第一篇：‘黃花梨’2個?CYP707A?基因的克隆和序列分析

龍源期刊網 http://www.tmdps.cn：8004/）獲得同源序列；將同源序列返回到NCBI網站在線blast驗證；而后以梨基因組CDS數據庫得到的2條序列為參照，設計引物。PCR反應體系25 μl（模板1 μl，10 μmol/μl上游引物1 μl，10 μmol/μl下游引物1 μl，10 mmol/L dNTP mixture 1 μl，10×ExTaq Buffer 2.5 μl，5 U/μl EXTaq 0.15 μl，ddH2O 1835 μl），目的基因擴增引物見表1。以?黃花梨?花芽總RNA逆轉錄成的cDNA為模板進行PCR擴增。反應程序：94 ℃預熱5 min；94 ℃變性45 s，48～55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min；共35個循環，最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。凝膠電泳檢測PCR擴增產物（圖1），并切下1 400 bp左右的目的條帶，經膠回收（EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金有限公司，中國北京）純化，連接到PMD18T（Takara，中國大連）上，后轉化到DH5α大腸桿菌感受態細胞中，在AMP培養基培養大腸桿菌，將菌液PCR鑒定的陽性克隆送至英濰捷基貿易有限公司（中國上海）測序。2 結果與分析

2.1 ?黃花梨?CYP707A基因的克隆從?黃花梨?花芽上克隆得到2個CYP707A基因序列，通過DNAMAN比對，發現兩者之間的相似性高達94.27%（圖2），氨基酸相似性94.96%。為此，從梨基因組數據庫找到2個基因的內含子和外顯子基因組序列進行比對，結果顯示其相似性為69.95%，說明這2個CYP707A基因為相似性較高的不同基因。將克隆到的?黃花梨?CYP707A 基因分別定名為PpCYP707A4（Genbank登錄號：KP279630）、PpCYP707A5（Genbank登錄號：KP279631）。

PpCYP707A4的CDS序列全長為1 431 bp，編碼476個氨基酸；其氨基酸序列與蘋果（Malus domestica XP_008346457.1）相似性97%，與碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）

龍源期刊網 http://www.tmdps.cn 相似性90%，與梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性87%，與草莓（Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1）相似性83%，與甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性84%。

安徽農業科學2015年PpCYP707A5的CDS序列全長為1 425 bp，編碼474個氨基酸；其氨基酸序列與蘋果（Malus domestica XP_008382035.1）相似性 97%，與碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）相似性89%，與梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性86%，與草莓（Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1）相似性84%，與甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性85%。

在線blastp分析，2個PpCYP707As基因均具有1個保守結構域，為PLN02196（圖3），屬于P450超基因家族。以PpCYP707A4和PpCYP707A5的氨基酸序列作為參考，從NCBI數據庫上blast其他物種的CYP707A氨基酸序列，構建系統發育樹。僅蘋果blast到2個基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1），其他物種均只blast到1個基因。系統發育樹分析顯示（圖4），薔薇科植物的CYP707A基因聚為一大支，PpCYP707A4與蘋果XP_008346457.1基因，PpCYP707A5與蘋果XP_008382035.1基因單獨聚類。

注：a.?黃花梨?總RNA； b.PpCYP707A4 PCR擴增； c.PpCYP707A5 PCR擴增。

圖1電泳圖譜圖22個PpCYP707As的核苷酸序列比對注：a.PpCYP707A4蛋白的保守結構域； PpCYP707A5蛋白的保守結構域。

圖3蛋白保守結構域圖42個PpCY707As系統進化樹2.2蛋白性質預測采用ExPASy ProtParam、TMpred、SignalP 4.1預測蛋白性質和Prot預測亞細胞定位，結果顯示，PpCYP707A4蛋白的理論分子質量為54.4 kDa，理論等電點為9.01，不穩定系數為48.48，屬于不穩定蛋白，分子式可寫為C2493H3901N645O679S20，原子數7 338，帶負電荷（Asp + Glu）氨基酸50，帶正電荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系數為9239，GRAVY為-0.100，是親水性蛋白；在6～23位點含有一個由內向外的跨膜螺旋結構，8～26位點有一個由外向內的跨膜螺旋結構；不含信號肽，為非分泌蛋白；并定位在內質網，概率為0.820。PpCYP707A5蛋白的理論分子質量為54.1 kDa，理論等電點為9.03，不穩定系數為47.78，屬于不穩定蛋白，分子式可寫為C2481H3874N640O673S21，原子數7 689，帶負電荷（Asp + Glu）氨基酸49，帶正電荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系數為91.96，GRAVY為-0.089，是親水性蛋白。在6～23位點含有一個由內向外的跨膜螺旋結構，8～27位點有一個由外向內的跨膜螺旋結構。與PpCYP707A4蛋白相同，也不含信號肽，為非分泌蛋白；定位在內質網，概率為0.820。

2.3蛋白結構預測采用Npsa-pbil、NetPhos 2.0 Server在線工具預測蛋白質二級結構、磷酸化位點。PpCYP707A4有243個氨基酸殘基形成α-螺旋，32個形成β-螺旋，78個形成延伸鏈和132個形成無規則卷曲；有12個絲氨酸（serine，S）殘基、7個蘇氨酸殘基（threonine，龍源期刊網 http://www.tmdps.cn T），2個酪氨酸（tyrosine，Y）參與磷酸化過程。PpCYP707A5有226個氨基酸殘基形成α-螺旋，27個形成β-螺旋，81個形成延伸鏈和140個形成無規則卷曲；有13個絲氨酸（serine，S）殘基、6個蘇氨酸殘基（threonine，T），3個酪氨酸（tyrosine，Y）參與磷酸化過程。Swiss-model預測蛋白三級結構，結果顯示PpCYP707A4、PpCYP707A5蛋白的QMEAN4值分別為-5.67、-4.79，三級結構存在較大差異（圖5）。

注：a.PpCYP707A4蛋白三級結構； b.PpCYP707A5蛋白三級結構。

圖5預測的2個PpCYP707A蛋白三級結構3 討論

休眠的長短決定落葉果樹的地理分布，是落葉果樹的重要性狀之一[7]。我國梨的種質資源大體分為北方品種群和南方品種群，北方品種群的特點為抗寒力較強、休眠期較長，南方品種群表現出早熟、休眠期短等優勢[8]。?黃花梨?在福建省建寧縣能夠正常開花結果，產量較大，而在緯度較低的福建省上杭縣其萌芽不整齊的現象明顯，休眠期的長短對于?黃花梨?的產量和栽培具有重要的制約作用，休眠影響梨品種的選育和梨產業的發展，研究梨的休眠意義重大。對桃[3]、大櫻桃[9-10]、歐洲甜櫻桃[11]、葡萄[12]、牡丹[13]等的研究表明ABA的含量變化是影響木本植物芽休眠進程的重要因素。從分子水平探討ABA調控梨花芽休眠進程的分子機制，將有利于構建梨休眠的調控網絡，從而有助于梨品種的選育。

該研究從?黃花梨?上分離到ABA分解途徑關鍵酶基因PpCYP707A4和PpCYP707A5，采用生物信息學方法分析其核苷酸序列、氨基酸序列，構建相關系統發育樹并預測蛋白結構。分析結果顯示，PpCYP707A4與PpCYP707A5核苷酸序列和氨基酸序列相似度較高，為94.27%和94.96%，兩者蛋白理化性質相近，符合家族基因的特點。系統進化樹顯示，?黃花梨?的PpCYP707A4和PpCYP707A5與蘋果的2個基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1）分別單獨聚類，而非PpCYP707A4和PpCYP707A5獨自聚類。對蘋果[14]、大豆[15]、劍蘭[16]的研究結果也顯示CYP707A家族基因在系統發育樹并未單獨聚為一類而是分散到幾類中。梨基因組數據發表后，Wu等[17]認為薔薇科的染色體是由祖先7個染色體發展形成的，梨和蘋果基因組之間具有高共線性。該研究克隆的2個基因很可能產生于梨和蘋果的共同祖先，而后遺傳給梨和蘋果。CYP707A是一個多基因家族，它們在不同組織中的轉錄模式不同[2]，以功能交迭的方式參與環境脅迫應答[4，18-19]、休眠解除[20]等不同的生理反應過程，共同調控植物體內源ABA的分解。因而，需進一步研究該基因家族各基因的特性，研究它們的生物學功能，為開展?黃花梨?花芽休眠的研究提供信息，為短低溫梨品種的選育奠定基礎。

參考文獻

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第二篇：散斑殼屬rDNA基因ITS區的PCR、克隆和序列分析開題報告

散斑殼屬rDNA基因ITS區的PCR、克隆和序列分析

一、選題依據

1、論文題目及研究領域

論文題目：散斑殼屬rDNA基因ITS區的PCR、克隆和序列分析。

研究領域：林木病理學。

2、論文研究的理論意義和應用價值

松落針病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑殼屬真菌所引起的一種世界性林木病，該病害對整個林業生態工程建設、產業化發展造成了嚴重影響，該研究主要為林木病害的防治和對散斑殼屬病菌的進一步研究、利用提供理論依據。

3、目前研究的概況和發展趨勢

松落針病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑殼屬真菌所引起的一種世界性林木病害，寄主包括多種松樹，主要危害Pinus、冷杉Abies、云杉Picea、落葉松Larix等屬22個種3個變種和1個栽培變種[1]。該病害從幼樹到大樹均可侵染，在幼樹齡中嚴重發病時，引起松葉提前脫落，引向樹木生長，甚至導致樹木死亡，曹成嚴重的經濟損失，這類病在我國也普遍發生，且歷史悠久，但長期以來該病害只是被當作一般性的也部病害來對待，沒有受到應有的重視，也少有深入細致的研究[2]。但從70年代才有了較系統的研究，目前對該病的研究已有160多年的歷史。它隸屬于子囊菌亞門Ascomycotina ,盤菌綱Discomycetes、星裂盤菌Phacidiales、斑痣盤菌科Rhytismataceae[3]。散斑殼屬是1826年正式建立的，現已成為斑痣盤菌科中的第一大屬，全球共有103余種被報道[4]。該病在Minter(1981)記載松樹上有散斑殼l6個種，其中Lophodermium Seditiosum 引起二、三針松落針病。我國曾記載引起樟子松落針病的病原菌為橙針散斑殼茸Lophodervnium pinas，何秉章(1985)報道了在大興安嶺引起樟子松苗木落針病病原菌為擾亂散斑殼菌I ．seditiosum，其無性階段為Leptostroma rostrupil，同時對該病的癥狀、侵染循環、流行規律進行了研究，篩選出以7j 百菌清可濕性粉劑防治效果最好[5]。至目前為止，其無性階段是否有侵染作用在國內外還沒有一致結論，尚有待進一步研究。1981年，Minter對松樹上的散斑殼(LD D，mim Chev．)進行了較系統的分類研究，共承認16個種。近年Minter＆Sharma(1982)、Cannon＆Minter(1986)分別報道了庫曼散斑殼(L．kumaunicum Minter＆M．P．Sharma)和喜馬拉雅散斑殼(Lhimalayense P．F．Cannon＆Minter)。在我國戴芳瀾(1979)、何秉章等(1985，l986),林英任、唐燕平(1988)、曹支敏等(1990)先后記載國內松樹上有松針散斑殼(L．pinas sri(Schrad．)Chev)、大散斑殼(L．maximum B．Z．He et Yang)、安徽散斑殼(L．anhuiense Y，R．Lin)和L．toolitori s Minter等14個種。我國對散斑殼屬的分類研究始于80年代，陸續發表9個新種11個新記錄，使我國散斑殼屬的種數達到21個。到目前為止．國外共報道18個種。目前對該病的研究已經發展到分子生水平上[4]。

二、論文研究的內容

1、論文重點解決的問題

1.1散斑殼屬真菌的培養及DNA提取

1.2散斑殼屬不同種RDNA基因ITS區PCR擴增片斷的克隆 1.3克隆片斷的DNA序列測定及分析

2、論文擬開展以下四個方面的內容 2.1 散斑殼屬的分類、致病性、生活史

2.2 散斑殼屬不同種RDNA基因ITS區的PCR擴增

2.3 散斑殼屬不同種RDNA基因ITS區的PCR擴增片斷的克隆 2.4 克隆片斷的DNA序列測定及分析

3、論文擬得出的主要結論

獲得出不同種散斑殼屬RDNA基因ITS區的PCR擴增片斷克隆的序列并構建系統發育樹。

三、論文擬采用的研究方法

1、實驗材料及儀器 1.1 實驗菌株

散斑殼屬的不同菌株由四川農業大學都江堰分校資源與環境系微生物實驗室保存。1.2實驗藥品和試劑 1.2.1 常規藥品和化學試劑 液氮、提取液（100mMTris-Hcl、PH9.0，40mMEDTA，PH8.0），緩沖液A(SDS-EB，PH8.0)緩沖液B(8MKOAc，PH4.2)，3M NaAc，10%SDS，TE(10m MTris-Hcl，1mMEDTA，ph8.0)，5×TBE緩沖液（Tris-硼酸，0.5MEDTA，PH8.0）飽和酚（PH8.0）異丙醇70%的乙醇等。1.2.2 培養基

PDA液體培養基：稱馬鈴薯400g，去皮切成小塊，煮沸30分鐘，用紗布過濾，加葡萄糖40g，用蒸餾水定容到2000ml，調PH7.0。

LB液體培基：Trypton(OXOID)1g YeastExtract(OXOID)0.5g NaCl1g，加雙蒸水40ml，調PH值至7.0，定容到100ml。121℃ 高壓蒸汽滅菌20min。1.2.3分子生物學試劑

真菌通用引物、TaqplusDNA SacI HindIII RNAase 酶，IPTG（異丙基硫代—B—D半乳糖）X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D半乳糖苷）DNTP UItraPure質粒DNA小量提取試劑盒 小量膠回收試劑盒 連接試劑盒，氨芐青霉素 DNA分子標準DL2000 瓊脂糖。1.3主要設備儀器

Eppendorf5804R冷凍離心機、Eppendorf Authorized Thermal cycler PCR儀、DYY-12型三恒多用電泳儀、BIO-RAD凝膠成像系統、G-560E渦旋混合儀、H.HS11-2型電熱恒溫水浴鍋、HZQ-F型全溫震蕩培養相、微量移液器等。2實驗方法

2.1散斑殼屬真菌細胞總DNA的提取 2.1.1不同種散斑殼菌的獲得

在超靜工作臺中將PDA斜面上已經培養好的不同種散斑殼的菌絲體刮下，接種于PDA的液體培養基中，在25下培養一周左右，離心收集菌絲體。2.1.2用改良二次沉淀法提取DNA 離心收集菌絲體，用滅菌雙蒸水沖洗2-3次，盡量吸干水分。將菌絲體轉移到冷凍過的研缽里，加液氮2-3次研磨成粉，將菌絲體迅速移入20mL離心管內，加入10mLBufferA(0.2％SDS—EB，pH 8.0)，在渦旋混合器上振蕩混勻，靜止至室溫。將混合液置于65～68℃ 水浴20min，然后在室溫下10000 r／min離15min。取上清液移至另一離心管，加入0.5mLBuferB(8mol／L KOAC，pH4.2)，混勻后冰浴45 min，然后4℃下10000r／min離心20 min。取上清液移至另一離心管，加入等體積的室溫異丙醇，小心顛倒混合均勻。可以看到沉淀出現。在室溫下10000r／min離心2 min。讓其自然干燥后溶于50ulTE中，長期保存于一20℃冰箱中,備用。

2.2散斑殼屬不同種RDNA基因ITS區的PCR擴增 2.2.1 擴增引物

采用真菌通用引物ITS1和ITS4，起序列如下： ITS1（5-3）：TCCGTAGGTGAACCTGCGG（19bp）ITS4（5-3）：TCCTCCGCTTATTGATATGC（20bp）2.2.2 PCR擴增的反應體系：

試劑 加樣量 工作濃度

DNA模板 1.0ul 約500ng DNTP 1.0 ul 20uM ITS1 1.0 ul 0.4uM ITS4 1.0 ul 0.4uM Taqplus酶 0.5 ul 2.5uM 10×baffer 5.0 ul 超純水 38.5 ul 反應總體積 50.0 ul 反應混合物加28ul的礦物油覆蓋。

2.2.3 PCR擴增的反應循環

95℃ 預變性3min 95℃變性1min 55℃退1min 72℃ 延伸1 min 72℃延伸3min 4℃保存（30個循環）2.2.4 PCR產物電泳檢測

PCR反應結束后，盡量吸除礦物油，取5反應液做1.2%瓊脂糖電泳檢測分析。

2.3 散斑殼屬不同種RDNA基因ITS區的PCR擴增片斷的克隆 2.3.1 PCR擴增DNA片斷純化和回收 采用上海華舜生物工程有限公司的膠回收試劑盒，按使用說明對PCR擴增產物進行純化。具體步驟如下: 1)樣品用瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外投射儀上用刀片小心的割下含目的DNA的瓊脂糖塊，使它盡可能小，放入1.5ML離心管中。

2)按照每100mg瓊脂糖加入300uLS;液(溶膠液)的比例加入S1液，置55℃水 浴7min，使其完全溶化，每2min顛倒混勻一次。

3)將溶化后的瓊脂糖溶液移入吸附柱，離心30s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管。

4)在吸附柱中加入500UlW1液(洗滌液)，離心15s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，離心I min，再用W1，液重復洗滌一次，離心I min。5)將吸附柱放入一個干凈的1.5mL的離心管中，在吸附膜中央加入3011LT,洗 脫)液，靜置I min后，離心I min，離心后管中的液體即為回收的DNA溶液。2.3.2 JM109載體菌感受態細胞的制備。

采用氯化鈣法制備新鮮的JM109大腸桿菌感受態細胞。從平板上挑取新活化的大腸桿菌菌落，轉入10mlLB培養基中37℃振蕩培養16-18hr;按1-2%接種量轉至50mlLB中37℃振蕩培養3hr至OD=0.6;冰浴10 min，使培養物冷卻至O℃，轉入10mL離心管中;4 0C , 4000轉離心IOmin;棄去上清，以l OmL冰預冷的0.1mol/L CaC12溶液重懸細胞沉淀，冰上放置15-30 min;40C, 4000轉離心l Omin;棄去上清，每50tnL初始培養物用2mL冰預冷的0.1 moUL CaCl:重懸細胞沉淀;分裝成200 u L的小份，4℃可保存數天(或加終濃度為15%的甘油一80℃保存)。

2.3.3 回收的DNA片段與PUCM-T載體的連接

連接反應體系：

純化回收后的PCR產物4.5ul pUCM一T載體0.5 ul Solution 5.0 ul Total Volume 10 ul。

將上述試劑冰浴加入0.5ml的EP管中，小心混勻，瞬時離心后，于16℃連接4小時。

2.3.4 重組質粒的轉入JM109感受態細胞 從-80取出200ul感受態細胞，室溫下解凍，解凍后立即置于冰片上，加入重組質粒10 輕輕搖勻，冰上放置30min，42℃ 水浴熱擊90S，不要動試管，快速轉移至冰浴1-2min，向管中加入800LB培養液，混勻后37℃震蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長，將上述菌液搖勻后取200涂布于Amp抗性LB平板（X-gal/IPTG）上，正面向上放30min，待菌液完全被培養基吸收后倒置，37℃培養過夜。

2.3.5 陽性克隆的篩選和鑒定

目的片斷定向插入PUCm-T載體多克隆位點，使位于多克隆位點區編碼B-半乳糖苷酶氨基端的一個片斷失活，在含有IPTG、X—Gal、AMP的LB培養基上，陽性克隆菌株將形成白色菌落，而未轉入PUCm-T載體質粒和轉化入PUCm-T載體質粒但不含有插入片斷的陰性克隆菌株將形成藍色菌落。

用無菌牙簽從含氨芐青霉素并涂布有IPTG和X—Gal的LB培養基平板上篩選白色菌落，轉入10ml AMP的LB培養液中，在37下震蕩培養過夜。2.3.6

陽性克隆菌株的酶切鑒定 1)質粒的提取

采用UltraPureTM質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒。

(1)將3-5mL培養過夜的含高拷貝質粒的菌液13, 000rpm離心I min，收集沉淀；

(2)倒掉上清，把沉淀完全懸浮于250ul懸浮液(溶液1)中;(3)加入250ul裂解液(溶液II)，室溫下輕輕搖勻，放置5分鐘;(4)加入350ul中和液(溶液111),室溫下輕輕混勻3分鐘;(5)13000 rpm離心l Omin，將上清液轉入一個新的1.5mL離心管中，(6)加入0.8mL純化樹脂(使用前搖勻)，混勻3分鐘:取0.8mL混合液盛于離心純化柱中，13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液;(7)再取剩下的混合液盛于離心純化柱中，13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液;加入600ul80%異丙醇(或乙醇)，13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液;(8)重復上述第七步驟兩次，最后一次13000rpm離心3分鐘，盡量將異丙醇(或乙醇)去除干凈;（9）取出離心純化柱，將其套入一個千凈的1.5mL離心管中，加入50ulTL于純化樹脂上，不能粘在管壁上。室溫下放置5min.13OOOrpm離心lmin;(10)離心管中收集的液體即是洗脫下來的質粒DNA，取2UL電泳檢。

酶切體系：

10×M Buffer 1.0 ul HindⅢ(10U／L)0.5 ul SacI(10U／L)0.5 ul 質粒DNA5.0 ul 用雙蒸水補足至10 ul,混勻，37℃保溫過夜。將10止酶切產物在1.2％瓊脂糖凝膠上80V電泳45min，于凝膠成像系統中檢測并拍照。2.4 克隆片段的DNA測序測定及分析

將經PCR鑒定和酶切鑒定為陽性克隆的白色菌落做成穿刺管，由上海生工生物工程技術服務有限公司進行可隆片段的DNA序列測定。

2.5 擬采用的論文技術路線或設計參數技術路線：采用二次改良沉淀法提取散斑殼屬的總DNA進行PCR、并回收產物與pUCM一T載體進行連接轉入到JM109感受態細胞中，經過篩選進行酶切鑒定、測序、分析。3 論文進度計劃

時間 內容 完成情況 2006年9月—2006年10月初 從專業書刊、圖書館、互聯網等

媒體收集并整理資料，確定論文題目。已完成 2006年10月中——2006年10底 試驗前的準備 已完成 2006年10月——2007年1月 試驗 進行 2007年2月——2007年3月 試驗分析 待完成 2007年4月——2007年5月 論文撰寫 待完成

四、文獻綜述（附后頁）

散斑殼屬rDNA基因ITS區的PCR、克隆和序列分析

摘要：本文以松落針病病原菌散斑殼為對象，采用二次改良沉淀法，獲得散斑殼菌基因組的DNA。采用真菌通用引物ITS1和ITS4，對這些散斑殼菌的rRNA基因ITS區進行PCR擴增，并回收產物，然后將PCR擴增產物定向克隆到pUCm-T質粒的多克隆區，并轉化到大腸桿菌JM109載體菌中，篩選獲得陽性克隆菌株，對陽性克隆質粒中的外源DNA片段進行序列測定，并作出分析。關鍵詞: 散斑殼菌 ITS區 PCR 克隆 序列測定

1.引言

松落針病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑殼屬真菌所引起的一種世界性林木病，該病害對整個林業生態工程建設、產業化發展造成了嚴重影響，寄主包括多種松樹，主要危害Pinus、冷杉Abies、云杉Picea、落葉松Larix等屬22個種3個變種和1個栽培變種[1]。該病害從幼樹到大樹均可侵染，在幼樹齡中嚴重發病時，引起松葉提前脫落，引向樹木生長，甚至導致樹木死亡，曹成嚴重的經濟損失，這類病在我國也普遍發生，且歷史悠久，但長期以來該病害只是被當作一般性的也部病害來對待，沒有受到應有的重視，也少有深入細致的研究[2]。但從70年代才有了較系統的研究，目前對該病的研究已有160多年的歷史。它隸屬于子囊菌亞門Ascomycotina ,盤菌綱Discomycetes、星裂盤菌Phacidiales、斑痣盤菌科Rhytismataceae[3]。散斑殼屬是1826年正式建立的，現已成為斑痣盤菌科中的第一大屬，全球共有103余種被報道[4]。該病在Minter(1981)記載松樹上有散斑殼l6個種

2． 散斑殼屬真菌的分類和研究狀況

2.1 散斑殼屬的分類和研究概況

散斑殼屬真菌是菌物資源中的重要組成部分，屬于子囊菌亞門Ascomycotina盤菌綱Discomycetes、星裂盤菌目Phacidiales、斑痣盤菌科Rhytismataceae[3]，這個屬是由Chevallie于1826年建立的。它們廣泛分布于世界的大部分溫帶和熱帶地區，寄主除針葉樹外，還包括被子植物及蕨類植物，它們中的相當一部分為植物病原真菌，其引起病害通常為漆斑病或黑痣病，也可細分為枝枯病，葉斑病、梢枯病、果斑病等[5]，Darker(1932, 1967)承認21個種[6]。Minter(1981)在前人研究的基礎上，對松樹上的散斑殼進行了詳細的分類研究，根據子囊果的外部形態以及在子囊果中點作橫切片時在寄主組織內埋藏的深度，盾狀殼開裂區唇細胞的有無和著色深淺，分生抱子器的有無和大小以在基物中的埋藏深度，針葉上橫線紋的有無、顏色和寬度以及生態特征進行分種，共承認16個種[7]，隨后Minter等人(1982)和Cannon等人又發表2個新種。我國對該病的研究始于20世紀20年代。朱鳳美1927年首次報道我國湖北馬尾松上由松針散斑殼L.pinastri引起的落針病[4]。此后對我國多種松樹上發現的散斑殼菌都沿用這一種名。直到80年代由于病原菌的分類研究取得突破性進展，從而促進了病理學的深入研究，并取得一系列的新進展，其中最大的特點是新種不斷被發現，新記錄迅速增加。直至目前，陸續發表了21個新種14個新記錄[4]。

2.2 散斑殼屬真菌的致病性

在國內處許多關于散斑殼屬真菌研究的文獻中,存在著許多矛盾和分歧,其中最突出的是對該屬真菌致病性的看法不同.陳守常、彭旭東、張錫津[8]經過調查研究后認為川東地區華山松落針枯死與病原真菌的侵染無關，而低溫是其枯死的主要因素菜。而對于散斑殼屬中的松針散斑殼，Hanso和Reindi將這種真菌看作是引起松樹落針病的主要病原。面Boyce則認為此菌是弱寄生物或無害的腐生物[9]。林英任[10]經過多年的調查研究后發現，松針散斑殼在由不良因子或其他真菌致死的針葉上腐生的現象確實存在，然而在大多數情況下該菌能危害2、3年生針葉，有時也能侵染球果和長勢較差的幼齡針葉。另外，松針散斑殼分布范圍甚廣，危害樹種亦多。因此他認為：松針散斑殼寄生性和致病性的存在無可非議，是松落針病的主要病原。

2.3 散班殼菌的生活史 散斑殼屬真菌引起的松落針病是一類比較復雜的病害。由于病原菌種類的不同，寄主松樹的生物學特性和各地區自然生態環境等方面的差異，使得不同地區，不同松枝發生的落針病在病原、流行規律有方面均不盡相同[4]。林英任[11]經過研究認為，在安徽、江蘇等地的26種（包括22個種、3個變種、1個栽培變種）松樹上至少存在散斑殼屬病原菌7種，其中松針散斑殼L.pinastri(Schrad)Chev為優勢種，可侵染18種不同的松樹。主要為害幼、中齡松樹的2、3年生針葉，有時也能為害老球果或1年生針葉，嚴重時造成針葉大量死并脫落，樹木長勢衰退。何秉章、鄧興林、楊殿清等[11]研究認為，引起大興安嶺樟子松落針病的病原菌為擾亂散斑殼菌L.seditiosum Minter,Stalay et Miller。1年生苗木受害后并不死亡，影響莖、高生長，2、3年生苗木因連年得病受害，病情逐漸加重，生長衰弱以致枯死。原戈、賈云、齊樂賢等等研究認為，引起遼寧東部山區人工紅松林落針病的病原菌為大散斑殼L.maximum He et Yang。染病的紅松針葉于每年4月中旬、下旬開始顯露癥狀，5月中旬開始落葉，5月下旬至6月上旬為落葉盛期，枝梢光禿。在通常情況下，散斑殼病菌以菌絲或子囊果在松針上越冬，次年春季在松針上產生大量的分生孢子器和子囊果。在陰雨天或潮濕的條件下，子囊果和分生孢子器（部分種缺）吸水膨脹而張開，溢出乳白色的內含物，即子囊孢子和分生孢子，它們借雨滴反濺作用和氣流傳播。孢子萌發產生的芽管由氣孔侵入，也可由微傷侵入。潛育期一個月左右，繁殖期2-4個月。每年6-8月釋放子囊孢子，以7月的放散是最多。分生孢子于5-9月放散，但以6-7月的放散量最多[12]。

2.4 散斑殼真菌的分離培養

國外早在上世紀70年代開始就對散斑殼司真菌進行了分離培養的研究，并認為所得到的不同培養類型是由于種內遺傳變異所導致

[13]

。劉應高等]對云南

[14松針上的4種散斑殼——L.sichuanense,L.conigenum,l.pinatei,L.indianum進行了單孢分離，獲得了各個菌株的培養類型。Johnson[15]在1988年的研究中認為小散斑殼可以在瓊脂培養基上形成有形態。許早時[16]對來自國內的21種散斑殼按照組織分離法獲得了7株培養物，并篩選了其最適生長培養基，認為MA培養基最適宜于該類菌物的營養生長以及有利于產生分生孢子器和分生孢子，所有菌種在培養60天后均不產生子囊果。

3． 核酸序列分析在真菌系統學中的應用

3.1 rRNA基因ITS區序列分析在真菌系統學中的應用

真菌核酸分子水平的研究, 集中在對基因組DNA 和RNA。基因組DNA 是指有機體在單倍體狀態下的DNA 全部含量。廣義的基因組也指某一體系(如核或細胞器)中的DNA , 它包括編碼或細胞中固有的核糖體DNA(rDNA)、線粒體DNA(m tDNA)、tRNA 基因及其它RNA 編碼。同時也包含了一些非編碼基因, 如信號序列、間隔序列(內含子基因)、無功能序列(假基因)。真菌的這些基因在結構、功能和變異程度上差別很大, 是真菌在分子各級水平上研究的良好區段。rDNA 是基因組DNA 中的中等重復、并有轉錄活性的基因家族(gene fam ily), 重復次數在103～ 105。在不同種類真菌中, 由于rDNA 不轉錄內含子的存在, rDNA 在染色體上的拷貝數不同, 但相差不大[17、18、19 ]。rDNA 一般由轉錄區和非轉錄區構成, 轉錄區包括5S, 5.8S, 17～18S, 25～ 28S rDNA 基因, 這些基因由兩個內轉錄間隔區(in ternal t ran scribed space, ITS)分開。轉錄區編碼rDNA 前體, 在轉錄后被加工形成5S, 5.8S, 17～ 18S, 25～ 28S rDNA , 其余RNA 在成熟過程中被降解。此外在18S rDNA 基因上游還有外轉錄間隔區(ex ternalt ran scrib led space, ETS)。ITS 和ETS 包含有rDNA 前體加工的信息。非轉錄區又稱基因間隔區(in tergen ic space, IGS), 它將相鄰的兩個重復單位隔開, 在轉錄時有啟動和識別作用。它實質上包含ETS 區。廣義上把ITS 區和非轉錄區統稱為基因間隔區(IGR: in ternal generegion, 有的又簡稱IGS)。比較特殊的是ETS 常出現在RNA 前體上, 他在重復塊中的位置受5S 位置的影響。在不同真菌種中, 5S 的轉錄方向不同, 也會導致IGS 的區域的不同[20]。在進化速率上, 編碼區比較保守, 可在屬、科、目水平上用于不同生物種的比較, 在其中的高度保守區, 所有的異源基因幾乎都能與之強烈雜交。18S 和28S rDNA 基因的3p端是高度保守的, 即使在原核與真核生物之間也能建立位點同源性。其中, 18S 比28S 基因更保守, 5.8S基因比18S 基因進化稍快些。18S 和28S rDNA 基因是在系統發育中, 種級以上階元的良好標記。真菌核糖體基因及間隔區有不同的進化程度，有的序列比較保守，有的序列進化較快，因此可以根據他們的序列，將真菌鑒定到屬及屬以下種、亞種、變種、甚至菌株的水平[21，22，23]。

核糖體不同序列分類等級表

核糖體序列 適合分類水平5 S rDNA 科（family）及科類以上 5.8S rDNA 屬genus）18S rDNA 屬、種（species）28S rDNA 屬、種、變種(variety)ITS 種、亞種（sister species）、變種、菌株 IGS 種、變種、菌株

利用通用引物對rRNA基因的ITS區段進行PCR擴增并進行序列分析目前已經廣泛用于真菌的分類鑒定。ITS區之所以成為系統與進化研究中的重要分子標記，主要是因為：作為18S-28S rDNA的一個組成部分（如圖1）[24]，它在核基因組中是高度重復的，通過不等交換和基因交換，這些重復單位間可以發生位點內或位點間的同步進化，即不同ITS拷貝間的序列趨于相近或一致，這為PCR拉增產物的測序奠定了理論基礎；而且ITS區的序列較短又非常保守，因此可以用與它們序列互補的通用引物對ITS區進行PCR拉增和測序。目前研究中廣泛使用的引物是Wihteetal.（1990）設計并通用于真核生物。4.結束語

參考文獻

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第三篇：水稻抗病相關基因的分離克隆和功能鑒定

附件2

論文中英文摘要

作者姓名：丁新華

論文題目：水稻抗病相關基因的分離克隆和功能鑒定

作者簡介：丁新華，男，1980年06月出生，2002年09月師從于華中農業大學王石平教授，于2008年06月獲博士學位。

中

文

摘要

水稻白葉枯病和稻瘟病分別是由白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起，是世界水稻生產中的兩大重要病害，造成巨大的損失。通過改良水稻自身防御體系來有效的控制病害，是一種即經濟又“綠色”的方法。鑒定水稻抗病相關基因，研究水稻抗病機理對改良水稻有著重要的科學意義和應用前景。

植物激素生長素誘導的信號通常被認為調節植物的生長和發育。本研究報道的水稻基因GH3-8是一個生長素反應基因，在依賴于生長素的發育中發揮功能，同時也調節不依賴于水楊酸和茉莉酸的信號路徑的抗病反應。白葉枯病病菌誘導水稻至少在被侵染部位合成生長素，而生長素繼而誘導水稻大量合成松弛細胞壁的蛋白質－伸展蛋白（α-和β-expansins），破壞細胞壁對病原菌的先天屏障作用，以利病原菌在水稻中生長繁殖。在攜帶有抗病基因Xa21或Xa26抗病水稻品種中，病原菌引起的水稻感染部位生長素的合成可誘導水稻快速合成IAA酰胺合成酶GH3-8。GH3-8通過催化IAA－氨基酸的合成抑制生長素的作用，從而阻止細胞壁的松弛，增強植物對病原菌的自身免疫功能。超量表達GH3-8基因增強水稻對白葉枯菌的抗性，同時也延緩了植株的生長和發育，至少部分因為抑制了生長素信號從而抑制了α-和β-expansins。本研究結果揭示了病原菌利用生長素作為毒性因子侵染水稻的機理、以及水稻應對這一毒性因子的調控途徑，同時也從一個方面解釋了植物在抗病反應中通常要付出生長被抑制的代價的原因。

超量表達GH3-8導致植株不育。通過正反交試驗顯示GH3-8超量表達植株是雄性和雌性都不育。通過形態學觀察發現GH3-8超量表達植株的雌蕊柱頭發育不正常；通過激光共聚焦顯微鏡對雌蕊胚囊觀察發現，GH3-8超量表達植株的成熟胚囊發育不正常，這可能是GH3-8超量表達植株雌性不育的原因。通過形態學觀察發現GH3-8超量表達植株的雄蕊和野生型無異，但花粉碘染顯示GH3-8超量表達植株大部分花粉都敗育，這可能是GH3-8超量表達植株雄性不育的原因。通過分析GH3-8基因表達模式顯示GH3-8基因特異在雄蕊高表達，并隨著花的發育表達強弱也不斷變化，而在雌蕊基本檢測不到表達。組織和時間的特異表達也印證了GH3-8在調控花的發育中作用。利用酵母單雜交技術，篩選得到和GH3-8基因啟動子互作的幾個生長素反應因子。其中OsARF8超量表達激活GH3-8基因的表達，證明OsARF8是調控GH3-8基因表達的轉錄因子。通過分析OsARF8基因表達模式顯示OsARF8基因特異在雌蕊高表達，而在雄蕊表達很低。OsARF8基因超量表達植株和野生型植株相比育性下降。花粉碘染顯示OsARF8基因超量表達植株大部分花粉敗育；檢測雌蕊沒有發現和野生型有顯著

差異。花粉的育性下降可能是OsARF8超量表達植株育性下降的原因。生長素信號路徑中的基因（OsARF8和GH3-8）的不正常表達影響了水稻育性，說明生長素信號可能在調控水稻育性中有重要作用。檢測水稻穗發育中生長素分布也顯示生長素和穗的發育密切相關。

在水稻品種明恢63中抑制一個維生素B1合成基因OsDR8的表達，顯著提高了轉基因植株對白葉枯病和稻瘟病的敏感。外源應用維生素B1可以互補抑制OsDR8基因對水稻植株抗病的影響。幾個防御反應基因包括防御信號路徑的早期功能基因OsPOX和OsPAL基因以及路徑下游基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR5 和OsPR10的表達在OsDR8抑制表達的植株中下降。這些結果說明OsDR8影響植株的抗性可能是通過影響防御反應基因的表達，OsDR8的功能在信號路徑的上游。另外，維生素B1的積累可能是水稻植株對白葉枯病和稻瘟病的抗性所必須的。

通過篩選水稻T-DNA插入突變體庫，發現一個類病斑突變體。側翼序列分析顯示T-DNA插在一個基因（命名為OsDR9）的開放讀碼框。預測的OsDR9基因編碼由180個氨基酸組成的功能未知蛋白。OsDR9基因在莖和幼穗中表達很低，而在幼苗、劍葉、葉鞘和愈傷表達較高，在根中沒有檢測到表達。另外OsDR9基因在老葉中比新葉表達更高。突變體對稻瘟病和胡麻葉斑病表現高抗。對有類病斑的葉片進行組織化學檢測和DNA斷裂分析顯示細胞死亡具有凋亡特征。病程相關蛋白PR4和PR8以及稻瘟病相關基因AOS2在突變體中上升表達。突變體植株也積累了自發熒光物質、SA、JA和植保素（momilactone A 和 sakuranetin）。突變體提高了超氧化物和H2O2的水平。將一個來源于水稻品種日本晴的包含有OsDR9基因的10.5kb片段轉入突變體02Z15AM37，轉基因植株類病斑表型消失，說明由于T-DNA插入導致的OsDR9突變是是引起類病斑表型的原因。這些結果說明OsDR9是水稻抗病和細胞凋亡的一個負調節子。

關鍵詞：

水稻；白葉枯病；稻瘟病；抗病相關基因；生長素；水楊酸；茉莉酸；基礎抗性；發育；伸展蛋白；GH3；維生素B1；類病斑突變體；凋亡；植保素；活性氧物質

Isolation and Functional Characterization of Pathogen-induced Defense-responsive Genes of Rice

Xinhua Ding

ABSTRACT Rice bacterial blight disease caused by Xanthomonas oryza sative pv.oryza and fungal blast disease caused by Magnaporthe grisea, are two of the most devastating diseases of rice worldwide.These two diseases cause tremendous yield loss each year.Efficient control of disease through improving rice defensive system is economic and green way.Characterizing rice disease resistance related genes and elucidating the mechanism of rice disease have important significance in science and application for improving rice.The signaling induced by the plant growth hormone auxin is generally recognized to regulate plant growth and development.Here we report that rice GH3-8, an auxin-responsive gene functioning in auxin-dependent development, activates disease resistance in a salicylic acid– and jasmonic acid–signaling-independent pathway.Bacteria induce accumulation of indole-3-acetic acid(IAA), the major type of auxin, in rice.IAA induces the expression of α-and β-expansins, the proteins that are known to loose cell wall, the native barrier of biotic intruder, to facilitate the growth of cells.In resistance rice variety carrying Xa21 or Xa26, the infection of bacteria induce rice to synthesize GH3-8 in infection site of rice.GH3-8 encodes an IAA-amino synthetase that prevents free IAA accumulation and looseness of cell wall.Overexpression of GH3-8 results in enhanced disease resistance and retarded growth and development, which is at least partly due to inhibiting the expression of α-and β-expansins via suppressing auxin signaling.Here we show the mechanism of bacteria hijacks auxin as virulence factor to infect rice, and the regulating pathway of rice to the virulence factor;in addition to, explain the cause that plants growth was restrained in disease resistance.Overexpression of GH3-8 results in sterility of plants.Analysis of forward cross and reverse cross showed that GH3-8-overexpressing plants were male sterility and female sterility.We found that the stigmas of GH3-8-overexpressing plants are abnormal by morphological observation.We observed the mature embryo sac of GH3-8-overexpressing plants using laser scanning confocal microscopy.The result showed that the mature embryo sacs of GH3-8-overexpressing plants were abnormal.This may be the reason of female sterility.No obvious difference was observed in stamen between GH3-8-overexpressing plants and wide type in stamen, but the most of pollen of GH3-8-overexpressing plants were sterile.This may be the reason of male sterility.GH3-8 had high expression level in stamen, and the expression of GH3-8 changes as the development of flower.Tissue and time differential expression confirmed the role of GH3-8 in regulating flower development.We gained several auxin responsive factors(ARFs)that interacted with the promoter of GH3-8 by analysis of yeast one hybrid.Overexpression of OsARF8 in Mudanjiang 8 activated the expression of GH3-8.This result suggested that OsARF8 is the transcription factor in regulating the expression of GH3-8.OsARF8 had high expression level in pistil, and very low expression level in stamen.GH3-8-overexpressing plants had lower fertility than wide type.The most of pollen of OsARF8-overexpressing plants were sterile.The overexpression of Auxin signaling genes(OsARF8

and GH3-8)resulted in decrease of rice fertility.This result suggested that auxin plays a critical role in regulating flower development.The detection of the auxin distribution in panicle development showed that auxin is affinitive relation with panicle development.The transgenic plants with repressed expression of OsDR8 showed reduced resistance or susceptibility to Xanthomonas oryzae pv.oryzae and Magnaporthe grisea causing bacterial blight and blast, respectively.The putative product of OsDR8 was highly homologous to an enzyme involved in the biosynthesis of the thiazole precursor of thiamine.Exogenous application of thiamine could complement the compromised defense of the OsDR8-silenced plants.The expression level of several defense-responsive genes including the earlier functional genes of defense transduction pathway, OsPOX and OsPAL, and the downstream genes of the pathway, OsPR1a, OsPR1b, OsPR4, OsPR5 and OsPR10, was also decreased in the OsDR8-silenced plants.These results suggest that the impact of OsDR8 on disease resistance in rice may be through the regulation of expression of other defense-responsive genes and the site of OsDR8 function is on the upstream of the signal transduction pathway.In addition, the accumulation of thiamine may be essential for bacterial blight resistance and blast resistance.We found a mutant with lesion mimics on the leaves through selecting a T-DNA insertional rice pool.The inserted T-DNA was inserted into the open reading frame(ORF)of a gene named OsDR9.The predicted encoding product of OsDR9 consists of 180 amino acids that is an unknown functional protein.OsDR9 had very low expression level in the stem and young panicle but higher level in seedling, flag leaf, sheath and callus;no OsDR9 expression was detected in the root.In addition, OsDR9 had higher expression level in old leaf than young leaf.The mutant was highly resistance to Magnaporthe grisea causing fungal blast disease and bipolaris oryzae causing Cochliobolus miyabeanus disease in field.Histochemical detection and DNA fragmentation of the leaves developed lesion mimics showed that the cell death had the same features of apoptosis.In addition, the expression of pathogenesis related(PR)proteins genes PR4 and PR8 as well as a blast resistance related gene AOS2 was upregulated in the mutant.The mutant also accumulated autofluorescent materials, salicylic acid and phytoalexins(both momilactone A and sakuranetin).The mutant contained elevated levels of superoxide and H2O2.A 10.5-kb fragment harboring the OsDR9 gene from rice variety Nipponbare was transferred into the mutant.Lesion mimic phenotype was disappeared in the transgenic plants, indicating that knockout of OsDR9 by T-DNA insertion caused the lesion mimic mutant phenotype.These results suggest that OsDR9 is a negative regulator in rice disease resistance and apoptosis.Key words: Oryza sativa;bacterial blight;fungal blast;auxin;salicylic acid(SA);jasmonic acid(JA);basal resistance;development;expansin;GH3;thiamine;lesion mimic mutant(LMM);apoptosis;phytoalexin;reactive oxygen species(ROS)

第四篇：蛋白質序列、性質、功能和結構分析

蛋白質序列、性質、功能和結構分析

基于網絡的蛋白質序列檢索與核酸類似，從NCBI或利用SRS系統從EMBL檢索。

1、疏水性

分

析

ExPASy的ProtScale

程

序（http:// PHDhtm: http:

EpitopeInfo: http://epitope-informatics.com/Links.htm

5、蛋白質功能預測 蛋白質序列分析的一般流程如下圖。圖1 蛋白質序列分析的一般流程（1）基于序列同源性分析的蛋白質功能預測 至少80個氨基酸長度范圍內具有25%以上的序列一致性才提示可能的顯著性意義。未知功能序列對庫檢索的一般分析策略如下： ①和運行Blastp程序的服務器（http://，將目的序列粘貼到輸入框中，點擊“search”即可。數據庫PROSITE是由專家根據生物學知識審編的SWISS-PROT蛋白質序列中有生物學意義的位點（sites）、模式（patterns）和輪廓（profiles）的數據庫，包括酶活性位點、輔因子結合位點、二硫鍵位點等。此庫可以幫助確定新的蛋白質序列是否屬已知的家族。其網址為： http://

PFAM: http://可用于對查詢蛋白質序列相似性分析以確定其結構。

c、ISSD數據庫

http://www.protein.bio.msu.su/issd/。d、HSSP數據庫

http://www.sander.embl-heidelberg.de/hssp/。e、蛋白質結構分類數據庫（SCOP）蛋白質結構分類數據庫（structural classification of proteins，SCOP）http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/。f、Dali/FSSP數據庫

http://www.embl-ebi.ac.uk/dali/。（2）蛋白質二級結構預測

蛋白質多重序列對齊結果進行蛋白質二級結構預測的PHD程序：

http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html（3）蛋白質三級結構預測 a、與已知結構的序列比較

采用BlastP程序直接搜索NRL-3D、SCOP等數據庫，如果在連續100個氨基酸范圍內含有大于40%的一致性，那么在蛋白質結構上則具有較為顯著的相似性。此種情況下，即預測中結果按照同源模建（homology modeling）方法能夠提供詳細而準確的結果。在25~40%之間則難以提供精確的結果。

如果無法在NRL-3D數據庫找到匹配序列，下一步則是搜索HSSP數據庫。最簡單的方法是用BLAST或FASTA程序搜索蛋白質序列數據庫（SWISS-PROT，Trembl，PIR）。序列檢索系統（sequence retrieve system，SRS）能夠提供大于25%的序列一致性。如果檢出結果含有HSSP數據庫的信息，那么在字段DR中會有注釋。如果與HSSP數據庫中的蛋白質含有超過25%的序列一致性，那么一般認為該蛋白質至少和HSSP數據庫中的蛋白質具有相似的折疊模式。

b、同源模建

Swiss-Model服務器（http://www.expasy.ch/swissmod/SM_TOPPAGE.html）提供自動化財同源模建分析任務。c、穿針引線（threading）算法和折疊識別 有如下程序資源： TOPITS: http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html frsvr

(fold

recognition

server): http://www.mbi.ucla.edu/people/frsvr/frsvr.html 123D: http://www-lmmb.ncifcrf.gov/~nicka/123D.html THEADER

and

THEADER2: http://globin.bio.warwick.ac.uk/~jones/threader.html http://globin.warwick.ac.uk/~jones/threader.html

7、蛋白質分子進化分析

同源蛋白質（homolog）進一步可分為直系同源（ortholog）和旁系同源（paralog）。前者指在不同物種中具有相同功能和共同起源和基因，后者則指在同一物種內具有不同功能、但也有共同起源的基因，例如同是起源于珠蛋白的α珠蛋白、β珠蛋白和肌紅蛋白。

早期基于序列同源性來區分蛋白質家族的不同層次。由于在分子進化過程中，組成一個蛋白質序列的所有氨基酸并不具備同樣的進化速率，具有重要功能位點的氨基酸顯然進化較慢，因此單純基于序列相似性并不合理。蛋白質進化過程中反映出重要氨基酸組群進化速率較慢而形成的保守性。這一結果體現在很多蛋白質家族成員之間蛋白質序列相似性可能只局限于某個序列區域或結構域中。因此，蛋白質超家族的概念已發展成為具有某種共同結構域的所有分子組成的分子集合。這一概念將蛋白質超家族進行了擴大。這一點也反映在PDB數據庫的處理中，即PIR數據庫不只依據序列的相似性，而且結合結構域的分析進行蛋白質家族和超家族分類。

蛋白質分類數據庫（ProtoMap）：http://www.protomap.cs.huji.ac.il/。如果發現一個未知蛋白質序列和較多不同種屬或同一種屬的蛋白質序列具有較高的同源性（大于30%），那么提示待分析蛋白質序列可能是相應家族的成員，從而可從分子進化的角度對蛋白質序列進行綜合分析。基本步驟包括：

①用待分析蛋白質序列檢索蛋白質序列數據庫，獲取同源性較高的蛋白質序列。此過程可通過NCBI/Blastp程序分析。

②將所有相關序列組織成FASTA格式，作為后續進行Clustal W/X軟件分析的輸入數據。

③采用Clustal W/X算法對這些序列進行聚類分析，可聯網到http://www.ebi.ac.uk/clustalw/或直接使用Clustal W/X軟件進行。④根據蛋白質序列多重對齊結果繪制分子進化樹。采用本地化軟件MacVector、DANMAN、TreeView等進行。

第五篇：大豆熱激轉錄因子基因GmHsfA1的克隆、結構分析及功能鑒定

大豆熱激轉錄因子基因GmHsfA1的克隆、結構分析及功能鑒定

熱激轉錄因子(heat shock transcription factor, HSF)在調節植物對逆境脅迫(特別是熱脅迫)應答和相關基因表達方面起重要作用。我們采用生物信息學和比較基因組學方法結合RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術，從大豆基因組中克隆到一個熱激轉錄因子基因GmHsfA1，其cDNA全長1781bp，編碼一段由510個氨基酸組成的多肽(accession number:AY458843)。序列比對和結構分析顯示，GmHSFA1與番茄熱激轉錄因子LpHSFA1之間的同源性最高，二者間的氨基酸序列相似性達到52.46%。GmHSFA1包含4個重要功能域，即DNA結合域DBD（DNA binding domain）、寡聚域OD（oligmerization domain）、核定位信號NLS（nuclear location signal）和C端激活域CTAD（C-terminal activation domain）。

通過定量PCR和RT-PCR分析顯示，GmHsfA1在大豆不同組織和不同發育時期都有穩定表達（組成型表達模式），高溫和高鹽誘導能加強其表達，而NAA、GA和ABA等外源激素處理可降低其表達。遺傳轉化和Northern雜交結果表明，在常溫(28℃)下，轉基因大豆植株中GmHsfA1的表達量比非轉基因對照植株明顯增加，而在高溫(45℃)誘導下，含有35S-GmHsfA1的轉基因植株的熱激蛋白基因(GmHSP70)表達量比非轉基因植株高出8倍以上。熱誘導實驗表明，轉基因植株的耐熱溫度高達52℃，比非轉基因植株（僅耐42℃）提高了10℃。這說明GmHSFA1具有激活或上調GmHSP70基因表達的功能，其過量表達能夠明顯增強轉基因大豆的耐熱能力，而且還具有一定的耐旱能力。上述結果證明GmHSFA1是一個新的、有功能的大豆熱激轉錄因子，對于研究耐逆相關基因的調控機理和培育耐逆性強的基因工程大豆等作物新品種具有重要意義。

關鍵詞： 大豆 熱激轉錄因子 基因克隆 遺傳轉化 過量表達 耐熱性