。

水體進行全面的病原性污染風險評價奠定基礎。標準曲線:用 固體培養基經平板計數, 測得培養液中細菌的濃度。用上述苯酚.氯仿法提取 材料和方法細菌總,將總 倍梯度稀釋,以此為 標準曲線制作的摸板,每個稀釋梯度平行 組,.取樣地點 利用梯度稀釋的細菌提取物 檢測的 值

選取西安市區潔凈水體 水源水、輕度污染水 與相應的細菌細胞密度對數值的離散與回歸分析繪

制標準曲線。腸道感染菌群 檢測的標準曲線 體 景觀水 和嚴重污染水體 納污水體和污水處理

廠出水 為研究對象。從 年 月~ 年 月,每 以大腸桿菌檢測的標準曲線代替。

個月的、、日分別從黑河、北湖、興慶湖、’產 河和北石橋污水處理廠采集水樣。采樣位點為水深.分析

/ 處。同時記錄每個被調查水樣的其它輔助資料, 在 體系中加入熒光試劑 ,利

包括、溫度、濁度、游人密度以及船只等。用熒光信號實時檢 進程。熒光試劑盒購于天根

生化科技公司北京。反應體系總體積,.引物合成

內含× / ,上下游引物 腸道感染菌群通用引物】,上游: 分別為.? ~,模板。將反應管放入定 / 一 ’, 量儀 美國.。擴增條件:生 態 科 學 卷

表 地表水體中腸道感染細菌群與幾種病原細菌的檢出強度 ℃預變性, ℃, ℃, ℃ , 感染菌群的強度,平均檢出值為 ~.℃,共 個循環。每隔.讀數一次,閾值設 ~;痢疾桿菌和沙門氏菌的平均檢出值

分 別 為和~ 定為最初的 ~ 個循環熒光值標準偏差的 倍。

用于水體病原細菌檢測的樣品平行 組,環境水一。種致病菌的總強度接近于腸道感染

樣中目標細菌強度的確定是通過已知細胞模板拷貝 菌群強度。說明污染嚴重的水體中,病原細菌主要為

數 的病原細菌 標準曲線推斷出的相 上述 種病原細菌。對數量。檢出頻率以陽性率來表示,是陽性樣本數與

總樣本數的比值。.地表水體中不同病原細菌檢出強度分布

圖 所示為不同地表水體中腸道感染菌群與結果與討論種病原細菌檢出強度的分布情況。在污染嚴重的水體 中 圖 , ,腸道感染菌群的檢出強度在

.地表水體中腸道感染菌群及病原細菌強度檢測 之間,大腸桿菌從各種水體檢出的強

度最高,分布在之間,沙門

對西安市潔凈水體、輕度污染水體和嚴重污染水

體共 個地表水體中腸道感染菌群和 種病原細菌利 氏菌和痢疾桿菌也持續被檢出,檢出強度分布在

用 法進行連續 個月的檢測,檢測結果如表 之間, 種病原菌的總強度接 所示,每個水體的檢測樣本數分別為。近于用通用引物檢測出的腸道感染菌群強度。所以, 在潔凈水體中 黑河,腸道感染菌群的平均檢 對于污染嚴重的水體,大腸菌是水中腸道感染菌群的

測值為 ~,大腸桿菌,痢疾桿菌和 主體,沙門氏菌和痢疾桿菌強度盡管遠低于大腸菌。

沙門氏菌的平均檢測值分別為.、在輕度污染水體 圖 ,和清潔水體中 圖

。和.~。該水體為西,腸道感染菌群的檢出強度在 ~ 安市飲用水源水,受到良好的保護,水體沒有受到病 之間, 種病原細菌的強度都分布在

原體污染。左右,且不能連續檢出, 種病原

在輕度污染水體中 北湖、興慶湖 ,腸道感染 菌的總強度遠低于用通用引物檢測出的腸道感染菌 菌群的平均檢出值為.~.× ~, 群強度。說明在輕度污染水體和清潔水體中,當總的

大腸桿菌、痢疾桿菌和沙門氏菌的平均檢出值分別為 腸道感染菌群濃度低于 時,通過

.~ ~、.~ 和 ~ 通用引物檢測到的腸道感染菌群主要是大腸桿菌、沙 門氏菌、痢疾桿菌以外的細菌。~。種致病菌的總和遠遠低于腸道感染 菌群,說明在潔凈水體和輕度污染水體中,通過通用.腸道感染茵群與不同病原細菌檢測結果的離散 引物檢出的細菌絕大多數為 種致病菌以外的細菌。在嚴重污染水體中 污水廠出水、、產河 ,腸道 與回歸分析 圖 表示所有地表水樣申用 方法所測得 感 染 菌 群 的平均 檢 出值 為..×’ 的腸道感染菌群強度與不同病原細菌強度離散圖形.~,埃希氏大腸菌濃度很高,接近于腸道辟掣區

期 張愛寧,等:環境水體中腸道感染菌群與幾種典型致病菌的 檢測及相關性分析

一 ∞

∞ 鯽 ∞ 舯 ∞ 一邑 崔 崔 ‘罰 ’吾 昌..●

拷貝數對數值 拷貝數對數值 董 邑 皇薈 蠱 毫

●大腸桿菌.●沙門氏菌

●志賀氏菌注:.污水廠出水,.產河, 北湖,.興慶湖, 一黑河.:●病原菌群 ,? ， ?..拷貝數對數值不同地表水體中病原微生物檢出濃度分.能完全一一對應七,目前還不能達到代替傳統病原 及回歸分析結果。

污染指標的地步,如果要用 方法對地表水體 在對 個地表水體監測的 周內,腸道感染菌

群與大腸桿菌檢測值的秩相關系數為.,與 進行健康風險評價,還需要進一步收集 檢測

沙門氏菌的秩相關系數為.,與痢疾桿菌的秩 結果以及相關的衛生學數據。

相關系數為.。腸道感染菌群與大腸桿菌之間

有較強的相關性,說明西安市地表水體中的腸道感染 結論 細菌主要是大腸菌群。這與傳統方法用大腸菌群來指

示水體病原菌污染狀況相一致。但是由于所建立的腸 大腸桿菌從各種水體檢出的頻度最高,在

道感染菌群通用引物 方法除了能檢測水體中 水體受到一定污染后即持續檢出。污染嚴重的水體, 存在的大腸菌群以外,還可以同時檢測到水體中痢疾 大腸桿菌是腸道感染菌群的主體,其強度接近于腸道

桿菌和沙門氏菌,和傳統方法相比,更能反映水體的 感染菌群檢出強度,二者的秩相關系數為.;真實污染狀況。加之 方法具有高敏感性以及在地表水體中,當腸道感染菌群 檢

檢測時間短 在 之內能夠完成檢測 等優勢, 出值超過 時,沙門氏菌和痢疾桿

所以在地表水體病原體污染監測中, 方法檢測 菌也持續被檢出,雖然其強度遠低于大腸桿菌,但這 結果極有可能與傳統的大腸菌群檢測結果一道,成為 些病原菌存在的可能性變得非常高,可以認為是水體 水體病原污染風險評價的指標。但由于兩種方法并不 病原污染的標志之一: