第一篇：放線菌抗生素的發酵及目的產物的提取實驗報告

放線菌抗生素的發酵及目的產物的提取

一、實驗目的

1、熟悉掌握土壤中分離抗生素及培養方法

2、了解和掌握種子制備和搖瓶發酵技術和方法

3、了解抗生素發酵的一般規律和代謝調控理論

4、了解小型發酵罐的基本結構

5、熟悉掌握小型發酵罐的使用方法和保養

6.掌握抗生素生物效價測定的原理和方法；

7.掌握管碟法測定抗生素生物效價相關的操作方法。8.掌握放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯實驗的基

本原理和操作技術

二、實驗原理

①發酵罐是進行液體發酵的特殊設備。生產上使用的發酵罐容積大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供實驗室使用的小型發酵罐，其容積可從約lL至數百升或稍大些。一般來說，5L以下是用耐壓玻璃制作罐體，5L以上用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動地調控試驗所需要的培養條件，是微生物學、遺傳工程、醫藥工業等科學研究所必需的設備。

②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產物，能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質。現臨床常用的抗生素有轉基因工程菌 培養液液中提取物以及用化學方法合成或半合成的化合物。

③放線菌發酵結束后，次級代謝物可能與菌體結合，工業上常采用草酸或磷酸等酸化劑處理，釋放與菌體結合的次級代謝物，并采用加熱發酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性濾液，在經堿處理，進一步去除蛋白。

抗生素的效價常采用微生物學方法測定，它是利用抗生素對特定的微生物具有抗菌活性的原理來測定抗生素效價的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效價測定的國際通用方法，我國藥典也采用此法。管碟法是根據抗生素在瓊脂平板培養基中的擴散滲透作用，比較標準品和檢品兩者對試驗菌的抑菌圈大小來測定供試品的效價。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內徑6.0±0.l mm，外徑8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管內放人標準品和檢品的溶液，經16~18小時恒溫培養，當抗生素在菌層培養基中擴散時，會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當抗生素濃度達到或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現透明的無菌生長的區域，常呈圓形，稱為抑菌圈。根據擴散定律的推導，抗生素總量的對數值與抑菌圈直徑的平方成線性關系，比較抗生素標準品與檢品的抑菌圈大小，可計算出抗生素的效價。

常用的管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經列入藥典。二劑量法系將抗生素標準品和供試品各稀釋成一定濃度比例（2:1或4:1）的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根據抗生素濃度對數和抑菌圈直徑成直線關系的原理來計算供試品效價。取含菌層的雙層平板培養基，每個平板表面放置4個小鋼管，管內分別放入供試品高、低劑量和標準品高、低劑量溶液。先測量出四點的抑菌圈直徑，按下列公式計算出檢品的效價。

（1）求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式 2.10-2)式中：UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑； UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑； SH：標準品高劑量之抑菌圈直徑； SL：標準品低劑量之抑菌圈直徑；

（2）求出θ： θ=D·antilog（IV/W）(式 2.10-3)式中：θ：供試品和標準品的效價比；

D：標準品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1 I：高低劑量之比的對數，即log2或log4。⑶求出

Pr

：

Pr

=

Ar

×

θ

(式 2.10-4)式中：Pr：供試品實際單位數； Ar：供試品標示量或估計單位

④甲醛滴定法測定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸為兩性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。用甲醛處理氨基酸,甲醛與氨基結合,可形成羥甲基衍生物，使NH3+上的H+游離出來，這樣就可用堿滴定NH3+放出的H+，從而計算出氨基氮含量。如樣品中只含有某一種已知氨基酸，由甲醛滴定的結果即可算出氨基氮的含量。如果樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白質水解物），則滴定結果不能作為氨基酸的定量依據。甲醛滴定法常用于測定蛋白質的水解程度，隨著水解程度的增加，滴定值增加，當水解完全后，滴定值保持恒定。

甲基紅的變色范圍是PH4.4~6.2,意思是說: 1.其pH值在4.4~6.2區間時,呈橙色, 2.其pH值≦4.4時,呈紅色,因是靠近酸性強的一邊時的顏色,故又稱之為酸色。

3.其pH值≧6.2時,呈黃色，因是靠近堿性強的一邊時的顏色,故又稱之為堿色

二、儀器與材料

（一）培養基

高氏一號培養基：

可溶性淀粉 20.0g NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 蒸餾水 1000ml，PH 7.4，發酵瓶培養基：

?淀粉3%,葡萄糖2%, 黃豆餅粉2.5%, 蛋白胨0.5% ，酵母粉0.5%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%, KH2PO4, 0.03%，CaCO3 0.4%, PH 6.0。

?黃豆餅粉 4g, 淀粉10g, 酵母粉0.25 g , 蛋白胨1.5g，MgSO4 0.025 g, CaCO3 0.4g,(NH4)2SO4 0.3 g，α-淀粉酶（105u/ml）0.01ml.100ml PH7.4-7.6 ?可溶性淀粉 2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g，MgSO4.7H2O 0.05g，FeSO4.7H2O

0.001g，加蒸餾水至100ml，PH 7.4，牛肉膏蛋白胨

牛肉膏(5.0g），蛋白胨（10.0g），NaCl（5g），蒸餾水（1000mL），pH 7.2~7.4

發酵罐培養基(2L)：

黃豆餅粉 80g 淀粉 200g 酵母粉 5 g 蛋白胨 30g MgSO4 0.5 g CaCO3 8g(NH4)2SO4 6 g ?-淀粉酶（105u/ml）0.2ml（二)流加補料

碳源：葡萄糖（10%）300ml,控制1%；2000*1%=20g,200ml 氮源：硫酸銨（10%）250ml,控制16% 調PH值：0.1MHCl 0.1MNaOH（三)分析指標及方法所用試劑及溶液

?測殘糖-DNS法

1.3，5二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）：將6.3g的3，5二硝基水楊酸和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到1000ml

2.1.0mg/ml葡萄糖溶液：稱取1g葡萄糖，加蒸餾水定容到1L。

3.6mol/l氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉24g,加蒸餾水定容到100ml。

4.6mol/l的鹽酸：取濃鹽酸49.68ml,加蒸餾水定容到100ml。

?測殘氮的方法-甲醛法

1.甲基紅：0.1g甲基紅，用95%乙醇定容100ml。2.0.3mol/LHCL：取濃鹽酸2.48ml,加蒸餾水定容到100ml。3.0.02858mol/L NaOH：稱0.11432g,定容100ml。4.1%酚酞指示劑：稱取1g酚酞指示劑粉末。溶于100ml 95%乙醇溶液中。

5.95%乙醇：取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值100ml。

6.18%中性甲醛：取48ml 38%的甲醛加入小于100ml容量瓶，往溶液中加兩滴酚酞用氫氧化鈉滴定剛好變紅，定容到100ml。

（四）器材

玻璃試管、試管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養箱、恒溫箱、臺秤、5L-發酵罐，無菌室、培養皿（直徑9 cm）、陶瓦蓋、鋼管、鋼管放置器、恒溫培養室、滅菌刻度吸管、玻璃容器、稱量管、毛細滴管、天平、直尺或游標卡尺、超凈工作臺，無菌培養皿，酒精燈，牛津杯，鑷子，移液器等等

（五）.生物效價測定所需材料

（1）菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），菌液濃度約為

106個/mL。菌株保存的時間過久，影響其對抗生素的敏感度，導致抑菌圈變大、模糊或者出現雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣的結果。因此，菌液在使用一段時間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數。

（2）抗生素標準品和供試品：頭孢拉定標準品和供試品。（3）培養基：效價檢定用培養基1號。

（4）無菌緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59g，磷酸二氫鉀0.41g，加水1000mL，即為pH 7.8的磷酸鹽緩沖液。制備緩沖液的試劑應為分析純，配制后的緩沖液應澄清，分裝于玻璃容器內，經121℃蒸氣滅菌30 min備用。（5）草酸，10 M NaOH

四、實驗步驟

⑴篩選高產放線菌

從土壤里篩選出高產放線菌，于斜面培養基中保藏

⑵接種

在超凈工作臺上，將長好的斜面孢子用無菌接種針挖塊約0.5×1cm，接種于滅過菌的高氏一號培養基中。

⑶培養 2 將接種好的種子搖瓶于28℃恒溫室搖床上，轉速為200r/min，培養48小時左右。

⑷實罐滅菌

1、將冷凝水管路斷開，拔下電極，打開罐蓋，將發酵培養基裝入發酵罐及補料瓶，易產生泡沫的培養基盡量不要超過兩升。

2、連接管路：取樣管路連接，補料管路連接；空氣過濾器用硅膠管與罐蓋空氣管連接，并用彈簧夾夾緊；排氣口與過濾器用硅膠管連接；安裝溫度電極、pH電極、溶氧電極，pH電極用們帽蓋緊電極上端口，溶氧 電極用鋁鉑紙包裹電極上端口，防止受潮。蓋緊其它罐蓋接口。

3、提起玻璃罐體及補料瓶放入滅菌鍋，蓋好牛皮紙，蓋好鍋蓋，確定發酵溫度及時間。

4、滅菌結束后，盡快將罐放回原位并盡快通入空氣。

⑸發酵操作

1、將滅菌后的罐體放回原位，連接冷凝水管路，通入冷凝水，連接通氣管路，調整通氣量至3～5L/min。

2、將溫度電極、pH電極、溶氧電極與控制器連接。

3、補料管連接：打開補料蠕動泵防護蓋，搬開進出口處的白色管夾，將硅膠管嵌入入口處的管夾并夾緊，用手轉動泵頭，將硅膠管沿凹槽安裝直至出口處，開手動開關約十秒后夾緊出口處管夾，關手動開關；將酒精棉球放在罐蓋補料口內，將針頭插入并穿透密封蓋； 打開蠕動泵手動開關，使輸液管中充滿料液，置于自動狀態。

⑹接種

將培養48小時的搖瓶種子接種于發酵罐中，使用接種圈放置酒精棉點燃，進行無菌接種，接入100ml種子。接種后立即進行第一次取樣。

⑺發酵生產

⑻發酵過程的測定：

?發酵液狀態觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態

?發酵中殘糖的測定-DNS法：

1.取1.0mg/ml葡萄糖標準溶液，按下表加入試劑。沸水浴加熱5min，冷水冷卻定容至25ml搖勻，在520nm按波長測吸光度。

編號

葡萄糖標準溶液/ml

水/ml

溶液糖含量/mg

DNS試劑/ml 0 1 2 0 2 0 0.2 0.4 0.6

1.5 1.5 1.5 1.5 0.2

1.8 0.4

1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 3

0.6 4

0.8 5 1.0

0.8

1.5 1.0

1.5 1.2

1.5 1.5 1.5 6

1.2 7

1.4 8

1.6

0.6

1.4 0.4

1.6

2.取發酵液0.5ml置于50ml容量瓶中，加6mol/l的鹽酸溶液2ml，在沸水溶液中加熱15min水解，冷水冷卻后及時6mol/l氫氧化鈉溶液1.8ml，并定容到50ml的總糖水解液。

3.取總糖水解液2ml于25ml比色管中，加入DNS試劑1.5ml沸水浴中加熱5min，冷水冷卻后定容至25ml搖勻，以空白作對照在520nm波長測吸光度。

?氨基酸氮的測定：甲醛法(陳鈞鳴和徐玲娣,1991)。取2ml發酵液濾液于三角瓶內,加蒸餾水10ml,甲基紅指示劑2滴,用O.3MHCI調節pH至溶液呈紅色,再用0.02858MNaOH溶液調pH至溶液呈橙色(中性),加18%中性甲醛溶液4ml,搖勻,靜置10min,加l%酚酞指示劑8滴,用0.02858NNaOH標準溶液滴定至微紅色為終點。氨基氮的計算公式為:氨基氮(mg/l00ml)=滴定體積*20。

⑼放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯實驗的

1、配制培養基高壓滅菌。

2、倒平板。

3、涂布指示菌。

4、以無菌操作在培養基表面直接垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙。

5、收集發酵液，緩緩加入草酸將發酵液酸化至pH 1.4-3.0左右，70 ℃，2 min，以10000 rpm離心20 min。

6、取上清加入水稀釋20%左右，在4℃，用10 M NaOH中和至pH6.4-6.8。

7、吸取中和液100 μL 加入牛津杯中，37℃培養16hr，觀察結果。

⑽效價測定 1.稱量

稱量前，將抗生素標準品和供試品從冰箱取出，使與室溫平衡，供試品應放于干燥器內至少30 min方可稱取。供試品與標準品應用同一天平；吸濕性較強的抗生素在稱量前1~2小時更換天平內干燥劑。標準品稱量不可少于20 mg，取樣后立即將稱量瓶或適宜的容器及被稱物蓋好，以免吸水

稱樣量的計算W=V*C/P(式 2.10-4)式中：W：需稱取標準品或供試品的重量（mg）

V：溶解標準品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積量（mL）

C：標準品或供試品高劑量的濃度（U/mL，μg/mL）P：標準品的純度或供試品的估計效價（U/mg，μg/mg）2.稀釋

從冰箱中取出的標準品溶液，必須先在室溫放置，使其溫度達到室溫后，方可量取。標準品或供試品溶液的稀釋應采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2 mL，稀釋步驟一般不超過3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開始放溶液。稀釋標準品與供試品用的緩沖液應同一批和同瓶，（預計不夠時，應事先與另一瓶混勻后再用），以免因pH或濃度不同影響預定結果。稀釋時，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準確補加至刻度。標準品與供試品高低濃度之比為2:1或4:1，但所選用的濃度必須在劑量反應直線范圍內。3.雙碟制備

在超凈工作臺上，用滅菌大口吸管（20 mL），取已融化的培養基20 mL注入雙碟內，作為培養基的底層，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋覆蓋，放置20~30 min，備用。取出試驗用菌懸液，按已試驗適當的菌量（高濃度所致的抑菌圈直徑18~22 mm），用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水浴中（一般細菌48~50℃，芽孢可至60℃）的培養基內，搖勻作為菌層用。用滅菌大口5mL吸管，吸取菌層培養基5 mL，使均勻攤布在底層培養基上，置水平臺上待凝固，用陶瓦蓋覆蓋，放置20~30 min，備用。4.放置鋼管

用鋼管放置器，或其他方法將鋼管一致、平穩地放入培養基上，鋼管放妥后，應使雙碟靜置5~10 min，使鋼管在瓊脂內稍下沉穩定后，再開始滴加抗生素溶液。5.滴加抗生素溶液

每批供試品取5~10個雙碟，滴加溶液用毛細滴管或定量加樣器，在滴加之前須用滴加液洗2~3次。在雙碟的4個鋼管中以對角線滴加標準品與供試品溶液的高、低二種濃度的溶液，滴加順序為SH→TH→SL→TL，也可用SL→TL→TH→SH。（S代表標準品，T代表供試品，H代表高濃度，L代表低濃度），滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴散時間不同影響測定結果。滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩置于雙碟托盤內，雙碟疊放不可超過3個，避免受熱不均，影響抑菌圈大小，以水平位置平穩移入35~37℃恒溫培養室，培養至所需時間。

6.抑菌圈測量

用直尺或游標卡尺測量抑菌圈的直徑，以毫米為單位，誤差不超過0.1mm。

五、結果與計算

根據實驗測量的抑菌圈大小，計算抗生素供試品的效價單位。

第二篇：土壤中放線菌的采集、分離、培養、發酵及提取實驗報告

土壤中放線菌的采集、分離、培養、發酵及提取

實驗目的：

1、從土壤中分離產抗生素的放線菌

2、放線菌的培養

3、放線菌的發酵產生活性物質

4、放線菌產生的活性物質提取。實驗原理：

放線菌是一類呈菌絲狀生長，主要以孢子繁殖。放線菌與人類的生產和生活關系極為密切，目前廣泛應用的抗生素約80%是各種放線菌所產生的。

許多臨床應用的抗生素均由土壤中分離的放線菌產生。采用選擇培養基可分離土壤中的放線菌。產抗生素的放線菌經液體培養后，其分泌的抗生素存在于離心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌試驗進行檢測，從而篩選到所需的抗生素產生菌，并對其進一步培養，繁殖，發酵，最終提取我們所需的抗生素。實驗器材：

1、土壤

2、培養基：高氏一號培養基、種子培養基、發酵培養基

3、其他：重鉻酸鉀、培養皿、牛津杯、接種環、酒精燈，無菌涂棒、三角錐瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、試管、牛皮紙、線繩等。實驗步驟：

一、土壤放線菌株的采集

采集樣品：選定取樣點（最好是有機質含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數次，然后取2～10cm處的土壤。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。

樣品（土壤）處理：室溫風干

二、土壤中放線菌的分離、培養

1、配制淀粉培養基

淀粉瓊脂培養基（高氏培養基）

可溶性淀粉2g；硝酸鉀0.1g；磷酸氫二鉀0.05g；氯化鈉0.05g；硫酸鎂0.05g；硫酸亞鐵0.001g；瓊脂2g；水100ml.先把淀粉放在燒杯里，用5ml水調成糊狀后，倒入95ml水，攪勻后加入其他藥品，使它溶解。加熱到煮沸時加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補足失水。調整PH到7.2-7.4，分裝后滅菌，備用。

2、土壤懸液梯度稀釋

① 將5.0g土壤加入到50ml滅菌的生理鹽水中，震蕩10min制備土壤懸液。

② 用無菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml滅菌的生理鹽水中10倍稀釋。

③ 按1：:1稀釋至10-

3、10-

4、10-5，將3塊滅菌平板分別標記10-

3、10-

4、10-5，稀釋過程應在無菌條件下進行。

3、將高氏一號培養基加熱溶化，待冷至55-60℃時，加入3%的重鉻酸鉀數滴（大約100ml加0.3ml），混合均勻。分別吸取0.1ml稀釋液于滅菌平皿中，再加入10-15ml恒溫于55℃的含有重鉻酸鉀的淀粉瓊脂培養基中，輕輕旋轉混合均勻。

4、平皿倒置于培養箱28℃恒溫培養一周左右。

5、將平皿上的放線菌菌落跳去在淀粉瓊脂平皿上四區劃線進行分離純化，28℃恒溫培養一周左右，觀察放線菌菌落特征。

6、將純化好的菌落轉入到斜面，4℃條件下進行保存。

三、抗菌譜的測定

1、挑取一個放線菌的菌落接種到含有250ml淀粉液體培養基的三角瓶，28℃恒溫培養一周左右。

2、將2ml培養8h的大腸桿菌分別加到200ml滅菌的牛肉膏蛋白胨培養基中混合均勻，每培養皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培養皿中均勻放入4個牛津杯，每個牛津杯中加入1ml放線菌發酵培養液。培養皿放入37℃培養箱恒溫培養12h。

4、測量抑菌圈的大小。

四、發酵

1、配制種子培養基

蔗糖22.5g，黃豆粉12.5g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000ml，PH值7.2,121℃滅菌20min。

2、配制發酵培養基

蔗糖45g，黃豆粉25g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣3g，蒸餾水1000ml，PH7.2。121℃滅菌20min。

3、種子液的制備

將試管斜面菌種轉管活化，28℃培養7天后，以接種取一環孢子轉入裝有50ml種子培養基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-1 培養4天。

4、發酵培養

以6%的接種量將種子液轉接入裝有50ml初始發酵培養基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-

1培養4天。

5、活性檢測

發酵液經4000r/ min-1 離心15min，取上清，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、發酵液經4000r/ min-1 離心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例進行萃取。

2、活性檢測

將萃取液濃縮，杯碟法測定抗菌活性（同三）。