第一篇：周四第三組《利用蠶豆微核技術檢測牙膏安全性》

利用蠶豆微核技術檢測牙膏安全性

前言 ．．

牙膏是現代日常生活中很容易接觸到的化學物品。日前，國家質檢總局發出《關于禁止用二甘醇作為牙膏原料的公告》，要求今后牙膏生產禁用二甘醇。但是我們還不能確定市場上銷售的牙膏不再含有二甘醇。據了解，被檢測出含有二甘醇的牙膏有田

七、黑妹、美加凈等品牌的相關品種。其他品牌的牙膏是否存在同樣的問題呢？藥膏中其他化學物品是否也會對人體產生影響呢？基于這兩點考慮, 我們應用蠶豆根尖細胞微核測定技術并結合生物量分析, 通過試驗以不同濃度的處理液作梯度對照, 測量統計蠶豆種子生物量變化和根尖細胞微核率, 探討某品牌牙膏的安全性狀況。

原理 ．．

微核 是染色體畸變類型之一, 往往是細胞經輻射或化學藥物的作用, 由有絲分裂后期散失著絲粒的染色體片斷產生的。微核的產生與細胞的內外環境有關, 主要是由于各種具有損傷性的理化因子影響了染色體的結構與功能, 使胞內 DNA 的復制和細胞分裂受到干擾以及紡錘體的形成出現了障礙。

微核試驗是以動植物為材料利用細胞生物學方法觀察其出現的微核率來表示材料受遺傳損傷程度的一種檢測遺傳毒物的方法, 也是遺傳毒理學常用的試驗方法之一。微核率是指生物材料經細胞生物學方法制片后, 在顯微鏡下觀測 1 000 個細胞當中微核細胞所占的比率, 也可以是以每個細胞當中含微核數的平均值來計算。

材料，儀器及用具和試劑 ．．．．．．．．．．．

材料：

蠶豆果實

試劑：

(1)固定液。甲醇 ?冰醋酸按體積比 3 ?1 配制, 現配現用。

(2)70%的乙醇。量取 70 mL 無水乙醇于 100mL 容量瓶中, 加蒸餾水定容至 100 mL。(3)6 mol/ L 的鹽酸。取 185.6 mL 濃鹽酸(分析純, 密度為 1.18 g/ mL)于 1 L 容量瓶中, 加蒸餾水定容即可。

(4)卡寶品紅(堿性品紅)染液。原液 A: 稱 3 g堿性品紅溶于 100 mL 70% 乙醇中;原液 B: 取 10mL 原液 A 加入 90 mL 5% 的苯酚水溶液中;染色液: 55 mL 原液 B 加入 6 mL 冰醋酸和 6 mL 37%的甲醛。

儀器：

顯微鏡，鑷子，載玻片，蓋玻片，吸水紙，培養皿，試管，解剖盤，標簽紙，刀片等。

實驗內容 ．．．．

（1）浸種催芽: 將蠶豆種子放入盛有自來水的燒杯中, 置室溫條件下 浸泡 20~ 30 h, 此期間換水 2~ 3 次, 待種子吸脹后, 用濕毛巾松包裹置解剖盤內, 保持適宜的濕度, 待種子發芽，待種子初生根露出 2~ 3 mm。

（2）染毒:選取發育良好, 根尖長短、粗細一致的種子, 每 5 粒為一個處理組, 吸干表面水分, 稱鮮重, 放入盛有受試物的培養皿中, 使液體浸泡根尖（液體配制為5個濃度梯度）。

（3）恢復培養: 將處理的種子用蒸餾水浸洗 3次, 每次 3~ 5 min, 洗凈后的種子放入新鋪

好濕脫脂棉的培養皿內, 于保持適度的培養條件使根尖細胞恢復 24 h。

（4）根尖細胞固定: 將恢復后的種子, 吸干表面水分, 稱鮮重后從根尖頂端切下1 cm 長的幼根用固定液(甲醇 ?冰醋酸= 3 ：1, 體積比)固定 24 h, 置體積分數為 70% 的乙醇中于 冰箱中保存備用。

（5）酸解染色: 固定好的根尖用蒸餾水浸洗兩次, 然后用 6 mol/ L 的鹽酸在室溫解離 8~ 12 min,直至根尖軟化, 吸去鹽酸, 用蒸餾水浸洗兩次后, 浸于水中。

（6）染色制片: 將幼根放在擦凈的載玻片上, 用解剖針截除根冠區, 截留下 1 mm 左右的根尖分生區, 滴一滴卡寶品紅, 染色 5~ 8 min;加蓋一清潔的蓋玻片, 注意不要有氣泡, 再在蓋玻片上加一小塊濾紙, 輕輕敲打壓片。

（7）鏡檢: 將制片先置顯微鏡低倍鏡下, 找到分生組織區細胞分散均勻、膨大、分裂相較多的部位,轉到高倍鏡(物鏡 40 ?)下進行觀察。凡是在主核大小的 1/ 3 以下, 并與主核分離、著色與主核相當或稍淺的圓形、橢圓形、不規則形小核即為微核。每個根尖觀察約 1 000 個細胞, 計錄微核細胞數。觀察計數時將載玻片沿一個方向移動, 不回看, 以避免細胞被重復計數。

(8)計算微核率, 并進行統計學處理。計算公式如下:(帶有微核的細胞數/ 觀察細胞總數)1 000;生物量用處理前和處理后的鮮重表示;污染指數 = 樣品實測 MNF平均值 / 對照組(標準水)MNF平均值。

實驗預期結果 ．．．．．．

蠶豆根尖在2%，4%，6%，8%，10%濃度的牙膏侵染液培養48小時，蠶豆根尖鏡檢都會出現微核，且微核率隨著牙膏侵染液濃度增大而增大。

文獻 ．．

【1】陳光榮, 李明, 金波, 等.利用蠶豆根尖的微核技術監測青山湖污染的研究[ J].中國環境科學, 1985, 5(4): 2~ 7.(他們從1983年開始利用蠶豆根尖細胞的微核技術檢測了農藥和誘變劑損傷,1984年又進一步研究篩選出了對農藥更為敏感的蠶豆品種——松滋青皮豆.本文是在原有工作基礎上,用蠶豆根尖細胞的微核技術,直接監測湖北省黃石市青山湖的污)

【2】李宏.環磷酰胺誘發蠶豆根尖細胞染色體畸變的分析[ J].渝州大學學報, 1998, 9(3): 28~ 33.(以蠶豆根尖為實驗材料，研究了環磷酰胺對間期微核細胞及染色體畸變的作用，并對環磷酰胺的誘變機理進行了分析，提出了環磷酰胺可能通過激發細胞內的自由基反應而導致染色體畸變的觀點。)【3】 馬軍，鄭琳等，植物微核在環境污染檢測中的應用 【J】自然學報 2007-10-15。（利用這種技術可以檢測出有害氣體、重金屬、有機物等對生物體遺傳物質的影響程度,目前已經被廣泛地應用于環境中大氣、土壤、水體等污染的監測。該文對植物微核技術的原理及其在環境污染監測中的應用作了概述。）

【4】趙吉平，王桂英，劉芳8@羥基喹啉誘發蠶豆根尖細胞異常性的研究〔J〕8 遺傳，1996,13

（6)；5-10(本研究采用0.002mol/L和0.004mol/L的8-羥基喹啉(下稱8-HQ)處理1.5—2cm的蠶豆根尖3.5小時,給以0—20小時的不同恢復生長期。以低溫(4℃以下)處理24小時的相同材料為對照。比較了兩種方法在染色體制片中作為預處理方法的效果。結果發現:(1)8-HQ不能有效地積累中期細胞和使染色體凝縮;(2)嚴重抑制細胞的生長;(3)降低有絲分裂指數(MI);(4)誘發較高頻率的微核細胞;(5)產生較高頻率的雙核細胞;(6)導致多種類型的染色

體畸變以及其他異常性。研究表明,8-HQ 是一種有效的細胞板抑制劑和誘發染色體數目和結構變異較強的誘變劑。)

【5】王娜 蠶豆微核技術監測有機廢水的遺傳毒性【J】生物技術世界 2012-01-15（用蠶豆根尖細胞微核技術研究有機廢水對蠶豆根尖細胞的遺傳損傷效應。結果表明:不同稀釋梯度的實驗室廢水對蠶豆根尖細胞的有絲分裂指數、微核千分率及污染指數影響不同,并存在一定的差異。）

【6】 王英彥.蠶豆根尖細胞微核檢測技術的現狀[ J].環境科學, 1989, 10(4): 661.（蠶豆根尖細胞微核檢測技術(VMT)是繼紫露草四分孢子微核檢測方法,是國內較為普遍用于研究和監測環境致突變物(致癌物)的高等植物間期體細胞遺傳檢測系統。從方法學到實際應用等各方面已積累較多資料）

【7】] 段昌群, 王煥校.重金屬對蠶豆的細胞遺傳學毒性作用和對蠶豆根尖微核技術的探討

[J].植物學報, 1995 , 37(1): 14-24.(對蠶豆根尖細胞遺傳學毒性順序為Ｈｇ２＋ ＞ Ｃｄ２＋ ＞ Ｐｂ２＋ ＞ Ｚｎ２＋ ＞ Ｍｎ２＋。經綜合分析，３ 個參數在不同劑量范圍下相關性程度有很大的差異。認為蠶豆根尖微核技術檢測危險化學品和監測環境污染時取得可靠結果的條件是：受檢物質在檢測條件下不嚴重抑制細胞分裂和ＣＡＦ和ＭＣＮＦ呈正相關。)

【8】施金蓮, 馬桂芝, 蔣葵.化學染發劑和冷燙精的毒性及對人體健康的影響.環境與健(本文通過化學染發劑和冷燙精對大白鼠骨髓多染紅細胞、毛囊細胞的微核實驗及人群健康影響調查,結果表明化學染發劑、冷燙精具有較強致突變作用,兩者同時使用致突變明顯增強,并提出研制高效無毒染發劑和加強防護的重要性。)

【9】方宗熙.中美合作研究用植物細胞微核監測環境污染的報告.山東海洋學院學報, 1981;11(1): 1（工業發展經常引起環境污染。環境的污染物對人民健康一般都有不良的影響,引起疾病,甚至可能致癌。因此在工業發展的過程中,對環境的污染情況應該隨時進行監測,發現問題,及時處理,以避免人民受害。監測環境污染有幾種方法,如化學方法、物理方法、生物學方法等。在生物學方法中,大約在五年前,美國西伊里諾大學馬德修教授根據環境污染會引起染色體畸變而形）

【10】曹軍建 中國環境科學理論研究及發展【J】環境科學 1993-08-29

（主要介紹20年來中國環境科學基本理論研究及其發展。即大氣和水環境科學與環境生態學和環境管理學主要理論研究及其發展。）