第一篇：寬闊水自然保護(hù)區(qū)3種類型土壤的真菌多樣性

寬闊水自然保護(hù)區(qū)3種類型土壤的真菌多樣性

摘要：利用稀釋平板法和基于ITS rDNA基因序列的分析方法對(duì)寬闊水自然保護(hù)區(qū)3種類型的土壤進(jìn)行真菌的分離鑒定，共分離得到353株真菌，歸為34個(gè)不同的屬。對(duì)土壤真菌多樣性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明：紫色土真菌優(yōu)勢(shì)屬為酵母菌屬（Saccharomyces），黃棕壤真菌優(yōu)勢(shì)屬為酵母菌屬（Saccharomyces）和被孢霉屬（Mortierella），黃壤真菌優(yōu)勢(shì)屬為青霉屬（Penicillium）和木霉屬（Trichoderma）。土壤真菌Margalef豐富度指數(shù)（R）最高的是黃壤，最低的是黃棕壤；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）最高的是紫色土；Pielou均勻度指數(shù)（J）黃棕壤最高；Jaccard相似性指數(shù)（Cj）為0444 ～0.536，表明3種類型土壤的真菌多樣性均具有一定差異。

關(guān)鍵詞：寬闊水；土壤真菌；多樣性

中圖分類號(hào)： S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0458-03

收稿日期：2015-11-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（編號(hào)：2014FY120100）。

作者簡(jiǎn)介：黃依藍(lán)（1992―），女，碩士研究生，主要從事土壤真菌資源研究。E-mail：ylhuang77@163.com。

通信作者：周禮紅，博士，副教授，主要從事微生物應(yīng)用方向的研究。E-mail：lhzhou33@126.com。寬闊水自然保護(hù)區(qū)位于貴州省遵義市綏陽(yáng)縣境內(nèi)，總面積26 231 km2，海拔在650～1 762 m之間，地形切割強(qiáng)烈，除中南部以中低山谷地為主的侵蝕地貌外，保護(hù)區(qū)東、西部及北部多為典型的喀斯特地貌。寬闊水保護(hù)區(qū)的森林植被主體為亮葉水青岡林與常綠闊葉樹(shù)種構(gòu)成落葉常綠闊葉混交林，林下土壤發(fā)育良好，具有較豐富的腐殖質(zhì)積累[1]。由于特殊的氣候及地質(zhì)土壤條件，寬闊水自然保護(hù)區(qū)為森林野生動(dòng)植物及微生物的生長(zhǎng)繁育提供了有利的棲息場(chǎng)所，形成了復(fù)雜多樣的生境類型。與動(dòng)植物的分布類似，微生物的分布是確定性（環(huán)境）和隨機(jī)性（擴(kuò)散）的共同結(jié)果。由于微生物個(gè)體較小，可以通過(guò)孢子抵御長(zhǎng)距離傳播中的不良環(huán)境，在適宜條件下以多種繁殖方式存活下來(lái)，這種巨大的分散潛力和對(duì)小環(huán)境的敏感性，是微生物群落結(jié)構(gòu)與大型生物群落結(jié)構(gòu)之間的區(qū)別。土壤真菌作為微生物群落結(jié)構(gòu)中的一個(gè)重要組成部分，其多樣性程度與土壤肥力和生態(tài)狀況密切相關(guān)，同時(shí)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)及環(huán)境變化，也直接影響到真菌物種多樣性和空間分布情況[2-4]。

本研究采用傳統(tǒng)分離方法對(duì)寬闊水自然保護(hù)區(qū)3種不同土壤的真菌多樣性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)合微生物多樣性的分析方法，對(duì)該地區(qū)真菌菌群的基本特征、空間分布狀況和物種多樣性進(jìn)行調(diào)查，為進(jìn)一步揭示微生物和環(huán)境之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料和試劑

土樣采自寬闊水自然保護(hù)區(qū)。馬丁氏培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基均按標(biāo)準(zhǔn)方法配制，所用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。真菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1土樣采集選取寬闊水自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的紅沙地、花生地、太陽(yáng)山、煤場(chǎng)灣、天鵝湖、珙桐溝和一線天7個(gè)區(qū)域，GPS記錄采集地的地理位置，采集地環(huán)境描述（表1）。采用對(duì)角線型路線多點(diǎn)采集腐殖質(zhì)層土壤樣品于滅菌袋中，進(jìn)行編號(hào)，4 ℃保存。

1.2.2土壤真菌的分離及純化分離培養(yǎng)基為馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、改良沙氏孟加拉紅培養(yǎng)基和馬鈴薯孟加拉紅培養(yǎng)基，均在使用前加入鏈霉素，使培養(yǎng)基中含鏈霉素30 μg/mL。

用稀釋涂布法分離土壤真菌。稱取10 g土壤于90 mL含少量玻璃珠的無(wú)菌水中，充分振蕩混勻，按10倍稀釋法稀釋到1×10-3，取400 μL菌懸液于培養(yǎng)基上，均勻涂布，28 ℃培養(yǎng)5 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.3ITS序列分子鑒定

1.2.3.1真菌基因組DNA的提取基因組DNA提取按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3.2ITS序列的PCR擴(kuò)增（1）引物序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。（2）PCR反應(yīng)體系：擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ（L表2）。配制完成后，充分混勻，稍加離心使體系在PCR管底部，再置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。（3）PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 引物退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，分別取3 μL PCR產(chǎn)物和DNA marker點(diǎn)于1% 瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，若條帶單一且明亮清晰則表明擴(kuò)增成功，樣品可用于進(jìn)一步測(cè)序。

1.2.4序列測(cè)定與分析方法

1.2.4.1測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，獲得ITS序列。

1.2.4.2序列及真菌種群分布分析將已測(cè)定的序列在表1土壤采集地環(huán)境描述

采集地緯度（N）經(jīng)度（E）海拔（m）土壤類型土壤pH值生境類型紅沙地28°13′10″107°9′17″1 486 ～ 1 510紫色土5.5灌木叢花生地28°13′26″107°9′43″1 503 ～ 1 517黃棕壤6.0竹林地太陽(yáng)山28°14′9″107°9′37″1 592 ～ 1 722黃棕壤6.0方竹煤場(chǎng)灣28°13′56″107°9′42″1 555 ～ 1 579黃壤6.5灌木叢天鵝湖28°13′45″107°9′43″1 515 ～1 524黃壤7.0灌木叢珙桐溝28°13′59″107°10′1″1 582 ～ 1 629黃壤6.5灌木叢一線天28°14′11″107°11′12″1 411 ～ 1 455黃壤6.5灌木叢

表2PCR反應(yīng)體系組分

反應(yīng)組分體積（μL）引物ITS1 1引物ITS4 1模板 22×PCR Master Mix12dd H2O 9

GenBank上使用Blast（basic local alignment search tool，Blast 2.2.31）進(jìn)行序列比對(duì)分析、鑒定。

1.2.5真菌多樣性分析方法采用物種個(gè)體數(shù)量（N）、物種數(shù)（S）、種群優(yōu)勢(shì)度（d）、Margalef豐富度指數(shù)（R）、Shannon-Wiener的多樣性指數(shù)（H′）、Pielou均勻度指數(shù)（J）和Jaccard相似性指數(shù)（Cj）對(duì)寬闊水保護(hù)區(qū)不同土壤真菌群落多樣性進(jìn)行分析[5-7]。

種群優(yōu)勢(shì)度：di=Ni/N；

Margalef豐富度指數(shù)：R =（S-1）/lnN。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)：H′ =-∑PilnPi（i=1，2，3，…，n）；

Pielou均勻度指數(shù)：J =H′/lnS。

式中，Pi=di，表示第i種個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比例。

Jaccard相似性指數(shù)：Cj = c/（a+b+c）。

式中，a和b分別為2種生境地中真菌的種數(shù)或?qū)贁?shù)，c為2種生境地中共有的真菌種數(shù)或?qū)贁?shù)。Jaccard相似性系數(shù)（Cj）用于比較2個(gè)生境中真菌種類組成的相似程度，根據(jù)其原理：當(dāng)Cj為0.00～紫色土>黃棕壤，物種數(shù)（屬數(shù)）N為紫色土>黃壤>黃棕壤，Margalef豐富度指數(shù)R黃壤>紫色土>黃棕壤，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H′紫色土>黃壤>黃棕壤，Pielou均勻度指數(shù)J黃棕壤>黃壤>紫色土。紫色土和黃棕壤的Jaccard相似性指數(shù)Cj為0.536，中等相似；紫色土和黃壤Cj為0.500，中等相似，黃棕壤和黃壤Cj為0.444，中等不相似。

3討論

本研究采用種群優(yōu)勢(shì)度、豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)、均勻度和相似度指數(shù)，對(duì)寬闊水自然保護(hù)區(qū)3種不同土壤的真菌群落多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，從群落組成來(lái)看，各類土壤的優(yōu)勢(shì)種屬、常見(jiàn)種屬和稀有種屬均有較大差異，其中有一些屬為其相應(yīng)土壤所特有。寬闊水自然保護(hù)區(qū)土壤中大量存土壤類型S（N）RH′J紫色土26（127）5.160 82.775 60.851 9黃棕壤17（90）3.555 72.468 20.871 2黃壤22（136）4.274 72.676 10.865 8

在的酵母菌屬（Saccharomyces）、木霉屬（Trichoderma）、被孢霉屬（Mortierella）、擬青霉屬（Paecilomyces）、綠僵菌屬（Metarhizium）、黏帚霉屬（Gliocladium）等，具有較高的利用價(jià)值和應(yīng)用前景，可作為農(nóng)林病害防治和可持續(xù)開(kāi)發(fā)的資源[11-15]。此外，不同土壤真菌群落多樣性存在一定差異，Margalef豐富度指數(shù)最高的是黃壤真菌，最低的是黃棕壤；3種土壤真菌群落的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在2.46～278之間，紫色土最高，黃棕壤最低；黃棕壤的Pielou均勻度指數(shù)最高，紫色土最低；Jaccard相似性指數(shù)為0.444 ～0536，表明3種土壤相似性介于中等相似和中等不相似之間。造成不同土壤真菌群落多樣性的差異原因比較復(fù)雜，除了土壤質(zhì)地和土壤肥力外，還與其對(duì)應(yīng)生境地的光照、降雨量、植被類型等有關(guān)[16-17]。同時(shí)由于其中一些種屬的菌株具有生防功能，且不同微生物群落之間產(chǎn)生的相互作用使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此在一定程度上也影響了環(huán)境中的真菌多樣性[18]。

由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，大量不可培養(yǎng)微生物無(wú)法通過(guò)分離獲得，菌株數(shù)量十分有限。因此還需嘗試多種不同的分離方法，結(jié)合以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行多樣性分析，才能更加全面地了解寬闊水保護(hù)區(qū)的土壤真菌多樣性分布特征以及與環(huán)境之間的相互關(guān)系。

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第二篇：影響土壤真菌多樣性的土壤因素及土壤真菌研究進(jìn)展

土壤真菌多樣性研究及真菌分類方法研究進(jìn)展

陳秋君 201231142005 經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院12級(jí)20班

摘要：簡(jiǎn)述了土壤真菌的多樣性以及影響土壤真菌多樣性的因子，介紹了土壤真菌分類方法近年來(lái)的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：土壤真菌 多樣性 影響因子 研究方法

0 引 言

真菌是一類種類繁多、分布廣泛的真核微生物.真菌多樣性在維持生物圈生態(tài)平衡和為人類提供大量未開(kāi)發(fā)的生物資源方面起到了重要作用.真菌構(gòu)成了土壤的大部分微生物生物量, 具有分解有機(jī)質(zhì), 為植物提供養(yǎng)分的功能, 是生態(tài)系統(tǒng)健康的指示物.在農(nóng)業(yè)中, 真菌既降低糧食產(chǎn)量, 又為控制植物病蟲(chóng)害和其他真菌生物防治提供一條有效途徑.對(duì)根際真菌結(jié)構(gòu)和多樣性的了解將有助于更好的了解真菌對(duì)病原菌的抑制功能.在林業(yè)中, 叢枝真菌與植物相互共生作用, 為植物提供養(yǎng)份, 使植物能耐受干旱或貧養(yǎng)的條件, 同時(shí)也提高了植物的多樣性.在草地生態(tài)系統(tǒng)中, 分解者生物量總體中78% ~ 90%是真菌.20 世紀(jì)60 年代以來(lái), 微生物生態(tài)學(xué)研究發(fā)展較快, 推動(dòng)了土壤真菌學(xué)研究的發(fā)展, 人們對(duì)探究土壤中真菌存在的形式、數(shù)量、活性以及它們?cè)谖镔|(zhì)轉(zhuǎn)化中的重要作用等方面充滿興趣。70 年代以后人們更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到土壤真菌是微生物區(qū)系的主要成分, 并具有較高的生物活性。80 年代至今, 由于逐漸采用新的研究技術(shù)和手段, 土壤真菌研究的發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)期。

雖然真菌在陸地生態(tài)系統(tǒng)中有很重要的作用, 但是人們對(duì)自然界的真菌多樣性了解還很少.受到全球氣候變化、環(huán)境污染和人類活動(dòng)等諸多因素的影響, 自然環(huán)境中真菌的種類和數(shù)量、分布都發(fā)生了顯著的變化.土壤真菌研究越來(lái)越受到人們的重視。土壤真菌多樣性

1.1 物種多樣性

通常真菌被描述為具有真核, 能產(chǎn)生孢子、無(wú)葉綠素的有機(jī)體, 以吸收方式獲得營(yíng)養(yǎng), 普遍以有性和無(wú)性兩種方式進(jìn)行繁殖, 菌絲通常是由絲狀、分枝的枝細(xì)胞構(gòu)成, 并典型地被細(xì)胞壁所包裹.真正意義的真菌包括四大類群, 壺菌門(mén)、接合菌門(mén)、子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén).已知的壺菌約100 屬, 1 000種.最新研究估計(jì)全世界的真菌種類約有150 萬(wàn), 但至今已被正式描述的只有5%~ 10%[ 18~ 20] , 絕大多數(shù)是未知的.其原因一方面在于對(duì)真菌分離培養(yǎng)技術(shù)的依賴, 不能從少量材料中分離出目標(biāo)生物, 缺少對(duì)所有真菌群落生物都適應(yīng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件;另一方面在于對(duì)真菌生活環(huán)境缺乏全面了解, 不能準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)不同地域(特別是熱帶雨林地區(qū))真菌群落的結(jié)構(gòu)組成.1.2 生境多樣性

真菌廣泛分布在各種各樣的土壤環(huán)境中, 包括農(nóng)田、林地、草地、沼澤濕地、溫泉熱土、凍土層等.由于不同環(huán)境因子的影響, 使土壤真菌在其生活環(huán)境中形成獨(dú)特的群落種類、組成和分布規(guī)律.例如在林地中外生菌根真菌的種類、數(shù)量較多, 而在草地生態(tài)系統(tǒng)中叢枝菌根真菌的分布比較廣泛.在一些極端環(huán)境, 如南北極的凍土層中則分布著豐富的子囊菌門(mén)生物, 而在溫泉熱土中則與其他土壤例如林地的優(yōu)勢(shì)種類幾乎完全不同.一些真菌的生活環(huán)境仍然沒(méi)被完全的報(bào)道,真菌能否像細(xì)菌一樣生活在一些極端環(huán)境中? 這有待我們進(jìn)一步去發(fā)現(xiàn)新環(huán)境中新的種類, 并探索其生理機(jī)制.1.3 功能多樣性

真菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著多種多樣的功能, 包括降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、膠質(zhì)、還原氮、溶解磷、螯合金屬離子、產(chǎn)生青霉素等一些抗生素等.功能基因多樣性又使我們對(duì)真菌功能多樣性有了更進(jìn)一步的理解, 使我們認(rèn)識(shí)到真菌生物功能的差異是通過(guò)功能基因多樣性來(lái)體現(xiàn)的.科學(xué)家通過(guò)從純培養(yǎng)物和環(huán)境樣品中擴(kuò)增漆酶基因序列, 研究了美國(guó)東南部沼澤濕地中有木質(zhì)素降解潛在功能的子囊菌漆酶序列多樣性.獨(dú)特的序列類型顯示出真菌群落中這一功能基因的高度序列多樣性.雖然這方面的研究受到許多因素的限制, 處于剛剛起步階段, 但不失為我們未來(lái)發(fā)展的一個(gè)方向.真菌多樣性分布影響因子的分析

2.1 種植年限對(duì)真菌多樣性的影響

蔬菜種植年限對(duì)真菌的影響沒(méi)有一定的規(guī)律性，總的說(shuō)來(lái)，棚齡較短的較棚齡長(zhǎng)的，土壤真菌的數(shù)量和種類都要多，但棚齡超過(guò)5 a 以后，真菌數(shù)量顯著減少，不過(guò)一定周期后土壤真菌的數(shù)量又會(huì)逐漸增多，但只是少數(shù)種類真菌數(shù)量的增多，這可能與之適應(yīng)了土壤環(huán)

境有關(guān)。種植年限對(duì)真菌種類的影響與對(duì)數(shù)量的影響趨勢(shì)基本相同，到一定年限后，真菌種類呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。

2.2 土壤堿解氮對(duì)真菌多樣性的影響

土壤堿解氮含量的高低影響到土壤真菌的種類和數(shù)量。隨著土壤堿解氮增多，土壤真菌的數(shù)量基本呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，當(dāng)土壤堿解氮低于50 mg/kg 時(shí)，真菌數(shù)量最多，達(dá)到29.49×104 cfu/g 土，高于300 mg/kg 時(shí)，真菌數(shù)量最少，僅為17.33×104 cfu/g 土。當(dāng)堿解氮含量在100~300 mg/kg 之間時(shí)，真菌的種類最多，分別為44 種和35種。

2.3 土壤有效磷對(duì)真菌多樣性的影響

土壤有效磷含量與土壤真菌的種類和數(shù)量之間相關(guān)性不大（表5），土壤中有效磷含量在10~50 mg/kg 之間時(shí)，土壤真菌的數(shù)量最多，極顯著高于其他磷含量土樣中的真菌數(shù)

量。有效磷含量為50~100 mg/kg 時(shí)，真菌種類最多，為46 種。而其他磷含量不同的土樣中的真菌種類差異不大。

2.4 土壤速效鉀對(duì)真菌多樣性的影響

速效鉀含量在250~350 mg/kg 之間時(shí)真菌數(shù)量和種類均最多，分別為21.49×104 cfu/g 土和40 種，顯著高于其他土樣中的真菌的種類和數(shù)量。

2.5 有機(jī)肥對(duì)真菌多樣性的影響

隨著土壤有機(jī)肥含量的升高，土壤真菌的種類和數(shù)量也在上升，當(dāng)有機(jī)質(zhì)高于40 g/kg，土壤真菌的種類和數(shù)量均最高，分別為22.86×104 cfu/g 土和55 種，經(jīng)過(guò)分析得出，有機(jī)肥含量與土壤真菌的數(shù)量和種類的相關(guān)系數(shù)分別為0.976和0.960。

2.6 土壤含水量對(duì)真菌多樣性的影響

土壤含水量在10%~25%之間適宜真菌的生存和繁殖，在這其間真菌的數(shù)量差異不大，土壤含水量過(guò)高或過(guò)低，真菌數(shù)量均明顯下降。同樣，土壤含水量對(duì)真菌種類的影響也如此，土壤含水量在10%~30%之間，土壤真菌種類較多，其中含水量在15%~20%之間真菌種 類最多，為50種。

2.7 土壤質(zhì)地對(duì)真菌多樣性的影響

土壤質(zhì)地對(duì)真菌的種類和數(shù)量影響較大，輕壤土中真菌數(shù)量最多，為23.98×104cfu/g 土，極顯著高于其他類型土壤中的真菌數(shù)量。但中壤土真菌種類最多，為68種，其次是輕壤土中的真菌種類，但中壤偏重和砂壤偏輕土壤中真菌種類最少，僅為1種。關(guān)于影響土壤真菌多樣性因子的討論

土壤真菌的數(shù)量和種類受耕作制度、土壤層次、氣候變化及土壤類型等諸多因素影響，輪作與連作對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)和放線菌數(shù)均有較大影響，設(shè)施栽培條件下，輪作有利于土壤微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性的提高，有利于土壤生態(tài)環(huán)境的改善。

施肥能不同程度地促進(jìn)或抑制土壤微生物數(shù)量，影響根際土壤生理活性，尤其是有機(jī)肥能夠促進(jìn)蔬菜根際真菌的繁殖。

種植的蔬菜種類也影響土壤真菌的數(shù)量和種類。保護(hù)地種植年限的延長(zhǎng)后，土壤中病原菌如鐮孢菌、致病疫霉、鏈格孢、絲核菌的數(shù)量得到累積，一旦發(fā)病條件適宜就會(huì)造成病害的流行，給蔬菜生產(chǎn)帶來(lái)巨大的損失。

但土傳病害的抑制在一定程度上是土壤微生物的群體作用，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越高時(shí)，對(duì)抗病原菌的綜合能力就越強(qiáng)，這也是單一或少數(shù)拮抗菌往往難以成功拮抗病原菌的原因之一。由于土壤條件復(fù)雜，微生物之間的作用關(guān)系微妙，而化學(xué)農(nóng)藥的大量施用，又會(huì)殺掉許多有益微生物，破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡，使病害更加猖獗，因此應(yīng)采取各種農(nóng)業(yè)綜合措施，如通過(guò)施肥和輪作等來(lái)改善土壤條件，調(diào)整和優(yōu)化土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)，使土壤中病原菌數(shù)目下降到不至于引起作物病害造成經(jīng)濟(jì)損失程度。真菌分類技術(shù)在土壤真菌研究中的應(yīng)用和發(fā)展

早在數(shù)千年前真菌就已被人類認(rèn)識(shí)和利用,但對(duì)真菌的系統(tǒng)研究卻只有200 多年的歷史。此間, 主要依據(jù)形態(tài)特征描述和鑒定真菌的屬和種,并且在比較形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上建立了一些分類系統(tǒng)。隨著人類整體科學(xué)技術(shù)水平的不斷提高, 真菌分類研究技術(shù)也得到了不斷的發(fā)展、完善和補(bǔ)充, 大大推動(dòng)了真菌分類研究的進(jìn)展。到目前為止, 已被描述的真菌約有1 萬(wàn)多屬, 12 萬(wàn)多種, 而且還不斷有新的真菌屬、種被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。

4.1 傳統(tǒng)分類方法

經(jīng)過(guò)多代真菌分類學(xué)家們200 多年的不懈努力, 已形成了比較完善的真菌分類體系, 對(duì)科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐起著重要的指導(dǎo)作用。

到目前為止, 由以形態(tài)學(xué)為主的傳統(tǒng)分類方法為基礎(chǔ), 建立的分類系統(tǒng)在分類學(xué)界仍占據(jù)著舉足輕重的作用, 99%的真菌屬、種級(jí)分類單位仍然是建立在傳統(tǒng)分類研究基礎(chǔ)上的, 并仍在為人類認(rèn)識(shí)真菌物種、了解和利用真菌資源發(fā)揮著重要作用。不同真菌分類學(xué)家對(duì)一些分類特征的認(rèn)識(shí)和理解不同, 提出的真菌分類系統(tǒng)就不同。具有較大影響的真菌分類系統(tǒng)有以Ainsworth為代表的分類系統(tǒng)、Hawksworth分類系統(tǒng)、Kirk分類系統(tǒng)、Alexopoulos分類系統(tǒng)及Kendrick分類系統(tǒng)等。上述分類系統(tǒng)都基本上是基于主要形態(tài)學(xué)為依據(jù)的傳統(tǒng)分類方法。傳統(tǒng)分類方法主要依據(jù)真菌的形態(tài)、生理和生化特征等對(duì)真菌進(jìn)行分類。

盡管傳統(tǒng)分類方法有一定的局限性, 但是, 目前仍是相當(dāng)有效而且可靠的方法, 是大多數(shù)分類專家所樂(lè)于采用和接受的, 仍然是發(fā)展其它現(xiàn)代分類方法的重要基礎(chǔ)。離開(kāi)傳統(tǒng)分類系統(tǒng)和方法這個(gè)基礎(chǔ), 真菌分類學(xué)就會(huì)成為無(wú)源之水, 無(wú)本之木。況且, 傳統(tǒng)分類方法本身也正處于不斷發(fā)展和完善的新階段, 并不排除采用分子生物學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的新進(jìn)展和新方法,來(lái)不斷地改進(jìn)和提高真菌分類研究工作。生物分類研究的目的是認(rèn)識(shí)物種和客觀地反映其系統(tǒng)演化關(guān)系, 無(wú)論將來(lái)的分類系統(tǒng)和方法多么先進(jìn), 都無(wú)法摒棄以簡(jiǎn)明、節(jié)約為主要優(yōu)點(diǎn), 并在很大程度上反映客觀實(shí)際的傳統(tǒng)分類方法。

4.2 現(xiàn)代分類技術(shù)在土壤真菌研究中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的分類方法主要依據(jù)于真菌的形態(tài)特征及細(xì)胞生理和生化等特性, 尤其是有性生殖階段的形態(tài)特征。其主要困難是, 在許多情況下某些真菌的表型性狀相對(duì)貧乏, 難于透過(guò)現(xiàn)象認(rèn)識(shí)其遺傳本質(zhì)。許多真菌有性生殖極少發(fā)生, 難以通過(guò)檢查生殖隔離來(lái)界定物種。

近年來(lái)多門(mén)新興學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展, 尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的興起極大地促進(jìn)了真菌分類學(xué)的發(fā)展。一些已經(jīng)或即將用于真菌分類研究的分子生物學(xué)技術(shù)指標(biāo)日漸顯示出重要的分類潛能。利用各種分子生物學(xué)手段、特殊探針和特定序列鑒定真菌種類是這一領(lǐng)域深入發(fā)展的前提和基礎(chǔ)。

2000 年, Muriel等采用非培養(yǎng)條件下, 對(duì)ITS 基因直接擴(kuò)增,克隆和對(duì)ITS 區(qū)段進(jìn)行限制性酶切和序列分析的方法嘗試檢測(cè)了土壤真菌的多樣性。通過(guò)從土壤中直接提取總DNA 和從相同的土壤中分離培養(yǎng)真菌、鑒定后提取其DNA 兩種方法來(lái)嘗試、對(duì)比。

從土壤中得到67個(gè)真菌分離物, 從土壤中提取的總DNA中得到51個(gè)擴(kuò)增子, 進(jìn)行ITS 擴(kuò)增、酶切并比較, 共得到了58 個(gè)ITS-RFLP 圖譜。可培養(yǎng)真菌與土壤中擴(kuò)增子的ITS-RFLP 圖譜差異很大,僅有一種圖譜是共有的, 其他的都不相同。同樣的, 培養(yǎng)真菌和土壤中擴(kuò)增子的ITS 序列也差別很大, 58 個(gè)ITS 序列同已知序列進(jìn)行比較, 結(jié)果顯示所有從土壤中分離培養(yǎng)得到的真菌幾乎都是子囊菌, 只有一種為擔(dān)子菌, 而在土壤總DNA 得到的擴(kuò)增子中, 除了大部分為子囊菌外, 還有一種擔(dān)子菌, 一種接合菌, 和幾種分別屬于藻物界的卵菌(Oomycota)和原生動(dòng)物界的根腫菌(Plasmodiophoromycota), 可見(jiàn)PCR 直接擴(kuò)增獲得的真菌的范圍明顯廣于培養(yǎng)獲得的。與傳統(tǒng)方法相比, 它們可以揭示更多的從未檢測(cè)到的微生物的多樣性,并為理解自然狀況下土壤真菌的組成和功能提供更加客觀可靠的依據(jù)。現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 尤其是以揭示某些核酸和蛋白質(zhì)等分子生物學(xué)性狀來(lái)探索真菌的種、屬、科、目、綱、門(mén)等分類階元的進(jìn)化的研究日漸增多, 大大開(kāi)闊和延伸了人們認(rèn)識(shí)真菌遺傳本質(zhì)的視野。現(xiàn)代分類技術(shù)主要包括: 真菌次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用、可溶性蛋白質(zhì)凝膠電泳、同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳[ 38]、DNA 水平上的真菌分類學(xué)(DNA 中G+ Cmol%含量測(cè)定、基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)基礎(chǔ)上的DNA 多態(tài)性分析、DNA 基因位點(diǎn)的序列分析、多位點(diǎn)酶電泳、脈 沖電泳核型分析、DNA-DNA 雜交和DNA-rRNA 雜交)及數(shù)值分類分析等等。

土壤真菌中, 無(wú)性態(tài)真菌(半知菌)占很大比重。無(wú)性態(tài)真菌中又以絲孢綱真菌所占份額最大。由于基本上無(wú)法通過(guò)生殖隔離試驗(yàn)來(lái)測(cè)定無(wú)性態(tài)真菌成員之間的親緣關(guān)系, 在培養(yǎng)過(guò)程中, 真菌的形態(tài)特征和性狀, 如菌落的顏色、分生孢子的形態(tài)和菌絲的顏色等都易受培養(yǎng)基的類型、光照、溫度、培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短等條件的影響而發(fā)生變化。

因此, 在傳統(tǒng)分類研究的基礎(chǔ)上, 采用現(xiàn)代分類技術(shù), 特別是分子生物學(xué)手段來(lái)研究此類真菌的分類問(wèn)題就顯得更為迫切和必要。

以傳統(tǒng)分類為基礎(chǔ), 不斷探求以現(xiàn)代生物技術(shù)為手段的綜合分類研究方法, 實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)分類方法與現(xiàn)代分類技術(shù)的有機(jī)結(jié)合, 是未來(lái)真菌分類研究的必由之路。

參考文獻(xiàn)

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2、《土壤真菌研究方法及人為干擾對(duì)森林土壤真菌群落影響研究進(jìn)展》陳曉，劉勇，李國(guó)雷，孫巧玉，張碩，許飛

3、《土壤真菌多樣性及分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展》張 晶，張惠文，李新宇，張成剛