第一篇：植物生物技術

我對轉基因技術的認識與體會

園藝111班

蔡朝途

1131100916

轉基因技術（Genetically Modified，簡稱GM），是指運用科學手段，將基因片段轉入特定生物中，并最終獲取具有特定遺傳性狀個體的技術。

轉基因技術的理論基礎來源于分子生物學。基因片段的來源可以是提取特定生物體基因組中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被轉入特定生物中，與其本身的基因組進行重組，再從重組體中進行數代的人工選育，從而獲得具有特定的遺傳性狀個體。該技術可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育出新品種。人們常說的“遺傳工程”、“基因工程”、“遺傳轉化”均為轉基因的同義詞。

20世紀80年代末轉基因植物在美國問世至今，該項技術正以日新月異的速度迅猛發展，逐漸走入了人們的生活。人們認為轉基因技術可以在一定程度上通過科學技術手段讓其他生物、植物朝著對人類有利方向發展的技術。特別是遺傳學創立后近百年的轉基因育種則是采用人工雜交的方法，進行優良基因的重組和外源基因的導入而實現遺傳基因的改良。但是在過去的幾千年內我們的祖先對農作物遺傳基因的改良就一直不斷的突破著和改良著，那時轉基因的方式主要是對農作物在自然條件下突變產生的優良基因和重組體的農作物的選擇和利用，通過人為的和自然的方式來積累優良遺傳基因。因此我們可以說現在的轉基因技術與過去的傳統技術相比，他們的本質都是通過獲得優良基因人為的或者自然的進行基因的遺傳改良。但是他們又有本質上的區別：傳統技術只能在生物種內個體間實現基因轉移，而轉基因技術所轉移的基因則不受生物體間親緣關系的限制；傳統的雜交和選擇技術一般是在生物個體水平上進行，操作對象是整個基因組，所轉移的是大量的基因，不可能準確地對某個基因進行操作和選擇，對后代的表現預見性較差。而轉基因技術所操作和轉移的一般是經過明確定義的基因，功能清楚，后代表現可準確預期。所以我們可以說現在轉基因技術是對傳統轉基因技術的發展和補充，我們將兩者緊密結合，可以大大地提高動植物品種改良的效率。轉基因技術的發展，為人們帶來了新的福音，但新的問題也隨之涌現，對于

轉基因技術走進生活這一事件，質疑聲不絕于耳。我們應該對其一分為二地看，既有利也有弊，人們應該客觀地看待其利弊，將其作為一把雙刃劍來使用。

凡事都有兩面性，對于轉基因技術我們不能全部的否定也不能全部的肯定。從利的方面來說轉基因技術對人類有百利而無一害。自1983年世界第一例轉基因植物——煙草問世以來僅20多年的時間里，轉基因植物的研究和應用就已經得到了迅猛的發展，已有近1000例轉基因植物被批準進入田間試驗，涉及的植物物種有50余個，已有48個轉基因植物品種被批準進行商業化生產。轉基因技術有如下優勢：第一，增加產量。在傳統作物中植入快速生長基因后，農作物的特性得到了改善，不僅可縮短生長期而且還增加作物產量，使土地得到了最大限度的充分利用，也使人類從此告別缺糧的歷史。第二，改良品質。植入不同的基因片段，可使食品的外觀、味道、口感甚至營養成分完全改變，將使人類的食物進入一個隨心所欲的新時期。例如轉基因大米是通過人為改變大米的基因使其擁有更好的性狀的一種稻子結出來的大米。它可能是更具有抗澇、抗旱、抗蟲害、增加了大米里的蛋白質含量。第三，增強抗逆性。通過基因改變，使傳統作物具備了抵御病蟲害的能力，因此可大大減少農藥和殺蟲劑的使用，防止環境污染；通過改良基因，人類能讓作物具有耐寒、耐熱、耐干旱或耐澇的不同特性，從而適應不同的生長環境，農作物將徹底告別靠天種植的歷史。例如20世紀80年代初期由我國學者周光宇提出的，我國目前推廣面積最大的用花粉管通道法培育出來的轉基因抗蟲棉，是對轉基因技術對人類有利的最好的證明。該轉基因抗蟲棉最大優點是不依賴組織培養人工再生植株，技術簡單不需要，裝備精良的實驗室，常規育種工作者易于掌握。

轉基因技術給人類帶來福音的同時也帶來了危害。如：1999年，美國康奈爾大學的研究者約翰?洛希在英國《自然》雜志上發表報告，用涂有轉Bt基因玉米花粉的葉片喂養斑蝶，導致44%的幼蟲死亡。2004年，瑞士聯邦技術研究院踢球植物學研究所海爾比克教授發現，先正達研發的轉基因Bt-176玉米中，用來毒殺歐洲玉米螟的Bt毒素，無法分解，最終毒死了奶牛。2005年5月22日，英國《獨立報》又披露了知名生物技術公司“孟山都”的一份報告，以轉基因食品喂養的老鼠出現器官變異和血液成份改變的現象。2005年的11月16日，澳大利亞聯邦科學與工業研究組織（CSIRO）發表的一篇研究報告顯示，一項持續

4個星期的實驗表明，被喂食了轉基因豌豆的小白鼠的肺部產生了炎癥，小白鼠發生過敏反應，并對其他過敏源更加敏感，并據此叫停了歷時10年、耗資300萬美元的轉基因項目。2006年，俄羅斯科學院高級神經活動和神經生理研究所科學家伊琳娜?艾爾馬科娃博士研究發現，食用轉基因大豆食物的老鼠，其幼鼠一半以上在出生后頭三個星期死亡，是食用非轉基因大豆老鼠死亡率的6倍。2007年，在奧地利政府的資助下，澤特克教授及其研究小組對孟都山公司研發的“轉基因抗除草劑玉米NK603和轉基因抗蟲玉米MON810的雜交品種”進行了實驗。在經過長達20周的觀察之后，發現轉基因產品影響了小鼠的生殖能力,《俄羅斯科學家證實轉基因食物是有害的》。2007年10月和11月，美國《紐約時報》等媒體報道，經過長期周密跟蹤觀察，發現有兩種轉基因玉米種植導致傷害蝴蝶生存，對生態環境安全的威脅程度已經超出可接受水平。為此，歐盟已經做出了初步決定、禁止該轉基因玉米的種子銷售使用。2008年，美國科學家也證實了長時間喂食轉基因玉米，小白鼠的免疫系統會受到損害，該研究成果發表在同年《農業與食品化學》雜志上。2009年12月，法國科學家發表了新的研究結果并證實，孟山都公司出產的轉基因玉米對大鼠的肝臟和腎臟具有毒性，這些副作用是性別依賴的、也時常是劑量依賴的；其他副作用也見于大鼠的心臟、腎上腺、脾和造血系統。2010年4月16日，俄羅斯科學家公布了新的獨立研究成果，進一步證明倉鼠食用轉基因大豆三代就會絕種！同時轉基因技術的發展打破了自然發展的規律，或多或少破壞了生物界領域的和諧。轉基因技術對生態系統和人類健康存在危害：第一，基因飄逸即基因流或基因水平轉移到其他近緣物種。如加拿大發現轉基因油菜與野生近緣種間發生過交叉雜交,從而形成所謂超級雜草，導致野生等位基因的丟失，從而造成遺傳多樣性的喪失，影響生態平衡。第二，轉基因植物產生的殺蟲毒素可由根部滲入土壤，某種單一的轉基因植物的大量種植可能會對土壤生物及微生物和環境產生不良影響，因而減少本地區物種的多樣性。第三，轉基因產品的毒性，能引起人的過敏反應。1995 年發現美國國際先鋒公司轉巴西堅如果基因的大豆能引起人過敏，在轉花生基因的作物中也有過過敏現象。第四，轉入植物的標記基因(特別是抗生素基因),有可能通過某種途徑擴散到其他微生物中并使其產生新的抗藥性，導致超級病原菌的產生。

總之，轉基因技術的發展是不可逆轉的。然而,它的發展總會伴隨著各種利

弊問題。我們必須以一種謹慎的態度來看待轉基因技術，轉基因技術的應用對人類發展而言前景是廣闊 的，影響也是深遠的。我們應采取積極的態度對待轉基因技術的開發和利用，坦然面對在對轉基因技術運用過程中帶來的是與非，在對轉基因技術充分重視的同時加快安全性技術的研究，讓轉基因技術在促進人類生存和發展中發揮重大作用，帶來科技領域和生物界領域的重大飛躍，讓轉基因技術真正造福于人類。

參考文獻

(1)文平，王仁祥.轉基因研究進展[J].生物學教學，2005.12

(2)Russia says genetically modified foods are harmful

(3)劉松鑫.基因重組技術與倫理研究[J].攀枝花學院學報.2010.6,27

(4)陳學敏.轉基因技術與生物多樣性的沖突[J].華中師范大學學報.2010.11

(5)劉松鑫.基因重組技術與倫理研究[J]攀枝花學院學報。

第二篇：園藝植物生物技術

園藝專業推廣碩士《園藝植物生物技術》試題

一．名詞解釋

1．基因組：某一生物包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子。2．RT-PCR：一是反轉錄PCR的縮寫，即通過聚合酶鏈式反應，將RNA鏈逆轉錄成互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。二是實時PCR的縮寫，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。3．Northern blot：是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達的方法，通過Northern blot可以檢測到細胞在生長發育特定階段或者脅迫或病理環境下特定基因表達情況。

4．AFLP：擴增片段長度多態性。是基于PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。

5．藍白斑篩選：藍白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。野生型大腸桿菌產生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。有色物質可以使整個培養菌落產生顏色變化，可用于菌落鑒定和篩選。

二．選擇題

1.B 2.ABD 3.B 4.BD 5.A 6.BC 7.D 8.ABCD 9.ABC 10.BCD

三．簡答題

1.簡述植物農桿菌介導的植物遺傳轉化過程。

答：農桿菌介導的植物遺傳轉化是以農桿菌為媒介，將目的基因通過載體上的特定區域導入細胞，并整合到染色體中。主要過程為：①分離目的基因片段；②將目的片段鏈接到克隆載體上，形成重組DNA分子；③將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞進行增殖；④從細胞中篩選重組子；⑤提取已經擴增的基因，進一步分析研究；⑥將目的基因克隆到表達載體，一般采用雙元載體；⑦利用表達載體轉化農桿菌；⑧利用農桿菌轉化植株，常用的方法有原生質體法、真空滲入法和蘸花法3種。

2.列舉基因工程中常用的工具酶。答：基因工程中常用的工具酶有：

①限制性核酸內切酶：是細菌產生的一類能識別和切割雙鏈DNA分子內特定的堿基順序的核酸水解酶。

②DNA連接酶：將兩段DNA分子拼接起來的酶。③DNA聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。

④逆轉錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶，這是一種有效的轉錄RNA成為DNA的酶，產物DNA又稱互補DNA。

⑤末端脫氧核糖核酸轉移酶：將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端。⑥堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基團。⑦依賴DNA的RNA聚合酶：識別特異性啟動子，RNA轉錄。3.簡述SSR標記原理和主要過程。

答：SSR即微衛星DNA又叫簡單重復序列，指的是基因組中由1～6個核苷酸組成的基本單位重復多次構成的一段DNA。微衛星的突變率在不同物種、同一物種的不同位點和同一位點的不同等位基因間存在很大差異，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因而可以根據這兩端的序列設計一對特意引物，通過PCR技術將其間的核心微衛星DNA序列擴增出來，利用電泳分析技術就可獲得其長度多態性。

主要過程：①反應體系，包括模板DNA、SSR引物、10×PCR緩沖液、dNTP、Tap 酶和ddH2O；②反應過程包括預變性、變性、退火、延伸，在PCR儀上進行；③將PCR產物在測序電泳儀上用5%聚丙烯酰胺凝膠分離，DNA染色采用銀染法。④數據分析，可用Quantity One軟件統計，再用NTSYS軟件計算出遺傳相似性系數，用UPGMA法進行聚類分析構建聚類圖。4.簡述改良CTAB法提取園藝植物DNA的原理及主要過程。

答：CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中，CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，但不能沉淀核酸，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。主要過程：

① 稱取植物組織約100-200mg，加適量液氮，研磨至組織破碎成粉末狀，迅速轉入2mL離心管。

② 在離心管中加入1mL 65℃預熱的1.5×CTAB提取液(100mmol/L的Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L的EDTA，pH8.0，1.4mol/L的NaCl，4%的β-巰基乙醇)，放至65℃水浴30min，其間輕搖3次以混勻反應液。

③ 水浴后取出離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿：異戊醇(24﹕1)混合液，輕輕上下顛倒混勻，室溫下靜置15min后，于10000 r/min離心3min，取上清液。

④ 將上清液移至新的離心管，加入0.7倍體積的冷凍異丙醇，顛倒混勻后放置15min，10000 r/min離心5min，棄上清液。

⑤ 用75%的乙醇清洗 3次，沉淀為白色透明狀，用濾紙條吸干殘留乙醇，在超凈工作臺上無菌風干后，將DNA溶于 50μL 超純水中。5.簡述PCR反應中引物設計原理。答：PCR反應中引物設計原理為：

①選擇合適的靶序列：設計引物之前，必須分析待測靶序列的性質，選擇高度保守、堿基分布均勻的區域進行引物設計。

②長度：一般來說，寡核苷酸引物長度為15-25bp。

③Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，盡可能保證上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相對偏低，則可以使引物長度稍長，而保證一定的退貨溫度。④G+C含量：有效引物中的G+C含量一般為40%-60%。

⑤堿基的隨機分布：引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不應超過3個連續的G或C。

⑥引物末端：只有引物的3’端與模板結合，PCR才能進行，所以3’端最好是G或C。

⑦引物自身：引物自身不存在連續4個堿基以上的互補序列，否則會影響到引物與模板之間的結合，尤其避免3’端的互補。

⑧引物之間：上下游引物之間盡量少的存在互補序列，否則上下游引物退火結合，將影響到PCR的擴增效率。6.簡述同源序列法克隆目的基因的主要過程。

答：利用同源序列法快速克隆基因的基本思路是依據基因序列的高度保守區域，設計特異性的簡并引物，通過PCR擴增基因組DNA或cDNA，獲得所要分離的基因序列，多用于抗病基因的分離、克隆。主要過程為：①提取基因組DNA；②根據已知基因保守區域的核酸序列特征，運用軟件設計引物并合成；③以基因組DNA為模板進行PCR擴增；④回收PCR擴增的目的片段；⑤將目的片段鏈接載體并轉化大腸桿菌；⑥測序并進行序列分析。四． 綜合題

根據你所學，談談你對轉基因植物的看法。

答：自1983年美國在世界上首次獲得轉基因煙草以來，植物轉基因技術得到了迅速發展，在世界范圍內得到了廣泛的應用。目前，轉基因技術已經成熟，轉基因作物已進入產業化階段，而且種植面積逐年擴大，呈直線上升趨勢。植物轉基因技術主要應用于農業、生物和醫學等領域，進行植物品種的改良、新品種的培育以及作為生物反應器生產生物藥物和疫苗等。世界上已通過轉基因技術培育出許多產量高、品質好、抗性強的農作物新品種，生物技術藥品已應用到醫藥、保健食品和日化產品等各個方面，生物制藥產業已成為最活躍、進展最快的產業之一。因此，人們將以轉基因技術為核心的生物技術上的巨大飛躍譽為第二次“綠色革命”。

植物轉基因技術的應用十分廣泛：（1）植物品質改良、新品種的培育，以滿足人類不斷增長的物質生活需要：植物轉基因技術可高效、快速提高糧食作物、蔬菜、林木樹種和花卉草種的產量、品質和抗耐性，為培育高產、高抗、多抗、優質的新品種提供了科學的手段。（2）醫藥研究，為人類健康服務：轉基因技術可以把植物作為“生物反應器”，進行藥物蛋白、工業用酶、糖類、脂類等一些有益次生代謝產物的生產，具有成本低、周期短、效益高和安全性好的特點。（3）能源開發，促進世界經濟的可持續發展：隨著世界經濟的發展，加速了對石油等有限的不可再生礦質能源的消耗，世界各國均面臨著能源枯竭的嚴重問題。（4）減少環境污染，保護人類賴以生存的自然環境：轉基因技術可以生產許多抗性強、適應性廣的植物，最大限度地利用土地資源，增加全球植被的覆蓋率，減少水土流失和土地沙漠化，減少因CO2增加引起的溫室效應。抗病、抗蟲轉基因作物的廣泛種植，可以減少農藥的使用量。轉基因植物可對土壤中的有毒污染物進行高效吸收或生物降解，通過植物修復系統使受污染的環境得到修復。

總之，轉基因植物的廣泛種植可以顯著降低農業生產成本，提高農業生產效率；可以有效緩解人類的糧食問題、能源問題；可以大大提高人類的生活質量和健康水平；可以有效增加可利用的土地資源，擴大綠地植被面積，減少土地的沙漠化和鹽堿化，減少環境污染，保護生態環境。目前，轉基因技術及其轉基因植物已廣泛應用于農業、醫藥、食品工業、畜牧業等各個領域，其經濟效益、生態效益和社會效益都是巨大的。植物轉基因技術是一種技術創新，是現代科技革命的一個重要方面，在農業、生物、醫學、食品、環保和能源領域具有廣闊的發展前景。

第三篇：《園藝植物生物技術》實驗教案

實驗一 現代生物技術實驗室與實驗儀器

一、實驗目的

實驗室和實驗儀器是開展現代生物技術研究的基礎平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學生知識結構完整性的重要體現。通過現場參觀和老師講解加深同學們對現代分子生物學實驗室的規劃與布局及常用儀器設備的主要功能的認識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統等關鍵儀器的使用方法。

二、實驗場所選擇及實驗內容

園藝學院植物分子生物技術實驗室與開展現代生物技術研究直接相關的實驗室分工與布局和主要相關儀器：如與組織培養有關的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養室等；與分子生物學有關的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統等。

三、實驗方法與步驟

1、相關背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術如分子標記、細胞和組織培養等操作過程進行回顧，重要指出每個環節要用到的必備儀器的作用、性能指標、操作注意事項及儀器選購中應注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現代生物技術實驗室的布局及功能分區情況；針對每個分區的重要儀器進行講述，結束時對所有參觀內容進行簡要總結，并回答同學們的提問。

四、實驗注意事項

實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學們認真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據參觀內容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。

2、一個現代化生物技術實驗室應具備的基本功能的必備儀器有哪些？實驗二 質粒DNA的提取、純化及檢測

一、實驗目的

質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質粒的抽提過程，應掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實驗原理 在pH 12.0-12.6堿性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質粒DNA提取有關試劑。

液氮、及DNA提取有關試劑。

四、實驗方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實驗步驟

1、取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養基上劃線37℃過夜培養。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養基中，37℃搖床-250r/min過夜培養。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預冷的溶液I，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質充分沉淀（溶液III為中和液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存備用。

10、取制備的質粒DNA 1-2ul，加適當loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質，操作時應注意防護，盡量減少臺面污染。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

3、質粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型。

六、思考題

簡述質粒DAN提取的步驟。

實驗三 PCR技術

一、實驗目的

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統，是分子克隆技術中常用技術之一。PCR具有反應快速、靈敏、操作簡便等優點，已廣泛應用于分子生物學的各個領域。通過本實驗應掌握PCR原理，學習PCR操作過程。

二、實驗原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板結合的特異性。反應分為變性、退火、延伸三步，經過一定的循環，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質粒或轉基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關試劑。

四、實驗方法與步驟

1、調整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應循環條件設置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍，混勻，短暫離心，取15ul反應產物點樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實驗注意事項

1、引物設計應具有特異性，依靠引物設計軟件進行引物設計；引物分裝成多管，不宜反復凍融多次；

2、PCR反應的各種成分不能遺漏，操作應戴手套，冰上操作；

3、根據引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設定PCR循環條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產物時出現拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術的原理和步驟。

第四篇：園藝植物生物技術 試卷（模版）

一、將下面詞組相對應的中文譯成拉丁文或拉丁文譯成中文。

1.Propagation

2.liquid medium

3.antibody

4.vitrification

5.SSH

6.克隆

7.接種

8.非對稱融合 9.RT-PCR

10.轉錄后水平的基因沉默

二、判斷下列各題正確與否，正確的填“Y”錯誤的填“N”。

1.培養基滅菌后其Ph值會略微降低。

2.胚狀體是植物組織培養中的專門術語，是指由體細胞形成的、類似于生殖細胞形成的配子胚發育過程的胚胎發生途徑。

3.組織培養的培養基多采用濕熱滅菌。

4.DNA電泳操作時要戴手套，是因為其中的EB是一種強致癌物和誘變劑。

5.DNA復制時，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。

6.可用作病毒鑒定的草本指示植物種類很多，常用的有藜科、茄科、豆科、十字花科、葫蘆科等植物。

7.花藥培養屬于小孢子培養，而花粉培養則屬于器官培養的范疇。

8.胚搶救主要是對由于營養和或生理原因，造成難以播種成苗或要發育中期階段就敗育或退化的胚進行中期離體培養。

9.理論上，從同一植物的根、莖、葉等不同器官中分離的DNA樣品它們之間不存在多態性；但分離Mrna再合成Cdna后可能存在豐富的多態性。

10.引起病毒類病害的病原包括病毒、類病毒、植原體、螺原體和韌皮部及木質部限制性細菌等。

11.常用的報告基因吸cat、GUS、Ant、Luc、AFLP等。

12.植物生物技術的外植體材料以離體操作為主。

13.載體的條件是：能在宿主細胞中能自我自制并能穩定保存，要有多個酶切位點，每種酶切位點最好只有一個，酶切后不損壞其自制能力及選擇標記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。

14.在DNA電泳中，分子量大的片段比分子量小的片段距負極更近。

15.DNA雙鏈中AT間形成的氫鍵比CG間少。

三、填空題：將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內，兩者用“，”隔開。

1.常見的啟動子有＿、＿、＿等。

2.進行胚搶時，就最終對胚搶救成活及成苗率影響大小而言，所利用的組織優劣順序是：＿、＿、＿、＿。

3.日前世界上有200多種植物成功地再生出單倍體植株，其中我國首先報道的有40多種。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。

4.可用于病毒及類病毒檢測的方法很多，主要有＿、＿、＿。

5.要判斷哪一個克隆中具有我們所需要的基因就需要對所得到的重組克隆進行篩選，篩選的方法主要有：＿、＿、＿等。

6.分子標記研究中應用最廣泛的DNA鑒定技術有＿、＿、＿等四種。

7.常用于植物組織培養的植物激素種類有＿、＿、＿等

8.目前尚無防治病毒病的有效藥劑，在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

9.轉基因在沉默的原因是多方面的，根據外源基因失活或沉默的分子機制，可將其分為三類：＿、＿、＿等。

10.園藝植物組織培養一般要經歷五個階級，即＿、＿、＿、＿、＿等。

11.在遺傳轉化的表達載體中通常構建有一些篩選基因或報告基因，如果實驗很成功，且檢測方法正確，則下列基因的作用效果應呈現的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

12.狹義的植物生物技術是指：在離體的條件下，對植物（細胞）進行遺傳改良或使其增殖的各種技術的總稱，包括＿＿和＿＿兩個大的層面。

13.迄今為止，已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍、蕃茄、柑橘等植物的原生質體再生植株中觀察到變異，再生植株產生的變異主要有＿、＿、＿、＿。

14.生命活動的各個進程都伴隨著不同基因的選擇開啟和關閉，基于這一基本的分子生物原理，現在已開發出許多克隆基因的方法，主要有＿、＿、＿、＿等。

15.常用的遺傳標記有______標記;______標記;_______標記和_______標記等四種不同水平的標記。

四、選擇題：從備選答案中選出正確的結果，正確答案是唯一的。

1.如果DNA一條鏈是5’-ATCG TACG GGTT-3’，則能與其互補配對的另一條鏈可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

2.植物病毒檢測可以用的方法有:（）

A：血清學檢測 B：PCR檢測 C：同工酶檢測 D：指示植物鑒定

3.可用于外植體消毒的方法有：()

A：酒精消毒 B：HgCl2消毒 C：NaClO消毒 D：NaCl消毒

4.原生質體融合的方式有：（）

A：對稱融合 B：非對稱融合 C：配子—體細胞融合 D：供受體融合5.常用的選擇標記基因有：（）

A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：熒光素酶基因

6.基本的PCR所需的試劑主要有：（）

A：兩側的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ 7.赤霉素的生理作用主要包括：（）

Ａ：誘導莖細胞的伸長 Ｂ：對形成層的細胞分化有影響 Ｃ：可以解除種子、塊莖、鱗莖等休眠 Ｄ：抑制衰老

8.基于現代生命科學的研究進展，下列可能是遺傳物質的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

9.園藝植物外植體脫除病毒的方法有：()A：熱處理脫除病毒 B：莖尖培養脫除病毒 C：微芽嫁接脫除病毒 D：高壓滅菌脫除病毒

10.影響原生質體分離的因素主要有：（）

Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態

11.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白質結構模型 B：RNA結構模型 C：DNA是遺傳物質 D：DNA雙螺旋結構

12.體細胞雜種的鑒定方法主要有：（）

A：形態學 B：細胞學 C：電子顯微鏡觀察法 D：遺傳標記

13.可以用于基因分離的方法有：（）

A：同源序列法 B：圖位克隆法 C：功能克隆法 D：差減雜交法

14.下列屬于現代生物技術研究的內容有:()

A：有性雜交 B：體細胞雜交 C：組織培養 D：基因克隆

15.目前分子標記在種質資源研究中的用途有：（）

A：繪制品種的指紋圖譜

B：種質資源的遺傳多樣性及分類研究 C：物種的起源與演化 D：種質資源的評價、鑒定與創新

16.單克隆抗體制備主要步驟有：（）

A：免疫注射 B：細胞融合 C：篩選 D：克隆化

17.如果RAPD分析時所選用的隨機引物的序列為5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虛線部分為500—1000 pb長的DNA區域，請分析其中能進行2的指數倍擴增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’

18.右下圖中剪刀所在位置是DNA分子上的某一酶的酶切位點，長方形是探針結合部位，試問1、2、3三種DNA樣品用該酶/探針組合進行RFLP分析能得到的雜交信號條帶數分別是：

A： 1、2、1 B：1、2、2 C：1、1、1 D：1、1、2 19.影響原生質體培養及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生質體來源 Ｂ：基因型 Ｃ：培養基 Ｄ：滲透壓調節劑

20.原生質體的應用主要有哪些：（）

Ａ：種質資源保存 Ｂ：原生質體融合 Ｃ：篩選突變體 Ｄ：遺傳轉化

五、簡答題：將下列各題的答案填在下面的方框內。

1.簡述PCR反應原理。

2.如果你是某單位的技術人員，現欲建一園藝植物組織培養實驗室，請簡述實驗室的布局及主要的儀器設備

3.闡述一下培養基的滅菌方法，滅菌時間。

4.體細胞雜種篩選與鑒定方法。

5.簡述常見啟動子有哪些？

6.簡述轉基因植物的鑒定方法。

六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內。

1.1、通過對生物技術的學習，談談生物技術在園藝科學中的應用與展望。

2.3、如果現已證明園藝植物的某一重要農藝性狀是單基因控制的質量性狀，且發現了一個與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標記。現有一傳統品種，此品種的其它性狀均十分優良，唯獨該性狀表現不佳，試論述如何應用現代生物技術的方法對該性狀進行改良？

3.2、談談體細胞雜種在育種中的應用。

一、將下面詞組相對應的中文譯成拉丁文或拉丁文譯成中文。

1.RT-PCR

2.轉基因植物

3.共培養

4.subtractive hybridization

5.基因組文庫

6.生物技術

7.抗原

8.SSH

9.培養基

10.RAPD

二、判斷下列各題正確與否，正確的填“Y”錯誤的填“N”。

1.限制性片斷長度多態性技術（RFLP）是用已知的限制性內切酶消化目標RNA，電泳印跡，再用RNA探針雜交并放射自顯影，從而得到與探針同源的RNA序列酶切后在長度上的差異。

2.植物生物技術的外植體材料以離體操作為主。

3.理論上，從同一植物的根、莖、葉等不同器官中分離的DNA樣品它們之間不存在多態性；但分離Mrna再合成Cdna后可能存在豐富的多態性。

4.植物原生質體分離時，常采用酶解的方法脫除細胞壁。

5.PCR擴增的引物為單鏈DNA片段。

6.常用的報告基因吸cat、GUS、Ant、Luc、AFLP等。

7.愈傷組織原上指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團薄壁細胞，在組織培養中，則指在人工培養基上由外植體長出來的一團有序生長的薄壁細胞。

8.DNA復制時，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。

9.Western雜交是以DNA或RNA為探針，檢測DNA鏈，用是于外源基因整合的鑒定及分析。

10.原生質體指采用機械或酶解法去掉了細胞壁的裸露的且具有活力的細胞。

11.載體的條件是：能在宿主細胞中能自我自制并能穩定保存，要有多個酶切位點，每種酶切位點最好只有一個，酶切后不損壞其自制能力及選擇標記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。

12.植物轉基因的方法主要有：大腸桿菌介導的轉化，PEG介導基因轉化、電擊法介導的轉化、基因槍法介導基因轉化及花粉管通道法介導基因轉化等。

13.易高溫分解培養基，往往不能進行高壓滅菌，通常采用過濾滅菌，即先將除去了這些不耐熱物質的培養基的其他成份經高壓滅菌后放置于無菌場所，若制備半固態培養基，須待培養基冷卻至60℃左右，再加入經過濾滅菌的各種不耐熱成分溶液，再混勻放置，分裝備用。

14.培養基滅菌后其Ph值會略微降低。

15.胚搶救主要是對由于營養和或生理原因，造成難以播種成苗或要發育中期階段就敗育或退化的胚進行中期離體培養。

三、填空題：將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內，兩者用“，”隔開。

1.園藝植物組織培養一般要經歷五個階級，即＿、＿、＿、＿、＿等。

2.原生質體的培養方法較多，大多數與細胞培養相似。主要的培養方法有三種，即＿、＿、＿。

3.分子標記研究中應用最廣泛的DNA鑒定技術有＿、＿、＿等四種。

4.可用于病毒及類病毒檢測的方法很多，主要有＿、＿、＿。

5.原生質體培養的前提之一是獲得大量有活力的原生質體，影響原生質體的主要因素有＿、＿、＿、＿。

6.農桿菌介導的遺傳轉化、基因槍介導遺傳轉化、原生質體介導的遺傳轉化、花粉管通道法、無選擇標記基因的轉化系統。

7.目前尚無防治病毒病的有效藥劑，在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

8.常用于植物組織培養的植物激素種類有＿、＿、＿等

9.植物轉基因研究的報告基因，在導入植物的24~48h內就可以檢測結果，從而可以對轉基因程序的有關因素進行快速評價和優化，檢測該基因的方法有＿、＿、＿。

10.德國植物生理學家HABERLANDT對植物組織培養的杰出貢獻在于提出了___理論；組織培養中外植體再生的兩種主要途徑是_______和_______。

11.＿是從Thermus aquaticus 菌提取的熱穩定性酶，分子量大約94kDa.12.在遺傳轉化的表達載體中通常構建有一些篩選基因或報告基因，如果實驗很成功，且檢測方法正確，則下列基因的作用效果應呈現的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

13.基因克隆是一系列技術的總稱，又稱為＿、＿、＿、＿等。

14.日前世界上有200多種植物成功地再生出單倍體植株，其中我國首先報道的有40多種。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。

15.園藝植物常用的脫病毒的途徑有＿、＿、＿、＿等方法。

四、選擇題：從備選答案中選出正確的結果，正確答案是唯一的。

1.可用于外植體消毒的方法有：()A：酒精消毒 B：HgCl2消毒 C：NaClO消毒 D：NaCl消毒

2.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白質結構模型 B：RNA結構模型 C：DNA是遺傳物質 D：DNA雙螺旋結構

3.如果RAPD分析時所選用的隨機引物的序列為5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虛線部分為500—1000 pb長的DNA區域，請分析其中能進行2的指數倍擴增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’ 4.基于現代生命科學的研究進展，下列可能是遺傳物質的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

5.影響原生質體培養及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生質體來源 Ｂ：基因型 Ｃ：培養基 Ｄ：滲透壓調節劑

6.植物轉化實驗中常用的報告基因主要有：（）

A：cat B:GUS C;Ant D:GFP

7.單克隆抗體制備主要步驟有：（）

A：免疫注射 B：細胞融合 C：篩選 D：克隆化

8.組織培養室的設計及其基本設備有：（）

Ａ：準備室 Ｂ：制備室 Ｃ：無菌操作室 Ｄ：培養室

9.下列屬于現代生物技術研究的內容有:()

A：有性雜交 B：體細胞雜交 C：組織培養 D：基因克隆

10.原生質體的應用主要有哪些：（）

Ａ：種質資源保存 Ｂ：原生質體融合 Ｃ：篩選突變體 Ｄ：遺傳轉化

11.原生質體融合的方式有：（）

A：對稱融合 B：非對稱融合 C：配子—體細胞融合 D：供受體融合12.基本的PCR所需的試劑主要有：（）

A：兩側的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ 13.植物病毒檢測可以用的方法有:（）

A：血清學檢測 B：PCR檢測 C：同工酶檢測 D：指示植物鑒定

14.園藝植物常見的病毒病有：（）

A：黃龍病 B：裂皮病 C：線蟲病 D：速衰病

15.如果DNA一條鏈是5’-ATCG TACG GGTT-3’，則能與其互補配對的另一條鏈可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

16.外源基因表達蛋白的檢測方法有：（）

A：ELISA B：Southern雜交 C：Western雜交 D：Northern雜交

17.園藝植物常用轉化方法有哪些：（）

A：農桿菌介導轉化 B：基因槍法 C：PEG轉化法 D：電泳法

18.胚搶救在園藝植物上的應用是多方面的，主要表現在：（）

Ａ：搶救發育不良或早期退化胚 Ｂ：克服遠緣雜交不親和 Ｃ：用于柑橘合子胚搶救 Ｄ：三倍體育種

19.生物技術對園藝科學發展的貢獻有：（）

A：脫毒與快速繁殖 B：花藥培養以及小孢子培養 C：胚搶救技術 C：細胞融合技術

20.影響原生質體分離的因素主要有：（）

Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態

五、簡答題：將下列各題的答案填在下面的方框內。

1.原生質體再生植株的遺傳變異及其利用。

2.簡述轉基因植物的鑒定方法。

3.簡述目前園藝植物生物技術的主要研究內容。

4.高溫易分解培養基如何滅菌？

5.簡述PCR反應原理。

6.闡述一下培養基的滅菌方法，滅菌時間。

六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內。

1.1、通過對生物技術的學習，談談生物技術在園藝科學中的應用與展望。

2.3、如果現已證明園藝植物的某一重要農藝性狀是單基因控制的質量性狀，且發現了一個與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標記。現有一傳統品種，此品種的其它性狀均十分優良，唯獨該性狀表現不佳，試論述如何應用現代生物技術的方法對該性狀進行改良？

3.2、談談體細胞雜種在育種中的應用。

一、將下面詞組相對應的中文譯成拉丁文或拉丁文譯成中文。

1.基因組文庫

2.RFLP

3.培養基

4.transcriptional gene silencing

5.Anther culture

6.subtractive hybridization

7.簡單序列重復

8.antibody

9.接種

10.CAPS

二、判斷下列各題正確與否，正確的填“Y”錯誤的填“N”。

1.植物原生質體分離時，常采用酶解的方法脫除細胞壁。

2.可用作病毒鑒定的草本指示植物種類很多，常用的有藜科、茄科、豆科、十字花科、葫蘆科等植物。

3.載體的條件是：能在宿主細胞中能自我自制并能穩定保存，要有多個酶切位點，每種酶切位點最好只有一個，酶切后不損壞其自制能力及選擇標記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。

4.DNA復制時，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。

5.易高溫分解培養基，往往不能進行高壓滅菌，通常采用過濾滅菌，即先將除去了這些不耐熱物質的培養基的其他成份經高壓滅菌后放置于無菌場所，若制備半固態培養基，須待培養基冷卻至60℃左右，再加入經過濾滅菌的各種不耐熱成分溶液，再混勻放置，分裝備用。

6.在DNA電泳中，分子量大的片段比分子量小的片段距負極更近。

7.原生質體指采用機械或酶解法去掉了細胞壁的裸露的且具有活力的細胞。

8.PCR擴增的引物為單鏈DNA片段。

9.花藥培養屬于小孢子培養，而花粉培養則屬于器官培養的范疇。

10.胚狀體是植物組織培養中的專門術語，是指由體細胞形成的、類似于生殖細胞形成的配子胚發育過程的胚胎發生途徑。

11.植物轉基因的方法主要有：大腸桿菌介導的轉化，PEG介導基因轉化、電擊法介導的轉化、基因槍法介導基因轉化及花粉管通道法介導基因轉化等。

12.DNA雙鏈中AT間形成的氫鍵比CG間少。

13.核酸分析包括直接對病毒基因組核酸電泳分析和根據已知的基因組核酸序列設計引物對病毒及類病毒基因組的特異性片斷進行PCR擴增，通過觀察特異性條帶而對這些病原進行鑒定。

14.柑橘珠心胚培可以有效脫除病毒，珠心胚是由珠心胚細胞形成的有性胚。

15.組織培養的培養基多采用濕熱滅菌。

三、填空題：將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內，兩者用“，”隔開。

1.農桿菌介導的遺傳轉化、基因槍介導遺傳轉化、原生質體介導的遺傳轉化、花粉管通道法、無選擇標記基因的轉化系統。

2.常用于植物組織培養的植物激素種類有＿、＿、＿等

3.原生質體培養的前提之一是獲得大量有活力的原生質體，影響原生質體的主要因素有＿、＿、＿、＿。

4.園藝植物常用的脫病毒的途徑有＿、＿、＿、＿等方法。

5.目前尚無防治病毒病的有效藥劑，在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

6.在遺傳轉化的表達載體中通常構建有一些篩選基因或報告基因，如果實驗很成功，且檢測方法正確，則下列基因的作用效果應呈現的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

7.日前世界上有200多種植物成功地再生出單倍體植株，其中我國首先報道的有40多種。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。

8.要判斷哪一個克隆中具有我們所需要的基因就需要對所得到的重組克隆進行篩選，篩選的方法主要有：＿、＿、＿等。

9.迄今為止，已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍、蕃茄、柑橘等植物的原生質體再生植株中觀察到變異，再生植株產生的變異主要有＿、＿、＿、＿。

10.狹義的植物生物技術是指：在離體的條件下，對植物（細胞）進行遺傳改良或使其增殖的各種技術的總稱，包括＿＿和＿＿兩個大的層面。

11.＿是從Thermus aquaticus 菌提取的熱穩定性酶，分子量大約94kDa.12.常見的啟動子有＿、＿、＿等。

13.常用的遺傳標記有______標記;______標記;_______標記和_______標記等四種不同水平的標記。

14.分子標記研究中應用最廣泛的DNA鑒定技術有＿、＿、＿等四種。

15.進行胚搶時，就最終對胚搶救成活及成苗率影響大小而言，所利用的組織優劣順序是：＿、＿、＿、＿。

四、選擇題：從備選答案中選出正確的結果，正確答案是唯一的。

1.目前分子標記在種質資源研究中的用途有：（）

A：繪制品種的指紋圖譜

B：種質資源的遺傳多樣性及分類研究 C：物種的起源與演化 D：種質資源的評價、鑒定與創新

2.基于現代生命科學的研究進展，下列可能是遺傳物質的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

3.園藝植物外植體脫除病毒的方法有：()

A：熱處理脫除病毒 B：莖尖培養脫除病毒 C：微芽嫁接脫除病毒 D：高壓滅菌脫除病毒

4.如果DNA一條鏈是5’-ATCG TACG GGTT-3’，則能與其互補配對的另一條鏈可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

5.影響原生質體分離的因素主要有：（）

Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態

6.基因分離克隆的基本步驟有：（）

A：實驗材料的選擇 B：目標DNA片段的制備與克隆 C：目的基因的純化

D：載體的構建

7.園藝植物常見的病毒病有：（）

A：黃龍病 B：裂皮病 C：線蟲病 D：速衰病

8.組織培養技術在園藝植物上的應用主要有：（）

Ａ：快速繁殖 Ｂ：提高育種效率，改良品種 Ｃ：脫毒 Ｄ：種質保存

9.下列屬于現代生物技術研究的內容有:()

A：有性雜交 B：體細胞雜交 C：組織培養 D：基因克隆

10.胚搶救在園藝植物上的應用是多方面的，主要表現在：（）

Ａ：搶救發育不良或早期退化胚 Ｂ：克服遠緣雜交不親和 Ｃ：用于柑橘合子胚搶救 Ｄ：三倍體育種

11.影響原生質體培養及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生質體來源 Ｂ：基因型 Ｃ：培養基 Ｄ：滲透壓調節劑

12.右下圖中剪刀所在位置是DNA分子上的某一酶的酶切位點，長方形是探針結合部位，試問1、2、3三種DNA樣品用該酶/探針組合進行RFLP分析能得到的雜交信號條帶數分別是：

A： 1、2、1 B：1、2、2 C：1、1、1 D：1、1、2 13.單克隆抗體制備主要步驟有：（）A：免疫注射 B：細胞融合 C：篩選 D：克隆化

14.如果RAPD分析時所選用的隨機引物的序列為5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虛線部分為500—1000 pb長的DNA區域，請分析其中能進行2的指數倍擴增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’

15.原生質體融合在植物遺傳改良上的應用主要表現在：（）

A：克服生殖障礙，創造新種質 B：轉移有利性狀，改善作物品質 C：作為育種中間材料，進一步用作物改良 D：轉移部分染色體，獲得非對稱雜種

16.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白質結構模型 B：RNA結構模型 C：DNA是遺傳物質 D：DNA雙螺旋結構

17.植物轉化實驗中常用的報告基因主要有：（）

A：cat B:GUS C;Ant D:GFP 18.常用的選擇標記基因有：（）

A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：熒光素酶基因

19.赤霉素的生理作用主要包括：（）

Ａ：誘導莖細胞的伸長 Ｂ：對形成層的細胞分化有影響 Ｃ：可以解除種子、塊莖、鱗莖等休眠 Ｄ：抑制衰老

20.可以用于基因分離的方法有：（）

A：同源序列法 B：圖位克隆法 C：功能克隆法 D：差減雜交法

五、簡答題：將下列各題的答案填在下面的方框內。

1.高溫易分解培養基如何滅菌？

2.試比較固體培養基和液體培養基的優、缺點。

3.闡述一下培養基的滅菌方法，滅菌時間。

4.體細胞雜種篩選與鑒定方法。

5.簡述常見啟動子有哪些？

6.如果你是某單位的技術人員，現欲建一園藝植物組織培養實驗室，請簡述實驗室的布局及主要的儀器設備

六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內。

1.2、談談體細胞雜種在育種中的應用。

2.3、如果現已證明園藝植物的某一重要農藝性狀是單基因控制的質量性狀，且發現了一個與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標記。現有一傳統品種，此品種的其它性狀均十分優良，唯獨該性狀表現不佳，試論述如何應用現代生物技術的方法對該性狀進行改良？

3.1、通過對生物技術的學習，談談生物技術在園藝科學中的應用與展望。

第五篇：《園藝植物生物技術》實驗教案

《園藝植物生物技術》實驗教案

實驗一 現代生物技術實驗室與實驗儀器

一、實驗目的

實驗室和實驗儀器是開展現代生物技術研究的基礎平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學生知識結構完整性的重要體現。通過現場參觀和老師講解加深同學們對現代分子生物學實驗室的規劃與布局及常用儀器設備的主要功能的認識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統等關鍵儀器的使用方法。

二、實驗場所選擇及實驗內容

園藝學院植物分子生物技術實驗室與開展現代生物技術研究直接相關的實驗室分工與布局和主要相關儀器：如與組織培養有關的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養室等；與分子生物學有關的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統等。

三、實驗方法與步驟

1、相關背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術如分子標記、細胞和組織培養等操作過程進行回顧，重要指出每個環節要用到的必備儀器的作用、性能指標、操作注意事項及儀器選購中應注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現代生物技術實驗室的布局及功能分區情況；針對每個分區的重要儀器進行講述，結束時對所有參觀內容進行簡要總結，并回答同學們的提問。

四、實驗注意事項

實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學們認真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據參觀內容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。

2、一個現代化生物技術實驗室應具備的基本功能的必備儀器有哪些？

實驗二 植物組織培養

一、實驗目的

植物組織培養是現代生物技術研究的重要技術手段，在原生質體融合、病毒脫除、離體快繁及遺傳轉化等領域發揮著不可替代的作用。胡蘿卜以其培養體系成熟、再生容易而被視為組織培養的理想外植體材料，本實驗通過胡蘿卜的組織培養使同學們掌握基本培養基的配制、滅菌及培養的基本技能。

二、實驗原理

基于1902年德國科學家哈勃蘭特（Haberlandt）提出植物細胞的全能性理論，即指已分化的細胞仍然具有分化發育成新個體的潛能。在適宜的培養條件下，植物的細胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。

三、主要儀器及試材

儀器：pH計、微波爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、培養室、三角瓶、封口膜、無菌濾紙、手術刀片、鑷子、酒精燈、記號筆等

試材：新鮮胡蘿卜，培養基配制所需相關試劑

四、實驗方法與步驟

（一）培養基母液的配制（小規模實驗應按比例減少，避免造成很大的浪費）：

1、大量元素(10倍液)：稱取下列藥品分別溶解定容到1升后，加到5升存儲瓶中。

KNO

395 g NH4NO3

82.5 g KH2PO

48.5 g MgSO4?7H2O

18.5 g CaCl2?2H2O

22.0 g 注意事項：

（1）配置母液前要仔細清洗存儲容器

（2）應按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動存儲瓶使其混合均勻；（3）溶解時最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產生；

（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因為水中帶菌量過大而產生沉淀，同時可以減緩綠藻的生成；

（5）沉淀的產生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時一定不要急；二是由于長菌而產生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。

2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)溫水依次加入下列藥品，每加一種藥品后攪拌溶解，最后定容到1L：

KI

0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O

0.86 g NaMoO4*2H2O

0.025 g CuSO4*5H2O

0.0025 g CoCl2*6H2O

0.0025 g

MnSO4*4H2O

2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室溫下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易產生結晶沉淀。配制過程中產生沉淀的原因有：1.前一個沒徹底溶解就加入了后一個藥品；2.蒸餾水pH 值過高，可加幾滴鹽酸校正。

3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：

甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L

4、鐵鹽的配制（100倍液）：

稱取EDTA 3.73 g，FeSO4·7H2O 2.78 g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

5、維生素B的配制（100倍液）：

VB組分 VB1(鹽酸硫氨素)VB6(鹽酸吡哆素)VB5(煙

酸)

改良MT 1g 1g 0.5g

MS 10 mg 50 mg 50 mg 分別稱取順序溶解在溫熱的蒸餾水中，定容到1L。

注: 需要溶解完一個再加另一個；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時可以加熱。

6、Vc的配制（100倍液）：

稱取Vc 0.5g 溶解在蒸餾水中，定容到1L即可。

7、其它溶液配制：

BA，NAA，IBA，GA3等激素類試劑可先用少量1N NaOH徹底溶解，再加水定容。配好后室溫放置一段時間，再放入冰箱中冷藏保存。有些試劑在乙醇或鹽酸中也可溶解，但比較而言，用堿溶解比較穩定，不易產生沉淀。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量較大，短時間內用不完，最好分裝一部分到小的細口瓶中，在制作培養基時使用。這樣不容易產生沉淀。

（二）培養基配制

母液配好后，按以下體種（或質量）量取，最后用蒸餾水定溶到1L,調節pH至5.8，用塑料燒杯放入微波爐中充分溶解后分裝滅菌。

大量元素(10倍液)

ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)

ml 鐵鹽（100倍）

ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）

ml 蔗糖

g 瓊脂

7.5 g

（三）接種與培養

在超凈臺上接種后，用記號筆做好標簽，放置到光照培養室中進行培養。

五、實驗注意事項

1、實驗中涉及到酒精及砷汞等危險品，注意人身安全的環境安全，廢液不要隨意亂倒。

2、外植體消毒及接種操作要規范，注意超凈臺的衛生，養成良好的實驗習慣。

六、實驗結果處理

一星期后，統計污染率，并對未污染材料的生長狀況進行觀察，并分析產生污染的可能原因。

七、思考題

影響植物組織培養的因素有哪些？

主要參考文獻

1.張婭，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。胡蘿卜組織培養和高效遺傳轉化體系的建立。植物學通報,2005，22:37-42。

2.華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料）。實驗三 植物DNA的提取、純化及檢測

一、實驗目的

DNA 提取是開展分子生物學的重要前提之一，高質量的DNA直接關系到分子標記、基因克隆、圖譜構建及功能基因組研究等工作的成敗。通過本實驗應了解常用DNA提取方法的原理和技術，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA檢測技術，為將來從事園藝植物生物技術研究奠定基礎。

二、實驗原理

植物的遺傳物質是DNA，植物細胞內含有豐富的遺傳物質。在機械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細胞破裂，DNA從細胞核釋放到提取緩沖液中。經蛋白質強變性劑處理結合離心，除去蛋白質和色素等雜質，再用乙醇沉淀便可獲得高純度的DNA。

DNA電泳是依據DNA帶負電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場的作用下DNA由負極向正極移動，分子量小的移動快而分子量大的移動慢，最終達到不同分子量大小的DNA分離的目的。

三、主要儀器及試材

水浴鍋、離心機、移液槍、研缽、離心管、核酸電泳系統等；新鮮健康植物葉片，液氮、及DNA提取有關試劑。

四、實驗方法與步驟 1.藥品的配制: CTAB提取液：

(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。使用前要在65℃溫浴一會兒，然后加入1-4%巰基乙醇，混均勻。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：

重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫熱的蒸餾水，加入少許8-羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力攪拌器上攪拌1.5 h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲存備用。2.DNA的粗提

在裝有葉片的離心管中加入石英砂少許（約0.07克），用尖頭玻棒將材料研細后加入600 ul CTAB提取液，再繼續研磨一會兒使其懸浮均勻，然后在65℃水浴鍋中溫浴60分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒幾次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下晃動10分鐘以上，其間置于37℃水浴鍋中溫浴一會（冬季），使之充分混勻，然后10000-12000 rpm離心5-10分鐘，吸取上清液轉至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰凍無水乙醇1 ml，輕輕顛倒數次，混合均勻后冰凍30分鐘沉淀DNA，然后8000-10000 rpm離心5分鐘，棄上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小時或過夜，8000 rpm離心5分鐘,棄酒精之后在工作臺上風干DNA，注意不要過干，否則會使以后溶解困難。3.DNA的純化：

向風干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時，然后加入700 μl苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，10000-12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入700 μl氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 μl 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在-20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，8000-10000 rpm離心2-3分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時后換一次，后浸泡過夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風干，加50-100 μl TE充分溶解備用。

4、DNA檢測

（1）取DNA原液15 μl稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計測定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高質量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7

（3）向一定量的DNA中加入限制性內切酶EcoR I至4-5 U/μg DNA，37℃消化過夜，用0.5×TBE，0.8%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳3 h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險或有毒物質，操作時要戴手套，并在專門區域操作。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

六、思考題

簡述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。

主要參考文獻

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料）。實驗四 質粒DNA的提取、純化及檢測

一、實驗目的

質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質粒的抽提過程，應掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實驗原理 在pH 12.0-12.6堿性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質粒DNA提取有關試劑。

液氮、及DNA提取有關試劑。

四、實驗方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實驗步驟

1、取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養基上劃線37℃過夜培養。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養基中，37℃搖床-250r/min過夜培養。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預冷的溶液I，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質充分沉淀（溶液III為中和液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存備用。

10、取制備的質粒DNA 1-2ul，加適當loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質，操作時應注意防護，盡量減少臺面污染。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

3、質粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型。

六、思考題

簡述質粒DAN提取的步驟。

主要參考文獻

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料）。

實驗五 PCR技術

一、實驗目的

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統，是分子克隆技術中常用技術之一。PCR具有反應快速、靈敏、操作簡便等優點，已廣泛應用于分子生物學的各個領域。通過本實驗應掌握PCR原理，學習PCR操作過程。

二、實驗原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板結合的特異性。反應分為變性、退火、延伸三步，經過一定的循環，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質粒或轉基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關試劑。

四、實驗方法與步驟

1、調整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應循環條件設置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍，混勻，短暫離心，取15ul反應產物點樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實驗注意事項

1、引物設計應具有特異性，依靠引物設計軟件進行引物設計；引物分裝成多管，不宜反復凍融多次；

2、PCR反應的各種成分不能遺漏，操作應戴手套，冰上操作；

3、根據引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設定PCR循環條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產物時出現拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術的原理和步驟。

主要參考文獻

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料

實驗六 PCR產物的TA克隆

一、實驗目的

采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果樹上常用的分子克隆方法。相對于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產物效率較低。目前，有兩種方法可以采用，一種是在特異引物設計時引入酶切位點，另一種是TA克隆。通過本實驗應掌握PCR產物TA克隆的原理，學習PCR產物純化及回收，以及PCR產物與TA克隆載體的連接。

二、實驗原理

TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校準活性，即在PCR產物的兩個3’末端加上未配對的單一A凸出尾，質粒載體提供線性3’末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產物高效連接。TA克隆技術比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

三、主要儀器及試材

PCR擴增產物、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Promega公司）、pMD18-T載體（TaKaRa公司）以及感受態大腸桿菌、高速冷凍離心機、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳等相關儀器及試劑。

四、實驗方法與步驟

1、PCR擴增片段純化回收

將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴增產物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進行。

2、連接反應 反應體系組成

pMD18-T

0.5-1.0 ul PCR fragment

1.0-4.5 ul ddH2O

0-3.0 ul Ligation Solution I

5.0 ul 混合后，置于室溫下放置數小時或過夜連接。

3、重組子轉化（熱激法）

1）在含適當濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；

2）冰上冷凍新滅菌的1.5 ml 離心管； 3）取出感受態大腸桿菌，冰上放置凍融；

4）取新滅菌的1.5 ml 離心管，加入50 ul感受態細胞和10 ul連接反應液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；

5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。請勿搖動離心管； 6）冰鎮：快速將離心管轉移至冰浴，1-2分鐘；

7）復蘇：每管加400 ul液體LB培養基，在37 ℃搖床溫和搖動45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均勻涂布于“1）”已制備好的LB平板上；

9）培養：在37 ℃下倒置培養12-16 h，即可觀察到藍白相間的菌落。白色菌落為含有外源插入片段的轉化子，藍色是載體自連的轉化子。轉化子可以在4 ℃下保持1個月；

10）單菌落培養：用滅菌的牙簽，挑選白色的單菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液體LB培養基的50 ml離心管中，在37 ℃搖床上培養過夜（12-16 h）。

4、質粒DNA的分離 參考有關文獻。

5、檢測

采用相同的引物對進行PCR再擴增，或質粒上根據插入片段兩端的酶切位點而進行限制性酶切，通過電泳可以檢測出片段是否克隆成功。

五、實驗注意事項

1、連接溫度不宜太高，連接溫度過高（>28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率；

2、熱激過程注意勿搖動離心管。

六、思考題

簡述PCR產物TA克隆的原理和步驟。

主要參考文獻

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內部資料。