第一篇：mtt數據處理

實驗一急性毒性試驗（改進寇氏法）

一、目的與要求

1、學習急性毒性試驗的方法，掌握LD50的測定方法。

2、觀察馬錢子的毒性反應。

二、實驗原理

急性毒性試驗是指受試動物在一次大劑量給藥后所產生的毒性反應和死亡情況。藥物毒性的大小，常用動物的致死量來表示，因為動物生與死的生理指標較其他指標明顯、客觀、容易掌握。致死量的測定也較準確。在測定致死量的同時，還應仔細觀察動物是否出現聳毛、倦臥、耳殼蒼白或充血、突眼、步履蹣跚、肌肉癱瘓、呼吸困難、昏迷、驚厥、大小便失禁等不良反應。

致死量的測定常以半數致死量為標準。半數致死量是指能夠引起試驗動物一半死亡的劑量，媽藥物致死量對數值，用符號LD50表示。由于LD50的測定較簡便、可靠，而且穩定，現已成為標志動物急性中毒程度的重要常數。LD50測定的方法有多種，如Bliss法、改進寇氏法、簡化機率單位法、累積插值法、機率單位-加權直線加歸法等等。以上方法雖各有特點，但都有共同的要求：

（1）動物：均選用體重17～22克健康小鼠（同次試驗體重相差不得超過4克），或選用體重120～150克（同次試驗體重相差不得超過10克）健康大鼠作實驗動物。性別相同或雌雄各半。

（2）給藥途徑：要求采用兩種給藥途徑，其中必須有一種與臨床所采用的相同。溶于水的藥物沿須測定靜脈注射的LD50。值得提出的是，臨床上雖然不用腹腔注射，但動物實驗因腹腔注射給藥方便，吸收迅速，頗為常用。若供試藥物在腹腔內不引起強烈刺激或局部變化（如纖維性病變等），那么嚙齒類動物腹腔注射的LD50，參數很接近于靜脈給藥的LD50。口服制劑無法通過注射給藥途徑時，可只用胃腸給藥。

(3)試驗周期和觀察指標：給藥后至少觀察7天。觀察期間應逐日記錄動物的毒性反應情況和死亡動物的分布。

（4）正式試驗前，均須先用少量動物進行預試試驗，大致測出受試藥物引起0%和100%死亡率的致死量范圍，然后安排正式試驗。正式試驗組數不得少于三個劑量組，一般選用4～5個劑量組，每組動物數為10～20只。

（5）報告LD50時需注明實驗動物的種屬及品系、性別、體重范圍、給藥途徑及每個劑量組動物數等，還需注明受試藥物的配制方法、給藥劑量、各組劑量間的比值（一般以0.65～0.85為宜）、給藥容積、觀察時間及計算方法。還須標出LD50的95%可信限。

三、實驗材料和試劑

動物：小鼠 藥品：馬錢子水煎液

器材：注射器、灌胃針頭、鼠籠

四、操作方法

1、預試實驗：預試實驗目的是為了找出引起動物0%（Dn）和100%（Dm）死亡的劑量，以便安排正式實驗。預試實驗一般采用少量動物（6～9只小鼠）進行，將動物隨機分為3組，組間劑量比值一般以1：0.5或1：0.7為宜。灌服或腹腔注射量以0.2ml/10g體重為度。預試實驗應進行到找出Dn和Dm后方可安排正式實驗。

2、正式實驗：在預試實驗測得Dn和Dm的劑量范圍內設4～6個劑量組，最多10組。最理想的結果是使LD50的上下各有2～3組。組數愈少，準確性愈差。各劑量組的動物要求相等，至少10只動物（分組時應注意分層隨機均勻化的原則）。本實驗要求最大反應率為100%，最小反應率為0%，或至少反應率接近100%或0%。組間劑量比值（1：K），常用1：0.8或1：0.75。如實驗中出現相鄰劑量有重復的100%和0%反應率時，應將靠邊的組棄去不計，使大劑量組只有一個100%的反應率，小劑量組也只有一個0%的反應率。

分組完畢和各組劑量算出后，分組灌服或注射不同劑量的受試藥物。為能得到理想的結果，實驗最好從中間劑量開始，以便從最初幾個劑量組動物接受藥物后的反應來判斷兩端劑量是否合適，便于調整劑量和組數。為了提高實驗的精確度和節省藥物，受試藥物可按“低比稀釋法”配置。即使每只動物的用藥體積相等（0.2ml/10g），而溶質不等。給藥后逐日觀察并記錄中毒反應、死亡率和死亡情況。

五、實驗結果記錄與計算

馬錢子水煎液對小鼠死亡率的影響

組別

劑量g/kg(d)2 3 4

Logd(X)

死亡數 死亡率（P）

P2

P-P2

公式1:（logLD50）X50=Xm-i(ΣP-0.5)

則LD50=log-1 X50

公式2：Sx50=i*(p?p2)/(n?1)公式3：LD50的95%可信限=lg-1（X50±1.96S X50）LD50的平均可信限= LD50±（LD50高限-LD50低限）/2 Xm：最大劑量組劑量的對數值

i：相鄰兩組劑量（d）對數值之差，或相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對數。P：各組動物的死亡率，用小數表示。ΣP：為各組動物死亡率的總和。n：每組動物數。Sx50：logLD50的標準誤。

第二篇：MTT法總結

MTT法總結

一： 所用儀器和試劑

1.所用細胞

EA.hy926人臍靜脈內皮細胞融合細胞

2.材料

96孔板、離心管、1.5ml滅菌EP管

3.主要試劑

DMEM基礎培養基（3g碳酸氫鈉、100mg氨芐青霉素、50mg鏈霉素、DMEM高糖培養基）、重組人VEGF、MTT粉末、DMSO、胎牛血清、25%胰蛋白酶

4.主要儀器

超凈操作臺、細胞計數儀多功能酶標儀CO2培養箱平板離心機倒置顯微鏡微量振蕩器。

二、實驗過程

1、MTT溶液配制；

250mg MTT溶于50 mL PBS中，待完全溶解后（本次實驗為促進溶解，將試劑瓶放入超聲清洗儀中超聲，溶解效果良好，有無負面作用有待驗證），過濾除菌，分裝，-20℃貯存；（MTT應避光貯存，用錫箔紙包著）

2、實驗步驟

1、制備單細胞懸液

將細胞放在37℃、5%C02培養箱中培養，鏡下觀察，發現細胞均呈鐮刀狀，分布較密，棄去瓶中原有的培養基，用PBS清洗兩次，棄去，加入2ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37℃培養箱中消化3min，轉入刻度離心管中1000rpm離心3min，再加入2ml新鮮完全培養基（DMEM+10%FBS）重懸后，用細胞計數器計數6.81×105cells/ml。

2、鋪板

將重懸后的細胞稀釋至4×10cells/ml，96孔板中每孔加100ul同時設置空白對照組（即不含細胞，只加培養基），邊緣孔用PBS補齊，于37℃、5%CO2培養箱中培養24h后加待測物。

3、加不同濃度的VEGF溶液 4

用DMEM+1%FBS培養基將自制的30ug/ml VEGF分別稀釋到：5000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml。

用槍吸出96孔板中原有培養基，加入適量的PBS清洗一次，加入不同濃度的VEGF溶液，每孔100ul，每個濃度設置三個平行孔，同時設置空白對照和陽性對照（含細胞，及已知有效的avastin溶液）、陰性對照（含細胞，但不含所制抗體藥物），放入培養箱中培養。

培養72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液12ul，在培養箱中繼續培養4h。然后于平板離心機中離心，之后吸出孔中溶液，加入150ul /孔DMSO溶液，再于微量振蕩器上振蕩10min，之后在酶標儀上檢測570nm和630nm處的孔板的吸光度值，則每個孔的吸光度值即為A570減去A630。

第三篇：MTT方法總結詳解

MTT方法總結

1.MTT原理

MTT比色法是一種檢測細胞存活和增殖的方法，所用的顯色劑是一種能接受氫原子的化合物MTT，原理是，活細胞內線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍紫色的結晶formazan(甲瓚）后者的產量與活細胞數成正相關。formazan可用DMSO、無水乙醇或酸化異丙醇等溶解，在酶標儀上以波長490nm和570nm處進行比色。所檢測的OD值的大小可反應細胞代謝活性的強弱。2.優點

（1）有靈敏度高，重復性好，（2）操作簡便、經濟、快速、易自動化的優點，（3）而且沒有3H—TdR摻入試驗放射性污染，（4）還可以減少如細胞計數法、軟瓊脂克隆形成試驗中的人為性因素 缺點：影響因素多，重復性較差。MTT有毒性致突變性，操作時應注意防護 3.步驟

(1)接種細胞：用0.25％胰蛋白酶消化單層培養細胞，用含 10％胎牛血清的RPMI1604培養液配成單個細胞懸液，以每 孔5×103~1×104個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200ul。

(2)培養細胞；將培養板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及濕度條件下，培養4h以上（至細胞狀態穩定）．加藥物干預24~48h(培養時間取決于實驗目的和要其求)(3)呈色：加MTT時一定要避光，測24h細胞增殖率時，于加藥干預20h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20ul，37℃，繼續孵育4h；測48h細胞增值率時，于加藥干預44h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL，繼續孵育4h。

終止培養后，對懸浮生長的細胞，需離心,(2000rpm．15min)；對貼壁細胞最好也離心（2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150uL DMSO振蕩10min，使結晶物充分溶解。

(4)比色：選擇490nm和570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上調定各孔收值，記錄結果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生線。4.注意事項

(1)選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，接種前需計數，根據查閱文獻決定不同細胞的接種個數，一般以每 孔5×103~1×104個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200uL。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，對每一種細胞都其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。

（2）實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。

(2)避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于l0％胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

（3）加藥時，每種藥5個濃度（每個濃度相差10倍），一個濃度設4個副孔。（4）設空白對照和正常對照，每塊板設空白復孔,內加培養液，不含細胞與藥物，各做4~6個復孔，取平均值，主要目的是為了減少培養基含有的酚紅對比色的影響。每種細胞設4~6個正常對照孔,含細胞不含藥物，每孔加樣100μL/孔。（對照，不含細胞，含藥物和培養基？）

（5）細胞鋪板時，要充分分散，而且要加幾個孔就重新吹散一次，否則，細胞濃度就會不同。（我曾經試驗過，用后加的孔作試驗組與用先加的孔作對照組，結果有些差異，也許是我的熟練程度不行！）另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

（6）培養后，細胞的培養既要吸干凈，否則，殘留的蛋白會對MTT有一定的吸附作用，影響就過準確性。我使用的是翻轉法，將培養液倒掉，這樣做很簡便，又很快潔。重復性也不錯。

（7）測吸光度值要有一定的時間范圍，在測定是你會發現，隨著時間的推移沒空都會變深些，（這可能是由于MTT在空氣中氧化的結果，我記不清了，你再找找書，另外，具體時間我也沒有記清）

（8）陽性藥物的選擇，要選擇經典的，有說服力的，又對你的細胞有很好的殺傷了力的藥物。別認為簡單，我就曾經因為陽性藥物選擇錯誤而重新做試驗，慘

痛的教訓呀！

（9）如果用96孔板，周圍一圈孔的值由于液體蒸發和溫度梯度原因，會誤差很大，盡量不用。

（10）溶解甲臢時，如果是懸浮細胞或細胞貼壁不牢，盡量用酸性SDS溶解，不要棄去培養液，以免細胞損失。這還要求最后加入藥物和MTT時，血清濃度低于10%。

6.如何計算IC50

用抑制率作為Y，加藥濃度的對數作為X，進行線形回歸，根據得到的方程求抑制率是50%時的加藥濃度，也就是IC50。

IC50的計算和LD50的計算很相似，可以用SPSS計算。以劑量為橫坐標，以抑制率為縱坐標（Y）。進行回歸分析也可以，即用抑制率作為Y，加藥濃度的對數作為X，進行線形回歸，根據得到的方程求抑制率是50%時的加藥濃度，也就是IC50。但是這有要求：抑制率最好在30-70％之間才能采用回歸，因為這一段幾乎是直線關系。

我的經驗是，因為藥物的作用通常是一條S型曲線，在藥物濃度很高或很低的時候就接近一個平臺，所以加藥劑量的選取非常重要，在不知道藥物大概的IC50的時候，可以各個劑量之間10倍稀釋，這樣加藥的范圍就比較寬，可以摸索到合適的劑量，如果已經有參考的劑量，也可以等倍稀釋。如果你得到的抑制率能夠分布在50%上下各有幾個點，那么以線形回歸法得到的結果一般是比較準確的。

MTT法本身并不是非常準確，一般要重復3次，得到的結果差不多才可信。

MTT大匯總 實驗前應明確的問題

1.選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2.藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。

3.時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。

4.培養時間。200ul的培養液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h換液的。

5.MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。

6.理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。

7.實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8.避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

實驗步驟 貼壁細胞：

1.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況

3.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。

5.終止培養，小心吸去孔內培養液。

6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7.同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）

懸浮細胞：

1）收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 l?g/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100?(儲存液100 1640）。

2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）

4）離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。

5）同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。

MTT的配制

MTT一般最好現用現配，過濾后4oC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。

MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用用PBS

溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。PBS配方: Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 調ph 7.4 定容1L

關于細胞的接種(鋪板)

細胞過了30代以后就不要用了,因為狀態不好了;培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。

接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種, 因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線性關系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養會不夠，最后導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。

細胞密度要根據不同細胞的特點來定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105,貼壁細胞可為103-104.其它的聲音：

1.首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。

2.MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20％的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。

3.我做的是腫瘤細胞的MTT實驗,這種細胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的,結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關系.后來調整濃度,用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實驗,結果發現做的結果比較好點的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細胞少,藥物作用的梯度還是有,只是沒有很好的線性關系.還有根據細胞生長速度以及藥物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養時間是48小時還是72小時.注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

首先說說我的一點經驗：

1.吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面最好裝3~4ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。。

2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益

3.吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。

4.吹打次數100左右，就可以吹打均勻了（有人認為加細胞前吹打30－50次基本就差不多均勻了。加細胞的時候每接種2孔反復吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）

5.向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快，否則你會發現細胞在加入的瞬間會由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會產生接觸抑制，影響細胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復3下移動，目的是使得細胞能分散的均勻些。（鋪板技術是MTT實驗的關鍵，也是基礎，一定要練好。曾經有同學用漩渦振蕩器混勻細胞，最后細胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細胞。

加入MTT

個人認為MTT最關鍵的是你的細胞數目和你加入真正起作用的的MTT的適當比例，具體細胞數目和真正起作用的的MTT之間的關系確實不好確定，我認為MTT多加一些比少加好一些

MTT的量各家報道不同，一般是過量的，所以10ul即夠了。如果不使用96孔板，培養基超過100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養基混勻，不過這個應該關系不大。

如加入MTT后都有個別孔立即變為藍黑色，則污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的

因為血清中白蛋白對大部分的藥物都有結合效應，所以可以單獨將藥物和MTT加在一起，看會不會起反應。如果不起反應，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。

如何清除上清 百家爭鳴：

1.加DMSO前要把液體吸掉，但培養液里的紫色結晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法,懸浮細胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板,清除上清時注意不要把下面的結晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄150-160ul即可)。

2.我每次將MTT加入后，再孵育四個小時，然后用離心機離心1000G,5min。但是用槍小心地吸上清，還是會將一小部分藍色結晶吸出。所以還是建議翻轉倒扣的方法吧！

3.另外，可以直接將板翻轉倒扣（墊幾層濾紙）2－3次，比用―吸‖的辦法更不容易使細胞脫離出來。可以輕拍，或者傾斜一點幫助吸液，發現紫色結晶幾乎沒有肉眼可見的掉脫，但前提是你本身細胞貼壁要比較牢，半貼壁生長的細胞容易脫離。假如藥物作用時間長的話，陰性對照組可能由于細胞過多而使加入ＭＴＴ后形成的結晶漂起來，這樣就不能直接倒掉上清。

4.做MTT時，這一步驟一定要小心，不要采用倒的方式。因為貼壁不牢的細胞會被倒掉，從而影響OD值。懸浮細胞，不要翻板，離心后也不要翻板，這個方法害死人。

5.加完MTT反應3－4h后，從培養箱取出96孔板的動作要輕柔，避免振蕩結晶,使其滑落.你可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸，有的細胞可以用排槍一起吸，有的則要耐心的一個個用槍頭吸，槍尖的力度和方向要保證每個孔都一致。不要讓槍頭接觸到孔底，且一旦傾斜孔板后就不要反復傾斜放平，這樣也會使結晶脫落。

6.用醫用的注射器加上針頭吸取液體的，吸取時要把板子斜放，沿著壁吸取就好了！這次MTT我用1ml針頭仔細吸培養液,覺得比其它方法可靠,一般不會吸走紫色結晶.避免清除上清而改進的方法

由于一般可離心96孔板的離心機不好找。既使是貼壁細胞做MTT時，用DMSO溶解得到結果也不好，不是得不到預期結果就是可重復性差。

解決方法1:用以下文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質活性的改良MTT方法，中國醫藥工業雜志，1993，24（10）：455-457

具體方法：

配三聯溶解液：10%SDS，5%異丁醇，0.012mol/LHCL，蒸餾水溶解。

三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配成100ml溶液

操作：在培養板上加一定密度的細胞懸液，90ul／孔；如需給藥，則再于同時(懸浮細胞)或4h后(貼壁細胞)加入不同濃度的藥物10ul／孔，均設三復孔。另外，每塊板上另沒一個調零孔(只加培養液，不含細胞和藥物)。培養2d后，加入MTT溶液20ul／孔，繼續培養4h，然后加入上述三聯液100ul／孔，于37度放置過夜后，用酶標儀測各孔A570值。優點：簡化操作，提高了可靠性。

解決方法2：日本同仁有一種新試劑CCK-8試劑，CCK-8試劑可用于簡便而準

確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST–8[其化學名稱為：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲 染料（Formazan dye）。生成的甲 物的數量與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。CCK-8試劑中已預先配入了進行細胞增殖和毒性分析所需的成分，無需再用緩沖液或培養基進行稀釋；同時，CCK-8試劑無需任何放射性同位素和有機溶劑。因此，無需特別的技巧，就可使每一位使用者準確、快速地得到重現性好的實驗結果。★優 點

1、簡 便 只需一步即可得到結果

2、省 時 毋需預制，即開即用

3、安 全 毋需放射性同位素和有機溶劑

4、快 速 省去了溶解除沉操作

5、靈敏度高 靈敏度高于MTT

6、重現性好 步驟少；無損失；結果準確

就是比較貴，如果經費充足，用這個是不錯的。

★進行細胞增殖分析的使用方法:

1、接種細胞懸液100μl于96孔板內，預先置于37℃，5% CO 2飽和濕度培養箱內培養。

2、在每個孔內加入10μl的CCK-8試劑。

3、把培養板放在培養箱內培養1-4小時*。

4、在450nm波長處測定吸光度，參比波長為600nm或600nm以上。

解決方法3：使用MTS

解決方法4：

加入DMSO

在同一批實驗中最好不要更換DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈，沒有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀會很難溶解.二培養液的顏色在檢測時也能被測到,會對最后結果造成影響。但前提是不能把細胞也一起吸掉，因為這樣帶來的誤差要遠遠大于培養液沒棄干凈帶來的誤差,所以要在保證細胞不被吸掉的前提下，盡量把培養液吸掉。如果培養液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養液，這樣在檢測時可以盡量去除培養液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul.1.加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩5－10min, 時間控制盡量嚴格一點,放置時間長了會影響結果,值會偏大,且結果不可信.2.加入DMSO后可用排槍反復抽吸助溶，溶解后盡快檢測。如果實驗孔不多，建議用此法，因其比振蕩溶解效果好。

3.或放入37度放孵箱15分鐘溶解結晶。

振蕩是為了讓甲臜溶解，這樣才能更好的測量吸光度，振蕩96孔板有專的振蕩器，目的:扎破氣泡.有氣泡存在時,由于其對光的反射與折射作用(酶標儀的原理是通過測定特定波長透過樣品的吸光度推測樣品內特定物質的濃度),會導致結果偏移.OD值的測定

至于測定波長的選擇是因顯色溶液而異的，對于DMSO，溶解后呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT試劑盒用的不是DMSO，它的測定波長是570。(就如ELISA實驗選用OPD作底物測定波長是492，選用TMB顯色液則用450);而對于SDS和酸化異丙醇，則選用570nm，并且建議以655nm作為參考波長。

DMSO溶后10分鐘內測，越放顏色越深，而ＳＤＳ做為溶解液測吸收光值，其值可在三天內保持不變.細胞密度偏大測出的吸光度也會偏大，細胞密度小吸光度也會偏小；另外跟細胞狀態也有關系，細胞狀態不好的話，吸光度值也會低的；細胞數目少，或者是培養的時間短，OD值也會偏低。如果各個孔的孔間差異性特別明顯的話說明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是細菌污染。

復孔直接的OD值差別一般應在0.1－0.15，差別太大考慮：1.接種細胞數不均勻，或是接種太多，應保證每孔一致，一般是每孔1000－10000個。可以細胞細胞計數后，加入細胞懸液，再補培養基到預定體積，并輕輕吹打幾次，使細胞均勻分布，這樣比直接加入預定體積的細胞懸液要好，接種時應加含血清培養基。2.貼壁時間：18－24h，如果不夠，未懸浮的細胞會被吸掉。

一般為了實驗的準確，每個濃度可以設5－6個復孔，可以最后統計時，可以除去一個最高值和一個最低值，或者除去其中數據離譜的值，這些離譜數字的出現與細胞是否污染，細胞是否在培養期間死去，是否培養液蒸發過多，加MTT液是否準確，在37℃，5％二氧化碳培養箱中孵育時間是否一定（1－4小時）等有密切的關系，當然測定OD值的儀器工作狀態是否正常也非常重要！(一般開機預熱20min)。

MTT方法的吸收度在0.2～0.8之間誤差較小。這和分析化學中的ｌａｍｂｅｒｔ-beer定律有關，對朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經常出現標準曲線不呈直線的情況，特別是當吸光物質濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現象（吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引起較大的誤差。在吸光光度分析中，儀器測量不準確也是誤差的主要來源。任何光度計都有一定的測量誤差。這些誤差可能來源于光源不穩定，實驗條件偶然變動，讀數不準確等。

在光度計中，透射比的標尺刻度均勻。吸光度標尺刻度不均勻。對于同一儀器，讀數的波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數波動則不再為定值。吸光度越大，讀數波動所引起的吸光度誤差也越大透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較大，即光度測量最好選吸光度讀數在刻度尺的中間而不落兩端。待測溶液的透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，才能保證測量的相對誤差較小。當A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差最小。

其它的聲音：

1.最好用570nm波長的濾光片，因為MTT在這個波長的吸光度是峰值，換句話說靈敏度高。用其它波長的也有，一般是490nm，但我的經驗靈敏度降低一半。

2.我們用的BIO-TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果復孔之間值相差太大就要考慮是否是實驗過程中的誤差.我曾經看到園子的有些帖子報道說OD值大概在0.2-1.2范圍內與活細胞數有較好的線性關系，但OD值在0.3-0.9范圍內可能更佳，若你的OD值不在這個范圍內則你實驗的細胞數可能不太合適，應調整你的細胞數。

邊緣效應

96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不養細胞，否則這四行的數據會偏高或偏低,96孔板在培養箱中，由于濕度不夠，而培養箱由于具有一定的溫度，由于溫度梯度使得邊緣的孔水分蒸發較快，導致培養基中各種成分濃度變化增大，導致細胞狀態不同。對于這種現象，要保證培養箱中的濕度，減少開關培養箱的次數和時間。解決方法:將孔板周圍的一圈孔全部不用，影響非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培養液，只要能防止蒸發就可以.關于如何計算IC50

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量

I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應率之和 Pm:最大陽性反應率 Pn:最小陽性反應率

舉個例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025

(2)Bliss法:自己查閱書籍

(3)IC50計算軟件，見下面附件

（4）自己用EXCEL做趨勢線來求IC50，關于LD50的方法與此相似！（5）在線求IC50或EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

結果統計學處理 所有數值以x±s表示，應用SPSS軟件進行方差分析，p<0.05時為相差顯著，p<0.01時為相差非常顯著。可以以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生線，專門公式求IC50。或計算抑制率。細胞死亡率%=OD對照組-OD實驗組/OD對照組 excel表中可以做兩兩比較的T-test,這個你可以參考一下；你的數據應該用多個樣本均數的T-test，方差分析也可。用的軟件是SPSS或者SAS。

孔板的重復利用:

培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。一般貼壁生長的細胞用重復利用的培養板效果不是很好，因為培養板表層在生產時涂有一層促進細胞貼壁的物質，在清洗后多半會失去。懸浮或是半懸浮生長的細胞還可以。建議不要用太多次，即使是進口的板子使用次數也不要超過3次,底值最好在測得值的1/3一下。

強烈建議培養板不要重復使用:

1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于細胞的生長，會出現帖壁不好，細胞生長緩慢等情況.2、這樣的板子消毒滅菌很不徹底，如果有萬一,則因小失大.3、重復用的板子洗不干凈在培養過程中易出現雜質.重復利用時

做法1：

洗凈后用2％NaoH浸泡4小時，再用1％稀鹽酸浸泡4小時，沖洗15遍，蒸餾水沖洗3遍，烘干，UV照射過夜(紫外2小時以上消毒即可)

做法2: 泡酸2－4小時，老師讓我們別超過4小時，（普通的玻璃儀器是過夜）。撈出，沖洗干凈，烘干后，UV 照射過夜。估計跟其他收集在一起，鈷60照射消毒.做法3: 1.做完ＭＴＴ后用大水流盡量將板沖凈，然后用洗衣粉水泡幾個小時（小心最好讓洗衣粉先化開）。2.用自來水沖凈洗衣粉水，倒扣晾干.3.重鉻酸鉀加濃硫酸配成的酸液中浸泡過夜泡洗液(六小時以上即可)后自來水洗凈（20次左右）每個孔都要處理4.用去離子水沖洗3遍，雙蒸水沖洗3遍，烤干5.超凈臺中紫外線照射2個小時左右，就可以用了，不可以高壓。

做法4:

1、測完值的96孔板甩掉孔內培養液，放入超聲中超10-30分鐘，晾干(或烘干)備用。

此步驟可最大程度的洗去污垢及細胞。

2、每孔加入50-100ul的胰酶(0.05%)，我一般加60ul，加完胰酶后水平振蕩96孔板以使胰酶均勻覆蓋于細胞表面，室溫下放置至細胞被消化脫落為止。假如你想消化快一點的話可將96孔板放到37度培養箱內(胰酶在37度時的活力最大)。對于頑固貼附在壁上的細胞，此步驟最為有效。

3、甩掉胰酶，自來水下沖洗，晾干(或烘干)備用。

如果不烘干就泡酸，那么96孔板殘留的水分將稀釋酸液，長期以往泡酸的效果下降。

4、將晾干的96孔板泡酸(中強酸)過夜，撈起后自來水下沖洗10遍；雙蒸水沖洗3遍。三蒸水沖洗3遍。烘干備用。泡酸時特別注意時間不要太長了，否則板子變黃，影響最后的OD值的測定。

5、做實驗前，96孔板至少在紫外燈下照射30分鐘，但不能長期照射。紫外線長期照射可使板變黃，我的兩塊板放在超靜臺上忘了拿出來，一直照了兩個星期，等我從超靜臺上取出板已經變成黃色。

注：

1、在實驗中若你測得某一個孔的數值偏高，雖然有很多因素會導致數值偏高，但是如果是板底的污點引起的話你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再測值。你會發現孔高的值又會到正常水平。因為咱們做實驗時手不可避免的接觸96孔板板底留下痕跡，這些痕跡就會使吸光度升高。2、96孔板洗的次數多了，板底自然留下劃痕，這就會導致讀數的不均而影響實驗結果。你不妨在做實驗前測一次96孔板的值(此值為初值)，實驗測得的為后值。后值減去初值就接近實驗的真實值。

第四篇：【整理總結】關于MTT實驗總結--心血啊!

【整理總結】關于MTT實驗總結－－心血啊！

MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT噻唑藍為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環開裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數目。也可以用DMSO來溶解。

MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。

MTT

步驟如下：

1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔

1000－10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul.2:培養細胞：同一般培養條件，培養3－5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。

3：呈色：培養3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS

配)20ul.繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。

4：比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

注意事項：

（1）選擇適當得細胞接種濃度。

（2）避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。

（3）設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。

MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！

舉個例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃

度為0.1，抑制率為0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計算公式： Pm=0.95 Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025

有一個公式可供參考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量 I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應率之和 Pm:最大陽性反應率 Pn:最小陽性反應率

抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值

公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率例：

用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養基,多少MTT和DMSO合適?根據書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定

一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。

一般要低于IC50，避免非調亡性殺傷的細胞太多，造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細胞系空白處理的調亡率應低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細胞周期的亞G0峰比較明顯.呵呵，寫得不錯，頂一個

謝謝樓主辛苦了～

寫的好，謝謝

樓主說細胞放進９６孔板后培養３～５天，這樣好象不行，細胞經過那么長時間的生長早就長滿了，會產生細胞之間的生長抑制，我覺的細胞再生長一天就可以了，還有利用酶標儀測定５７０nm處的光密度OD值也可以．

多謝樓主的辛勤勞動。

我是新手想做MTT和IC50。請同行多指點

感謝，共同努力！

不錯,正好用的上.呵呵，貌似不是你的心血？網上到處都是

不錯，很有幫助！

我覺得就算網上到處都是,樓主也是將好的經驗和大家分享,這就是我們園子所倡導的我幫人人,人人幫我啊!還是要感謝樓主工作的!

八錯！

謝謝樓主了

不錯不錯~辛苦啦

謝謝樓主！

致謝！

要學習一下 謝謝LZ

不易！

對于我這種新人來說真是太好了!我長本事后也要這樣！嘿嘿 謝謝摟主！

“MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系”請問摟主你這是針對波長490而言還是對所有的波長而言呢 我的測定值就有1以上的，是不是不對啊

第五篇：MTT簡介及試劑盒說明

產品簡介：

1.MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被廣泛應用于細

胞增殖和細胞毒性的實驗方法。由于細胞活力與細胞數呈正相關，因此常常用來檢測細胞的增殖情況。MTT可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成結晶狀的深紫色產物formazan。在特定溶劑存在的情況下，可以被完全溶解。然后通過酶標儀可以測定570nm波長附近的吸光度。細胞增殖越多越快，則吸光度越高；細胞毒性越大，則吸光度越低。

2.本試劑盒采用了獨特的Formazan溶解液配方，無需去除原有的培養液，可以直接加入Formazan溶解

液溶解formazan。從而避免了由于去除培養液時formazan被部分去除而引起的誤差。

3.本試劑盒背景低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便提高了可靠性。

4.本產品為500 次（5個96孔細胞培養板）操作。

產品內容：

MTT染色液5ml

Formazan溶解液55ml

說明書1份

保存條件：

MTT染色液需-20℃避光保存；Formazan溶解液可以室溫保存。

注意事項：

1.由于使用96孔板進行檢測，如果你的細胞要養48 h或更長，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32個邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個孔的水分。因為細胞培養過程中，邊孔的水分蒸發很快，培養液及里面的藥物會出現濃縮現象，細胞的狀況就復雜了

2.MTT溶劑在低溫情況下會凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

3.MTT一般最好4oC避光保存兩周內有效，保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解，尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。

4.Formazan溶解液結凍或產生沉淀時可以37℃水浴孵育以促進溶解，并且必須在全部溶解并混勻后使用。

5.孵育時，須避光

6.MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌

很敏感。

使用說明：

1.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊

緣孔用無菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板，具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，每孔0-10ul，設3-5個復孔.建議設5個。

3.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4.每孔加入10微升MTT染色液，繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小

心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。

5.每孔加入100微升Formanzan溶解液，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測

儀570nm測定吸光度。如無570nm濾光片，可以使用560-600nm的濾光片。

6.同時設置調零孔（培養基、MTT染色液、Formanzan溶解液），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介

質、培養液、MTT染色液、Formanzan溶解液）

MTT法

什么是MTT法?

又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。MTT法MTT 溶液的配制方法

通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。

MTT法MTT法實驗步驟

貼壁細胞：

1、收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.、5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況

3.、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。

5、終止培養，小心吸去孔內培養液。

6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）

懸浮細胞：

1、收集對數期細胞，調節細胞懸液濃(儲存液100 1640）。?g/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100?度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 l2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）

4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。

5、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。