第一篇：生物制品學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告----三價(jià)副豬嗜血桿菌油乳劑滅活疫苗的制備及檢驗(yàn)（小編推薦）

三價(jià)副豬嗜血桿菌油乳劑滅活疫苗的制備及檢驗(yàn)

副豬嗜血桿菌是豬格拉澤氏病(Glasser’s disease)的病原菌，屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是一種多形態(tài)、非溶血性、不運(yùn)動(dòng)、NAD 依賴(lài)型、革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求比較苛刻，培養(yǎng)時(shí)必須供給含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鮮血液才能生長(zhǎng)。此菌有多種血清型，其中強(qiáng)毒力的有1、5、10、12、13、14型，常可致死動(dòng)物；中等毒力的有2、4、8、15型，多表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎，不致死；低毒力的有3、6、7、9、11型，常無(wú)臨床表現(xiàn)和病變。在中國(guó)，4型和5型是主要分離株，而澳大利亞和丹麥的主要血清型為5型和13型。在研究2、4、5、12、13和14型間的交叉保護(hù)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了血清12型制備的單菌和血清2、12型制備的二價(jià)苗外，其他型都能對(duì)同源菌株產(chǎn)生保護(hù)；用血清4型制備的菌苗，可以保護(hù)血清5型的攻擊；用血清4、5型制備的二價(jià)菌苗，可以抵抗血清13、14型的攻擊（仔豬病變的嚴(yán)重性和病死率明顯降低）。三價(jià)滅活疫苗主要用于預(yù)防豬副嗜血桿菌病。該苗針對(duì)性強(qiáng)，安全可靠，能有效降低發(fā)病率和死亡率。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗制作的流程。2 掌握副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗制作的操作技術(shù)。

二、乳化的原理

乳化劑能降低分散物的表面張力，在微滴（粒）表面形成薄膜或雙片層，以阻止微滴（粒）的相互凝結(jié)。

三、材料，試劑，培養(yǎng)基

（1）器材：不銹鋼鍋（或瓷鍋）、電爐、乳化器、量筒、玻璃棒、離心機(jī)、吸管等。

（2）試劑：、甲醛（滅活劑）、白油（抗原油相）、Span-80（油相乳化劑）、Tween-80（抗原水相乳化劑）、硬脂酸鋁（穩(wěn)定劑）、4、5、13型分離菌株（抗原）。（3）培養(yǎng)基的制備：

1、配制0.2%的V因子

準(zhǔn)確稱(chēng)0.2g的NAD（輔酶I）加入100mlddH2O，用0.22um的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

2、制備TSA培養(yǎng)基

稱(chēng)16gTSA加入348ml雙蒸水，121°C高壓滅菌20min，當(dāng)溫度到50°C左右時(shí)（放入50°C水浴鍋）加入0.2%的V因子，使V因子濃度達(dá)100ug/ml，然后加入32ml的滅活新生牛血清

100ml----4g TSA-----5ml V因子-------8ml血清

3、TSB培養(yǎng)基

稱(chēng)3gTSB于87 ml雙蒸水中溶解。121°C高壓滅菌15min，冷卻至50°C左右，加入已配制的0.2%的V因子5ml，再加入滅活的新生小牛血清8ml，使血清濃度達(dá)0.8% 100ml-------3g TSB----5ml V因子----8ml血清

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（1）菌株菌液制備及培養(yǎng)繁殖 將副豬嗜血桿菌三株菌種按分別劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)18-24h，挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16 h后，再將此菌液按l%的比例加入新配制的TSB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h后，按平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。培養(yǎng)24h后，收集菌液，用分光光度計(jì)法測(cè)定細(xì)菌總菌含量。經(jīng)檢驗(yàn)合格者作為制苗抗原。（2）制苗抗原的濃縮和細(xì)菌的滅活

將純檢合格的制苗抗原培養(yǎng)物以超濾器濃縮，作為制苗用濃縮抗原。然后按TSB液體培養(yǎng)基總體積加入終濃度為0.2%的甲醛（先10倍稀釋?zhuān)浞謸u勻后，37°C溫箱中滅活14h或分別在4、8、12、16、20h和24h取滅活菌液于TSA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，置普通恒溫箱中37℃培養(yǎng)48h，觀察細(xì)菌滅活效果。37°C滅活14h可達(dá)到較好的效果。（3）制苗用水相的制備

根據(jù)培養(yǎng)24h后的分光光度計(jì)法或麥?zhǔn)媳葷峁軠y(cè)定的總菌數(shù)結(jié)果，參照培養(yǎng)12-16h的平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果。取滅活的三種血清型按照一定的比例（等量）混合抗原液96份，然后過(guò)濾, 除去沉渣及雜物, 加入4份即終濃度為4%滅菌的Tween-80(96∶4)充分混勻, 邊加邊攪拌，使其充分融化（可加熱助溶，溫度低于37℃）, 作為制苗用水相，水相要搖勻，讓吐溫-80充分溶解。（4）制苗用油相的制備

取10號(hào)白油93份（先加一部分，后補(bǔ)足）置于不銹鋼鍋中緩慢加熱后，加入硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌，直到透明為止，再緩慢加入6份Span-80(司本-80)，充分混勻，121℃高壓蒸汽滅菌3Omin，冷卻至室溫備用。或者按比例將工業(yè)白油94份置于不銹鋼鍋（或瓷鍋）中加熱后，緩慢加入6份 Span-80，混合后按總量加入2%硬脂酸鋁，溶化后，繼續(xù)升溫至160℃，維持10min，待冷卻后即可制苗。切勿用少量的白油與硬脂酸鋁混合后邊煮邊攪拌，那樣很容易燒焦冒煙。（5）疫苗的制備（乳化工藝）

按油相與水相2：1（v/v）混合乳化。即1份水相配2份油相在高速攪拌器中攪拌。先將處理好的油相2份置于高速攪拌器中，低速攪動(dòng)油相，同時(shí)緩慢加入水相l(xiāng)份(油∶水= 2∶1)，乳化時(shí)膠體磨轉(zhuǎn)速由慢變快，最后以8，000一10，OO0r/mln高速乳化2一5min，使水油充分乳化。乳劑混勻，分裝于滅菌疫苗瓶中。在乳化過(guò)程中亦可根據(jù)乳劑黏稠度適當(dāng)調(diào)整油、水相比。制成乳白色的W/O型油乳佐劑疫苗。

（6）油乳劑檢驗(yàn)：油乳劑檢驗(yàn)項(xiàng)目包括乳劑類(lèi)型檢查、黏度測(cè)定、穩(wěn)定性測(cè)定、粒度大小及分布檢測(cè)等，生產(chǎn)實(shí)際中以黏度測(cè)定與穩(wěn)定性測(cè)定為主。在每批苗分裝過(guò)程的前、中、后各抽樣2瓶供物理性狀檢驗(yàn)及安全檢驗(yàn)。無(wú)菌檢驗(yàn)： 將制備好的滅活油乳苗分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基中 , 于37 ℃溫箱中培養(yǎng)10 d, 觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。均應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)方合格。物理性狀檢驗(yàn) : 觀察疫苗顏色：眼觀應(yīng)為均勻一致的乳白色黏稠乳劑。穩(wěn)定性檢測(cè) ：1）離心加速法，將疫苗置于 10m l 離心管內(nèi), 3 000 r/min離心15min水油不分層，可保存1年以上不破乳。2）加速老化法，疫苗于37℃儲(chǔ)存10-30d不破乳，說(shuō)明其穩(wěn)定性良好。黏度檢驗(yàn)：最簡(jiǎn)易的方法是在室溫條件下用吸管吸取1ml乳劑, 然后垂直放出, 記錄放出0.4ml所需時(shí)間。垂直放出0.4ml所需要的時(shí)間作為黏度單位，以0.4ml 2-6s為合格，說(shuō)明黏度適中, 適合于注射應(yīng)用，不得多余10-15s。

5劑型檢測(cè)：將疫苗數(shù)滴滴于冷水表面, 觀察油滴擴(kuò)散情況，即觀察疫苗滴于水中是否呈油滴狀且不分散。滴于水中油滴呈規(guī)則的圓形, 未見(jiàn)擴(kuò)散現(xiàn)象, 說(shuō)明疫苗為油包水劑型。

6安全檢驗(yàn)：對(duì)最小使用日齡靶動(dòng)物一次單劑量接種的安全性滅活疫苗接種途徑只有一種，就是肌肉注射。每批三價(jià)滅活苗隨機(jī)取樣3瓶,等量混合后接種兔2只,每只肌肉注射2mL；接種14日齡哺乳仔豬，每組5頭，每頭豬接種2ml，另設(shè)5頭豬作為陰性對(duì)照，于耳后肌肉注射5-10 mL, 觀察仔豬的臨床表現(xiàn)，并每日測(cè)定體溫，持續(xù)2周。

五、小結(jié)

（1）副豬嗜血桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求比較苛刻，培養(yǎng)時(shí)必須供給含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鮮血液才能生長(zhǎng)。且具有非常多的血清型，純化非常困難。故對(duì)菌的純化及滅活和疫苗的安全性試驗(yàn)是生產(chǎn)滅活苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于副豬嗜血桿菌，在菌液制備的過(guò)程中容易生長(zhǎng)雜菌，我們純化了很多次菌，液體仍然很渾濁，使得實(shí)驗(yàn)進(jìn)展延后。（2）注意事項(xiàng)： 細(xì)菌滅活過(guò)程中，甲醛濃度越高，堿性溶液中的抗原性損失就越大。故甲醛要注意適量 2 制備油相時(shí)，要使Span-80和硬脂酸鋁充分溶解。3 制備水相時(shí)，抗原與Tween-80充分混勻。乳化時(shí)，油相必須冷卻后方可與水相混和乳化，以防油溫過(guò)高使抗原性降低。5 注意先加入油相后再加入水相，充分?jǐn)嚢琛? 疫苗在4℃、暗處保存，切勿冰凍。7 一定要做好安全檢驗(yàn)