第一篇：水葫蘆論文：水葫蘆生防菌Cercosporasp.FJ24的分離、鑒定與生物學特性

水葫蘆論文：水葫蘆生防菌Cercosporasp.FJ24的分離、鑒定與生物學特性

【中文摘要】水葫蘆(Eichhornia crassipes)的蔓延在幾十個國家和地區造成了嚴重的環境問題,如何有效治理水葫蘆受到全球范圍內的廣泛關注。其中,利用水葫蘆致病真菌進行治理,是一種備受重視的途徑。本文從福建省福州市郊區采集到被致病真菌強烈感染的水葫蘆植株,從葉片上分離得到了具有強致病性的真菌菌株FJ24。在對其致病性能進行試驗的基礎上,對其生物學特性進行了研究。通過形態學鑒定,初步認為FJ24屬于尾孢屬。進一步地在分子生物學水平上,對其ITS區、EF-1區、β-Tub區、His-H3區序列進行PCR擴增,通過測序,對比Genebank中已經登錄的尾孢屬相應序列,構建系統發育樹,分析其分類地位。結果如下:證實其在7天內能夠使試驗水葫蘆植株達到100%的發病率,3天、7天、14天、21天、28天病情指數分別達到了23.33%、44.17%、78.33%、92.50%、100%。FJ24菌株在PDA培養基上菌落呈灰白色、邊緣呈淡紅色,簇狀分布。菌絲大部分侵入培養基,邊緣清晰。分生孢子梗單生或2~12根簇生,不分枝,淺褐色,寬度較規則、直立或略有彎曲,63.4~247.6×2.5~5.5μm。分生孢子單生,無色至淺褐色,有多個橫隔,略有彎曲或無彎曲,線形、鞭型或蠕蟲型,56.0~312.2×2.0~7.8μm。初步鑒定其為尾孢屬。在PDA培養基上,FJ24菌株在全黑暗和光暗交替條件下生長速度較快,該菌在30°C下表現出最快生長速度,而且能長期保持,最適宜的PH條件為

中性偏堿性,在不同培養基上菌落形態存在一定差別,最適宜的培養基為MMA、MSDA、PDAY,該菌最適合利用的碳源和氮源分別為淀粉和乙酸銨。根據ITS區、EF-1區、β-Tub區、His-H3區序列的測序結果,構建系統發育樹,結果表明Cercospora sp.FJ24菌株與Cercospora piaropi的多個水葫蘆致病菌株存在著極高的同源性,序列相似度均達到了99%以上。生物學特性實驗和分子生物學分析均表明,基本可以認為Cercospora sp.FJ24是屬于Cercospora piaropi的。綜上所述,本文分離得到的Cercospora sp.FJ24具有開發成為水葫蘆生防制劑的潛力,同時由于該菌分離自我國本土,具有較高的安全性,因此對于水葫蘆的生物防治具有一定的參考價值。

【英文摘要】Spread of Water Hyacinth(Eichhornia crassipes)caused serious environmental problems in lots of countries and regions.The importance of controlling it was recognized throughout the world.Currently, controlling Water Hyacinth with pathogens gained more and more attention.A strain FJ24, with high pathogenicity against Water Hyacinth was isolated from heavily diseased Water Hyacinth collected from Fujian province.On the basis of determining the pathogenicity of FJ24 against Water Hyacinth, biological characteristics of the strain were studied.Using morphological identification , the strain was preliminarily considered as Cercospora.The strain was further analysed at the molecular level.Four

representative sequences of Cercospora sp.FJ24 including the ITS region,EF-1 region,β-Tub region and His-H3 region were sequenced and blasted with other signed Cercospora species on Genbank.Phylogenetic dendrogram were constructed to analyse the taxonomic position of Cercospora sp.FJ24.The results were as follows: The diseaed ratings of Cercospora sp.FJ24 reached 100% in 7 days;the diseased indexes were 23.33%,44.17%,78.33%,92.50% and 100% after 3 days ,7 days, 14 days, 21 days and 28 days respectively.Colony of Cercospora sp.FJ24 on PDA culture was hoar and its edge was light red, growing in cluster.Hypha almost invaded into the culture with clear edge.Conidiophores of Cercospora sp.FJ24 borne singly or in fascicles of 2 to 12, were light brown, septate, width regular, straight or lightly curved and no branched , measuring 63.4 to 247.6μm long and 2.5 to 5.5μm wide.Conidia developed singly , colourless or light brown with many transverse, measured 56.0 to 312.2μm long and 2.0 to 7.8μm wide.Preliminarily identify it as Cercospora.The colony of Cercospora sp.FJ24 grew best on PDA under the dark treatment of alternation illumination and darkness while the colony growed better on PDA under all darkness.The optimum temperature for colony longtime growth was found to be 30℃.The best colony growth was obtained at the condition of neutral pH or alkalescence.The fitting carbon and nitrogen source were amylum and ammonium acetate respectively.Cercospora sp.FJ24 presented varying morphological characteristics on different media tested, and the colonies grew best on MMA, PDAY and MSDA.Four phylogenetic trees were generated from the aligned ITS region,EF-1 region,β-Tub region and His-H3 region sequences.The treeing analyses showed that Cercospora sp.FJ24 presented highly homologous with many kinds of pathogenic strain in Cercospora piaropi.And the sequence similarities were above 99%.Biological characteristics of Cercospora sp.FJ24 and phylogenetic tree analyses indicated that Cercospora sp.FJ24 could be basically identified as Cercospora piaropi.The results listed above indicated that Cercospora sp.FJ24, isolated from this study, possessed the great potential to be developed into the fungal herbicide against Water Hyacinth.This research had positive significances for the biological control of exotic plants.【關鍵詞】水葫蘆 生防菌 Cercospora piaropi FJ24 鑒定 【英文關鍵詞】Water Hyacinth Pathogenic strain Cercospora piaropi FJ24 Identification 【目錄】水葫蘆生防菌Cercosporasp.FJ24的分離、鑒定與生物

學特性12-2312-15摘要5-7ABSTRACT7-9第一章 前言1.1 水葫蘆的生態學特性、分布和危害1.1.1 水葫蘆的生態學特性12-1

31.1.3 我國水葫蘆的危害情況

1.2.1 水葫蘆的物理

1.3 1.1.2 水葫蘆的分布13-1414-151.2 水葫蘆的防治15-21化學防治15-161.2.2 水葫蘆的生物防治16-21水葫蘆的綜合防治2121-23材料23準備2323-2

41.4 本研究的選題依據、目的和意義

2.1 實驗第二章 實驗儀器、材料與方法23-342.1.1 水葫蘆病樣采集232.1.3 菌株來源2

32.1.2 供試植株的2.2 主要儀器設備

2.3.1 基

2.3.3 2.3 固體培養基及其制備方法24-27

2.3.2 不同pH 值固體培養基24-25礎培養基24不同C、N 源固體培養基2525-27272.4 方法27-342.4.2 接種試驗27

2.3.4 其它種類固體培養基2.4.1 病原真菌的分離2.4.3 柯赫氏法則（Koch’s

2.4.5 Rule）驗證27-28致病性測定2828-2929

2.4.4 植物病害統計方法282.4.6 影響菌落生長的因素2.4.7 DNA 提取292.4.8 ITS 區序列擴增

2.4.10 系統發育3.1 水葫蘆病原

3.1.2 2.4.9 參考基因序列擴增29-30

第三章 結果與分析34-57分析30-34真菌FJ24 的分離34-36致病癥狀34-35

3.1.1 病原菌的分離34

3.1.3 柯赫氏法則驗證353.1.4 致病

性測定35-3636-37征36-3737-47

3.2 水葫蘆病原真菌FJ24 的形態學特征

3.2.2 分生孢子形態特3.2.1 菌落形態特征363.3 影響FJ24 菌落生長的因素研究3.3.1 光照對FJ24 菌落生長的影響37

3.3.2 不同光照條件下FJ24 生長曲線的測定37-38FJ24 菌落生長的影響38-39線的測定39-4040-4141-42

3.3.3 溫度對

3.3.4 不同溫度下FJ24 生長曲

3.3.5 PH 對FJ24 菌落生長的影響3.3.6 不同初始PH 下FJ24 生長曲線的測定3.3.7 碳源對FJ24 菌落生長的影響42

3.3.8 不同碳源下FJ24 生長曲線的測定42-43菌落生長的影響43-44測定4444-4545-4747-5750-52列54-57

3.3.9 氮源對FJ24

3.3.10 不同氮源下FJ24 生長曲線的3.3.11 不同培養基對FJ24 菌落生長的影響3.3.12 不同培養基中FJ24 生長曲線的測定3.4 Cercospora sp.FJ24 的分子生物學鑒定3.4.1 ITS 序列47-503.4.3 β-Tub 序列52-54第四章 討論57-62

3.4.2 EF-1 序列3.4.4 His-H3 區序4.1 關于Cercospora sp.FJ24 的鑒定574.2 關于Cercospora sp.FJ24 的生物學

4.3 Cercospora

4.4 關于特性及其對實際應用的指導意義57-59sp.FJ24 菌株作為真菌除草劑的開發前景59-60Cercospora sp.FJ24 菌株的安全性60-61草劑的開發前景61-62

4.5 水葫蘆真菌除

參考文獻

第五章 結論62-63

63-68附錄68-70致謝70-71攻讀碩士學位期間發表的論文71

第二篇：藥用植物內生放線菌的分離和生物學特性

藥用植物內生放線菌的分離和生物學特性

摘要:【目的】探索藥用植物內生環境可培養放線菌的分離、培養方法，總結藥用植物內生放線菌的生物學特

性，探討其物種多樣性，挖掘新的微生物資源?！痉椒ā坎捎?10 種分離培養基對 37 個新鮮的藥用植物樣品

進行內生放線菌的分離;通過比較，選擇適合植物內生放線菌生長的培養條件;根據菌落形態和細胞特征觀 察結果，選擇其中 174 株菌測定 16S rRNA 基因序列，分析藥用植物內生放線菌的多樣性;應用 Biolog GEN III 微孔培養、API 50CH 以及 API ZYM 試劑條測試 27 株代表菌株的生理生 化特性?！窘Y 果】分 離 得到 940 株植物內生菌，分屬于 47 個屬，30 個科，其中放線菌 600 余株，分屬于 34 個屬，共發現潛在的新分類單元有 個;本研究中藥用植物內生放線菌的培養條件是:PYG 培養基、pH7.2、28℃ － 32℃;菌株間的生物學特性的

差異與菌株系統進化關系呈正相關關系;不同環境植物的內生菌菌株的生物學特性差異較大，相同環境的不

同植物內生菌的生物學特性差異較小?！窘Y論】藥用植物內生放線菌物種豐富多樣;藥用植物內生放線菌在 唯一碳源利用、發酵碳源產酸及酶學活性等生理生化特性方面沒有表現出和宿主植物的直接相關性，而是呈

現出和宿主植物的地理分布有一定的相關性。

關鍵詞:藥用植物，內生放線菌，生物學特性，多樣性

中圖分類號:Q939 文獻標識碼:A 文章編號:0001-6209(2013)01-0015-09 藥用植物有著獨特的藥理活性，特別是在治療

一些疑難病癥上有著不可替代的作用。如茵陳主治

黃疸型肝炎、肝硬化、肝腹水等肝病;狼毒主治結核、氣喘等，還具有抗腫瘤的作用。藥用植物的有效成

分的提取和研究一直是國內的熱門課題。1993 年，美國蒙大拿州立大學的 Stierle 研究小組首次從短葉

紫杉(Taxus breviforlia)中分離得到一株能合成抗癌

物 質 紫 杉 醇 的 內 生 真 菌 新 種 安 德 氏 紫 杉 霉 菌(Taxomyces andreanae)［1］，并證明內生菌具有合成

與宿主植物相同或相似的活性成分的功能。由此掀

起了對藥用植物內生菌研究的熱潮?！段⑸飳W通

報》編輯部的郝榮喬于 2009 年初對 2008 年的 點評中報道“植物內生菌成為我國當前微生物研究

領域的熱點” ［2］

。的確，藥用植物內生菌的研究和 有效開發對藥用植物資源、特別是瀕危植物資源的

保護具有重要的意義。

本研究選取采集自北京、貴州、云南和西藏等地 的藥用植物樣品 37 份，經過表面消毒處理后，應用

放線菌分離培養技術從中分離放線菌菌株;根據菌

株的 16S rRNA 基因序列信息以及系統進化關系，探討藥用植物內生放線菌的物種多樣性;通過生理

生化實驗測定，揭示藥用植物內生放線菌的生物學 杜慧竟等: 藥用植物內生放線菌的分離和生物學特性． /微生物學報(2013)53(1)ordination analysis，NTSYSpc v． 2.02)進行分析，構

建表型數值分類聚類圖，分析實驗菌株的生物學特 性。2 結果

2.1 菌種分離結果

從 37 份藥用植物中共分離、純化得到 940 株純

培養物(表 1)。從云南、貴州和西藏來源的植物樣

品中分離得到的放線菌的比例稍高于北京的植物樣

品;來源于植物根、莖、葉的菌株數量基本相當，沒有

明顯差異;和其它 9 種分離培養基相比較，丙酸鈉分

離培養基(M7)分離得到的放線菌數量占顯著優勢。

表 1 藥用植物內生菌分離結果統計

Table 1 The strains isolated from the medicinal plants Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates P1 34 P11 6 P20 10 P29 64 P2 40 P12 18 P21 15 P30 2 P3 46 P13 10 P22 4 P31 8 P4 43 P14 1 P23 3 P32 44 P5 17 P15 8 P24 77 P33 45 P6 44 P16 15 P25 12 P34 31 P7 8 P17 14 P26 73 P35 34 P8 4 P18 1 P27 98 P36 12 P9 6 P19 12 P28 59 P37 3 P10 19

通過菌落形態以及菌株細胞顯微形態的初步觀

察結果以及菌株來源，選擇 174 株代表菌株進行

16S rRNA 基 因 序 列 測 定 和 比 對，結 果 顯 示，174 株

分離菌株隸屬于 30 個科、47 個屬，其中的放線菌 139 株，分屬于 34 個屬(圖 1)。以菌株的16S rRNA

基因序列與 NCBI 數據庫中有效描述菌種相似性 ＜

98.2% 作 為 操 作 分 類 單 元(taxanomic operational

units，OTU)的劃分 界 限 ［12 － 13］，其中有 22 株菌代表

了 7 個新的操作分類單元。

2.2 藥用植物內生菌的生物學特性

為了比較研究藥用植物內生放線菌的生物學特

性，選擇了 27 株分離菌株進行了生長溫度、pH 值、唯一碳源利用、利用碳源產酸以及酶學特性測試，其

中包含了 2 株藥用植物內生細菌。來源于韓國菌種

保藏中心的 3 個典型培養物 KCTC 19272 T、KCTC 19469 T

和 KCTC 19037 T

(分離自不同土壤環境)同時 做了平行對照實驗(表 2)。起初，分離菌株在對應的原始分離培養基和繼

代培養基 PYG 上生長良好，但是隨著傳代次數的增

加，部分內生菌生長變弱，甚至無法繼續傳代，而 3 株來源于土壤樣品的對照菌的生長狀態則幾乎不受

傳代次數的影響。內生菌菌株的溫度生長范圍是

10℃ － 37℃，在 28℃ － 32℃ 生長 較 好;多 數 菌 株 在

pH 6.0 － 10 范圍 內 都 能 生長，在 pH 中 性 至 弱 堿 性 條件下生長最佳。

本實驗中 27 株植物內生菌對碳源的利用呈現

以下趨勢:菌株對二糖和多糖類的利用率最高，接下

來依次是單糖，脂類，氨基酸及衍生物。27 株植物

內生菌中，50% 以上的菌株都能利用以下底物作為

唯一碳源和能量來源:亞碲酸鉀，丁酸鈉，甘露醇，纖

維二糖，葡萄糖，麥芽糖，松二糖，甘油，果糖，海藻

糖，蔗糖，水 楊 苷，甘 露 糖 和 醋 酸。在 菌 株 I10A-01402 的分類學研究 時，用 來 源于 土壤 環境 的近源

菌 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T，N． alkalitolerans KCTC 19037 T 作為參比進行

了 Biolog Gen Ⅲ 唯 一 碳 源，API 50CH 產 酸 和 API ZYM 酶學特性測定和比較分析。植物內 生 菌 I10A-

01402 以及其 它 26 株 內 生 菌 都 能 夠利用 Biolog 微

孔板中葡聚糖和 D-麥芽糖，但是，來源于土壤環境 的 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T

和 N． alkalitolerans KCTC 19037 T

等 3 株類諾

卡氏菌屬的菌株都不能利用這兩種糖;I10A-01402

不能利用 N-乙酰類化合物，其它 26 株內生菌也都

不能或很少利用此類化合物，而這 3 株土壤來源的

菌株則全部能利用 N-乙酰類化合物作為唯一碳源

和能量來源。27 株藥用植物內生菌和 3 株土壤來

源的參比菌株同化 API 50 CH 中的碳源并產酸的情

況以及酶學特性上也表現出較大的差異。本實驗中 株藥用植物內生細菌和 28 株 放線菌 相 比較，細菌

能夠更多地利用 Biolog GenⅢ中列舉的唯一碳源，并且同化 API 50 CH 中單個碳源并產酸實驗的陽性 率也高一些，但在 API ZYM 酶學特性測試結果中沒 有明顯差異。

16S rRNA 基因 序 列 相 似 性 越 高 的 菌 株 的部 分

生理生化特性也趨于相近。例如，草藥菌屬菌株

(Herbiconiux sp．)I10A-01569、草 藥 菌 屬 菌 株

(Herbiconiux sp．)I10A-02268、草 藥 菌 屬 菌 株(Herbiconiux sp．)I10A-02292、寒 冷 桿 菌 屬 菌 株 171 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 植物樣品:玉竹、黃精、知母、蒙古黃芪、肥皂

草、藿香、薄荷、金銀花、仙鶴草、櫻桃、大葉玉竹、白

芷、紫蘇、噴瓜、金銀木(橘色果實)、紅色果實金銀

木、虎杖、薯蕷和穿龍薯蕷等 19 份植物樣品采集自

北京(編號 P1 － P19)，大狼毒、狼毒大戟、瑞香狼毒、橙黃瑞香、藏茵陳和云南重樓等 6 份采自云南(P22 － P27)，貴 州重 樓 和 三 七 采 自 貴 州(P28，P29)，綿

頭雪蓮(P20)、包葉雪蓮(P21)以及其余 8 份(P30 － P37)等共 10 份采自西藏。共計 37 份藥用植物樣 品。

1.1.2 培養基:(1)內生菌分離培養基: 使用了 10 種分離培養基(M1 － M10)，其中 M1 － M8 培養基是

本實驗室在紅樹植物內生放線菌研究中使用的 8 種

內生放線菌分離培養基 ［3］，M9 和 M10 的組成如下: M9(g / L): 檸檬酸 0.12，檸檬 酸 鐵 銨 0.12，硝

酸鈉 1.5，磷 酸 氫 二 鉀 0.4，硫 酸 鎂 0.1g，碳 酸 鈣

0.05，碳酸鈉 0.2，瓊脂 12，pH 7.2。M10(g / L): 甘露聚糖 2.0，酪素水解物 0.3，硝

酸鉀 0.1，海洋微量鹽 微量，復合維生素 微量，瓊

脂 12，pH 7.2。

(2)菌種純化和繼代培養培養基(g/L): 蛋白 胨 3，酵母浸膏粉 5，甘油 10，甜菜堿 1.25，丙酮酸 鈉 1.25，復合維生素 微量，瓊脂 12，pH 7.2。

1.1.3 抑制劑:抑制真菌和革蘭氏陰性細菌的抑制

劑的種類和劑量參見文獻［3］。

1.1.4 菌 株: 參 比 菌 株 人 參 地 類 諾 卡 氏 菌

(Nocardioides ginsengisegetis)KCTC 19469 T，韓國類

諾卡氏菌(Nocardioides koreensis)KCTC 19272 T 和 耐

堿類 諾 卡 氏 菌(Nocardioides alkalitolerans)KCTC 19037 T

來源于韓國典型培養物保藏中心(KCTC);其它實驗菌均為本研究的分離菌株。

1.1.5 主要試劑:硫 代 硫 酸 鈉、次 氯 酸 鈉、碳 酸 鈉、萘啶酮酸、制霉菌素、重鉻酸鉀等化學試劑均為國產

分析純試劑;PCR 擴增相關試劑和引物測序均來源

于生工生物工程(北京)，Biolog GEN III 微孔板和基

礎培養液購于美國 BIOLOG 中國代理，API 50CH 和

ZYM 試劑條及相關試劑購于生物梅里埃公司。

1.2 菌種分離和保藏 具體方法參見文獻［3］。

1.3 菌種初步鑒定和多樣性分析 菌種初步鑒定參照徐麗華等主編的《放線菌系 統學》 ［4］

相關方法操作。根據菌落和菌絲形態初步 觀察排除重復菌株，選擇代表 性菌 株測 定 其 16S

rRNA 基 因 序 列，并 將 結 果 提 交 EzTaxon 網 站

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杜慧竟等: 藥用植物內生放線菌的分離和生物學特性． /微生物學報(2013)53(1)Isolation and physiological characteristics of endophytic actinobacteria from medicinal plants Huijing Du，Jing Su，Liyan Yu，Yuqin Zhang * Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China Abstract:［Objective］ To isolate，incubate and characterize cultivable endophytic antinobacteria from medicinal plants，and analyze the diversity of the endophytic antinobacteria，then explore the novel microbial resources． ［Methods］ Ten media were used to isolate endophytic antinobacteria from 37 fresh medicinal plant tissue samples． The optimal cultivation

conditions for endophytic antinobacteria were determined by comparison． Based on the morphology of the colonies and cells

of the new isolates，we chose174 isolates to analyze their 16S rRNA gene sequences and the diversity of the medicinal

plant endophytic antinobacteria． The physiological characteristics of 27 representative strains were studied using Biolog

GEN III MicroPlates，API 50CH and API ZYM kits． ［Results］ In total 940 endophytics affiliated to 47 genera of 30

families were isolated，among which more than 600 actinobacteria belonged to 34 genera and 7 unknown taxa． Good growth

of the endophytic antinobacteria on PYG(peptone-yeast-glycerol)medium with pH 7.2 at 28 － 32℃ was observed．

Physiological characteristics differences of these isolates related to their phylogenetic relationships． Greater differences

were shown among the strains from the same host plants than those from different plants grown in the same area．

［Conclusion］There are great diverse endophytic actinobacteria inside the medicinal plants． No direct relationship of the

endophytic actinobacteria from medicinal plants with the host plants in the sole carbon source utilization，fermentation of

carbon sources to produce acid and the enzyme activities was found，while it seemed that the physiological characteristics of the isolates related to the geographical distribution of their host．

Keywords: medicinal plants，endophytic actinobacteria，physiological characteristics，diversity

第三篇：豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學特性研究

豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學特性研究

唐先春1, 吳 斌1*, 索緒峰2, 王大林2 ,陳煥春1, 尹爭艷1

（1.華中農業大學動物病原微生物實驗室, 武漢

430070）

（2.海口市美蘭區羅牛山獸醫站, 海南

571133）

摘要: 用PCR方法配合生化鑒定，從有肺炎癥狀豬的肺臟及進行性萎縮性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis, PAR)癥狀豬的鼻拭子中分離出66株多殺性巴氏桿菌(Pasteurela multocida, Pm)。然后做了藥敏試驗，并用PCR方法對這66株Pm進行分型及毒素基因的檢測, 用豚鼠皮膚壞死試驗及小鼠致死試驗對產毒素多殺性巴氏桿菌（Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm）進一步鑒定。結果顯示PCR鑒定與生化鑒定Pm結果完全一致；PCR分型表明有46株為D型Pm，18株為A型Pm，1株為B型Pm，1株無法定型；有8株用PCR檢測為T+Pm；豚鼠皮膚壞死試驗及小鼠致死試驗對這8株T+Pm的進一步鑒定，也表明均為產毒素菌株。所鑒定的8株T+Pm都為D型，都分離于有嚴重PAR癥狀的豬。關鍵詞: 多殺性巴氏桿菌； 產毒多殺性巴氏桿菌；PCR；分型；藥敏試驗

中圖分類號: S852.61+2

文獻標識碼: A

文章編號: 0366-6964(2005)0

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida, Pm）是一種重要的病原，可以導致豬肺疫、牛羊出敗、禽霍亂等危害嚴重的畜禽傳染病。產毒多殺性巴氏桿菌（Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm）是豬進行性萎縮性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis, PAR)的主要病原菌。該病是養豬業的一種重要傳染病，其主要表現為：慢性鼻炎、顏面部變形、鼻甲骨萎縮或由于經常打噴嚏而造成鼻出血。哺乳仔豬感染本病后，除引起鼻甲骨甚至鼻腔變形、萎縮或消失外，還可以引起全身鈣代謝障礙，致使仔豬發育遲緩、飼料利用率降低，有時伴發急、慢性支氣管炎，導致仔豬死亡。育肥豬感染本病后，呼吸道的正常結構和功能遭到損害，致使機體抵抗力降低，極易感染其它病原，諸如支原體、胸膜肺炎放線桿菌、副嗜血桿菌、豬流

～感病毒、豬生殖—呼吸道綜合征病毒等，引起豬呼吸道綜合征，增加豬的死亡率 [14]。

多殺性巴氏桿菌按莢膜的不同可分為A、B、D、E、F 5個血清型。研究表明，T+Pm主要是D型Pm，而且T+Pm主要分離于具有嚴重PAR癥狀的豬，從有肺炎癥狀豬分離的Pm一般是不產毒素的[5, 6]。

T+Pm與T-Pm在形態特征及生化反應特性上沒有區別。與PAR密切相關的T+Pm產生一種約145kDa的皮膚壞死毒素（Dermonecrotic toxin, DNT），該毒素由toxA基因編碼。一

～般認為T-Pm不會導致PAR，而提純的DNT可以導致PAR的發生[79]。所以，DNT是診斷及控制PAR的關鍵，也是區分T+Pm與T-Pm的關鍵。

基于DNT的特性，已經建立了一些檢測方法，以區分T+Pm與T-Pm，如豚鼠皮膚壞死試驗、小鼠致死試驗[10]、細胞促生長試驗、胎牛肺細胞毒性試驗[11]、ELISA[5]。但這些毒素檢測方法，無論是動物試驗還是細胞培養，操作繁瑣，費時費力，在臨床上的應用都有很大的局限性[5]。隨著T+Pm毒素基因的分子生物學研究，以及近年來PCR檢測方法的廣泛應用，使T+Pm的檢測越來越簡便、靈敏和完善。材料與方法

1.1酶及主要試劑

收稿日期：2004-04-05 基金項目：國家自然科學基金項目資助（30471292）

作者簡介：唐先春（1978-），男，漢，湖北十堰人，碩士，主要從事產毒素多殺性巴氏桿菌方面研究，E-mail:xianchuntang@tom.com。*通訊作者 Tel:027-87288629 Taq DNA 聚合酶購自TaKaRa；生化鑒定管及藥敏試紙購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌的分離

病料來源于海南、湖北、湖南、廣東、廣西、上海等十多個省市。對于有明顯鼻萎縮癥狀的豬，鼻盤消毒后采其鼻拭子；部分病料是送檢的無鼻萎縮癥狀的豬以及病肺，無菌采其肺組織。將采集的病料劃線接種于胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）平皿，37℃培養18～24h后觀察，挑取直徑1～2mm、透明、光滑、濕潤的菌落進行革蘭氏及瑞氏染色。革蘭氏染色呈紅色的細小球桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染的細菌為可疑菌落，對其傳代純化，進一步做生化及PCR鑒定。1.3 生化鑒定

對于純化好的可疑菌落按使用說明做以下生化實驗：葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、吲哚、MR、VP、硝酸鹽還原，并接種于麥康凱培養基。1.4 藥敏試驗

已純化好的Pm，挑取單菌落接種與腦心浸液（Brain and Heart Infusion, BHI）培養基，培養14h。比濁法記數后，用BHI稀釋菌液至終濃度為3.0億/mL。用滅菌棉拭子在TSA平皿上均勻涂布，待菌液吸收后，貼藥敏紙片，37℃培養16～20h,記錄結果。1.5 PCR鑒定

1.5.1 本試驗所用PCR引物見表1：

表1 本試驗所用PCR引物

Table1 PCR primers used in this experiment 引物用途 鑒定Pm 鑒定A型Pm 鑒定B型Pm 鑒定D型Pm 鑒定E型Pm 鑒定F型Pm 鑒定T+Pm 引物編號 KMT1 KMT2 PmA1 PmA2 PmB1 PmB2 PmD1 PmD2 PmE1 PmE2 PmF1 PmF2 TA1 TA2

引物序列（5'—3'）

ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC GAT GCC AAA ATC GCA GTC AG TGT TGC CAT CAT TGT CAG TG CAT TTA TCC AAG CTC CAC C GCC CGA GAG TTT CAA TCC

TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG TCC GCA GAA AAT TAT TGA CTC GCT TGC TGC TTG ATT TTG TC TCG GAG AAC GCA GAA ATC AG TTC CGC CGT CAA TTA CTC TG CTT AGA TGA GCG ACA AGG GAA TGC CAC ACC TCT ATA G

PCR產物/bp

457 1048 758 647 512 852 864 注：以上引物參照文獻[12～15]及NCBI上發布的序列設計，由上海生工合成。

Note: All these primers were designed referred to the references of 12～15 and gene sequences published on NCBI.All primers were synthesized by Shanghai Sangon.1.5.2 PCR模板 用接種環挑取單菌落，懸浮于含50μL無菌水的離心管中，100℃水浴中煮5～10min，然后迅速置于冰上冷卻5min，10 000r/min離心2min，上清即為PCR模板。1.5.3 PCR反應體系（25μL）10×Taq Buffer2.5μL，25mmol/1MgCl2 0.5μL，2μmol/LdNTPs 0.5μL，20μmol/L上、下游引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，無菌水10μL，模板10μL。1.5.4 PCR反應條件 94℃變性4min，然后進入30個循環：94℃30s、56℃30s、72℃40s，最后72℃延伸10min，PCR產物8℃短時保存。1.5.5 PCR結果觀察 取PCR擴增反應產物10μL和5μL分子量標準，加到含EB的0.8%瓊脂糖膠中，在80V電壓下電泳30min，然后在紫外線燈下觀察。1.6 DNT的動物試驗檢測

1.6.1 豚鼠皮膚壞死試驗 待檢菌株接種于BHI培養18h，然后12 000r/min離心10min，上清用0.2μm的濾膜過濾。濾液0.2mL注射于體重350～400g健康豚鼠的剃毛背部，觀察72h。注射部位皮膚壞死區直徑≥5mm為DNT陽性；＜5mm疑似，需復試；無反應或僅輕微紅腫者為陰性[6, 10]。

1.6.2 小鼠致死試驗 待檢菌株接種于TSA培養24h，用滅菌PBS洗脫菌苔并稀釋至1010cfu/mL，菌液置于冰浴中超聲破碎3次，每次10s。裂解物12 000r/min離心30min，上清依次用0.45μm和0.22μm過濾，0.5mL濾液腹腔接種于20g左右的BALB/C小鼠。每株菌接種4只小鼠，72h內全部死亡者為DNT陽性，部分死亡者需復試[10]。結 果

2.1 多殺性巴氏桿菌生化鑒定

凡是麥康凱上不能生長，發酵葡萄糖、果糖、甘露醇產酸不產氣，不發酵麥芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、硝酸鹽還原試驗陽性，MR、VP試驗陰性者判為多殺性巴氏桿菌。結果共分離出66株多殺性巴氏桿菌，其中24株分離于肺臟，42株分離于鼻拭子。2.2 12種抗菌素對66株多殺性巴氏桿菌的抗藥譜

表2 12種抗菌素對66株多殺性巴氏桿菌的抗藥譜 Table 2 Medicine sensitivity of 66 isolates to 12 antibiotics 抗

生

素

判 定 標 準 / mm

耐 藥

φ<12 φ<12 φ<10 φ<10 φ<12 φ<12 φ<10 φ<12 φ<12 φ<12 φ<12 φ<10

中

敏 12≤φ12≤φ10≤φ10≤φ12≤φ12≤φ10≤φ13≤φ12≤φ12≤φ13≤φ10≤φ

≤16 ≤16 ≤14 ≤17 ≤16 ≤16 ≤12 ≤14 ≤16 ≤16 ≤14 ≤17

高 敏 φφφφφφφφφφφφ>16 >16 >14 >17 >16 >16 >12 >14 >16 >16 >14 >17

高 敏 9(13.7%)52(78.8%)32(48.5%)59(89.4%)30(45.5%)41(62.1%)20(30.3%)35(53.0%)21(31.8%)46(69.7%)27(40.9%)19(28.8%)

試

驗

結

果

中 敏 29(43.9%)9(13.6%)12(18.2%)4(6.1%)13(19.7%)13(19.7%)14(21.2%)12(18.2%)27(40.9%)12(18.2%)24(36.4%)32(48.5%)

耐 藥 28(42.4%)5(7.6%)22(33.3%)3(4.5%)23(34.8%)12(18.2%)32(48.5%)19(28.8%)18(27.3%)8(12.1%)15(22.7%)15(22.7%)1 強力霉素 2 先鋒霉素 3 四 環 素 4 氯 霉 素 5 氨芐青霉素 6 氟 哌 酸 7 青 霉 素 8 慶大霉素 9 痢 特 靈 10環丙沙星 11卡那霉素 12紅 霉 素

2.3 多殺性巴氏桿菌的PCR鑒定

在Pm分離過程中用檢測Pm的引物KMT1-KMT2配合生化鑒定，結果表明凡是KMT1-KMT2擴增為陽性的菌株生化結果都符合Pm標準，而陰性者都不完全符合。而且我們對分出的第一株陽性PCR產物回收測序，與NCBI上發布的7個Kmt基因序列對比，同源性都在97.6%～99.8%（測序結果略）。2.4 多殺性巴氏桿菌的PCR分型

對分離的66株Pm分別用各型的引物擴增，結果有46株為D型，18株為A型，1株為B型，1株無法定型，沒有E、F型。其中46株D型有28株分離于鼻拭子，18株分離于肺臟。18株A型有14株分離于鼻拭子，4株分離于肺臟。B型1株分離于肺臟。1株未定型者分離于肺臟。2.5 產毒多殺性巴氏桿菌的PCR鑒定

對分離的66株Pm用檢測toxA基因的引物TA1-TA2擴增，結果有8株擴增為陽性，這8株都分離于有PAR癥狀豬的鼻拭子。對其中一陽性PCR產物回收測序，與NCBI上發布的4個toxA基因全序列對比，與其中3個序列同源性100%，與另一序列同源性99.7%(658/660)，可見該引物所擴增序列相當保守（測序結果略）。

圖1 PCR檢測Pm、T+Pm及對A、B、D型Pm分型電泳圖譜 Fig 1 The result of testing Pm, T+Pm and typing Pm of serogroup A, B, D by PCR showing on the agarose gel electrophoresis

1:多殺性巴氏桿菌(KMT1-2為引物)；2: A型多殺性巴氏桿菌(PmA1-2為引物)；3: B型多殺性巴氏桿菌(PmB1-2為引物)；4: D型多殺性巴氏桿菌(PmD1-2為引物)；5: 產毒素多殺性巴氏桿菌(TA1-2為引物)；M: DL2000

1: Pm(KMT1-2 was primers);2: Pm of serogrope A(PmA1-2);3: Pm of serogrope B(PmB1-2);4: Pm of serogrope D(PmD1-2);5: T+Pm(TA1-2);M: DL2 000

2.6 多殺性巴氏桿菌毒素的檢測

對8株PCR檢測為陽性的T+Pm做了豚鼠皮膚壞死試驗及小鼠致死試驗。豚鼠皮膚壞死試驗8株全為陽性，大多數菌株壞死區直徑為7～12mm，其中兩株壞死區直徑達到16mm，壞死區呈紅紫色至黑色。小鼠致死試驗有6組（6株菌）小鼠72h內全部死亡，2組在初試時4只小鼠各有1只沒死，但復試時4只全死。小鼠死亡時間大多在20～48h內。討 論

在Pm分離過程中我們采用了PCR方法，由于引物KMT1-KMT2具有很強的靈敏度及特異性，大大降低了分菌工作的難度。敏感性試驗表明該引物可以檢測低到103個cfu的模板量，而且用呼吸系統常見菌如：胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、鏈球菌及大腸桿菌做模板都不能擴出特異帶型。一般在第一代平皿上挑菌做PCR，若為陽性，都能分出Pm，若為陰性很難分出Pm。而且PCR結果與生化結果完全吻合，即凡是KMT1-KMT2擴增為陽性的菌株生化結果都符合Pm標準，而陰性者都不完全符合，可見該引物具有很強的特異性。

藥敏試驗結果表明，所分離的66株Pm對氯霉素、先鋒霉素、環丙沙星表現較高的敏感性。但氯霉素已禁用，臨床上可首選其他兩種藥物。

各方面報道表明T+Pm主要是D型Pm，極少數A型Pm也產毒素，而且T+Pm主要分離于具有嚴重PAR的豬，從肺炎癥狀豬的肺臟分離的Pm一般是不產毒素的，而且多為A型[5, 6, 15]。我們對分離的66株Pm進行PCR分型，結果有69.7%(46/66)為D型，27.3%(18/66)為A型，僅1.5%(1/66)為B型，沒有分出E和F型。單從來源于肺臟的Pm來看，16.7%（4/24）為A型，75%（18/24）為D型，4.2%（1/24）為B型。然而，C Pijoan報道從肺臟分離的Pm有87.5%為A型，12.5%為D型[6]。L Robert報道從肺炎癥狀豬分離的Pm75%為A型，13%為D型；從有PAR癥狀豬分離的Pm有29.4%為A型，70.6%為D型[15]。我們所用的分型方法與L Robert的方法相同，但結果差異較大，這可能是因為我國血清型流行與國外不同；也可能是因為我國血清流行的區域性，這還需進一步廣泛分菌調查。不過單從有PAR癥狀的豬來看，有66.7%(28/42)為D型，這與L Robert報道的70.6%為D型接近。在PCR定型過程中，有1株Pm用引物KMT1-KMT2擴增為陽性，生化結果也完全符合Pm標準，但用5對分型引物都沒有擴出特異性的帶，無法定型，這可能是因為該菌株變異較大。L Robert所分離的158株Pm也有2株無法用該PCR方法定型。

據報道，目前國內畜禽流行的多殺性巴氏桿菌莢膜血清型主要是A、B和D型，沒有E型。豬肺疫由A、B型Pm引起，D型菌株引起AR，禽霍亂由A型Pm引起[16, 17]。苑士祥等自患AR豬分離93株Pm經間接血凝試驗鑒定86株為D型（92.5%），6株為A型（6.5%），1株未定型（1%）[18]。彭發泉等報道1985-1988共分離74株Pm，有7株A型，67株D型。均為不產毒素菌株[19]。楊留戰等報道從臨床有萎縮性鼻炎的豬場分離到A型Pm 20株（5株T+Pm），D型85株（76株T+Pm）。產毒素菌株占總分離株的77.1%（81/105）。從臨床無萎縮性鼻炎的豬場分離到A型Pm1株，D型5株（1株T+Pm）[20]。本研究與國內有關報道基本一致。

我們所分離的66株Pm只有8株為產毒素菌株，所占比例僅為12.1%(8/66)，而且這8株T+Pm均分離于有PAR癥狀豬的鼻拭子，均為D型。這與國外報道的T+Pm分離比例有所差異，C Pijoan報道僅從肺臟分離的Pm就有22.8%產毒素（12.8%為A型，10%為D型）[6]，L Robert報道從肺炎癥狀豬分離的Pm僅有1.8%產毒素（0.9%為A型，0.9%為D型），從有PAR癥狀豬分離的Pm也有52.9%為T+Pm（11.7%為A型，41.2%為D型）[13]。而我們從肺臟分離的24株Pm均不產毒素，從有PAR癥狀的豬所分離的T+Pm也只占19%(8/42)。看來在我國，PAR的發生更主要的也許還是環境方面因素影響。不過，楊留戰等報道所分離的111株Pm有82株T+Pm（占73.9%）。他們用的是豚鼠皮膚壞死試驗檢測毒素，我們用的是PCR方法，綜合國內外研究表明，動物試驗檢測毒素所得T+Pm比例都偏高，可見 PCR方法特異性更強，相信也更可靠。

豚鼠皮膚壞死試驗和小鼠致死試驗檢測DNT結果與PCR檢測toxA基因結果一致，即PCR檢測為陽性的菌株，豚鼠皮膚壞死試驗和小鼠致死試驗也為陽性。雖然有2株T+Pm在第一次小鼠致死試驗時4只小鼠各有1只沒死，但在復試時攻毒小鼠全被致死。這可能與小鼠個體差異有關，也可能是這2株菌本身產毒素能力較弱。我想，PCR從基因水平檢測T+Pm比動物試驗更簡便、靈敏，也更有說服力。而且對PCR產物測序結果表明引物TA1-TA2所擴增序列相當保守，這進一步確立了該PCR檢測方法的可靠性。結 論

PAR是規?；i場的一種重要傳染病，嚴重影響豬群健康狀況及飼料利用率。當前對該病的控制主要還是靠免疫接種和藥物治療。然而，雖然幾乎所有豬場都在用萎鼻疫苗及抗生素防治，但各豬場仍時有PAR的發生，藥物治療效果也不明顯。對T+Pm的分離鑒定，為該病的快速診斷試劑及高效疫苗的研制、開發奠定了基礎。同時，對各血清型的多殺性巴氏桿菌在我國豬場流行情況以及對藥物敏感情況做了初步探討，有利于對豬巴氏桿菌病的防治。

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TANG Xian-chun1, WU Bin1, SUO Xu-feng2, WANG Da-lin2, CHEN Huan-chun1, YIN Zheng-yan1(1.Animal Pathogenic Microorganism Lab, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)(2.Luoniushan Veterinary Station, Meilan District, Haikou 571133)

Abstract: With PCR and biochemical reaction test, sixty-six strains of Pasteurella multocida(Pm)was isolated from the lung tissues of pneumonic swine or nasal swabs of swine suffering progressive atrophic rhinitis(PAR)swine.Their medicine sensitivity was then studied.PCR assay was used to type these Pm isolates, as well as test the toxA gene.Guinea pig skin test and mouse lethal test were used to study the toxigenic pasteurella muttocida(T+Pm).The results showed that all PCR positive strains were coincident with the biochemical reaction criteria of Pm.PCR typing assay indicated that forty-six strains were serogroup D, eighteen strains were serogroup A, one strain was serogroup B and one strain was untypable.And eight strains were identified as T+Pm by PCR method.Guinea pig skin test and mouse lethal test also confirm the eight isolates were T+Pm.All the eight T+Pm strains were serogroup D, and were isolated from the swine suffering severe PAR.Key words: Pm, T+Pm, PCR, typing, medicine sensitivity

第四篇：魔芋論文：嵐皋縣魔芋軟腐病和白絹病病原菌的分離鑒定和生物防控初探

魔芋論文：嵐皋縣魔芋軟腐病和白絹病病原菌的分離鑒定和生物防控初探

【中文摘要】本文主要是對陜西省安康市嵐皋縣藺河鄉光明村和立新村等不同自然村魔芋軟腐病與白絹病病原微生物的分離純化,致病性測試,生物學特性的研究,運用生理生化和分子生物學方法鑒定其病原微生物。通過室內特定條件對病原菌在不同溫度、不同酸堿度、不同抗生素與不同藥劑等條件下的生長狀況及生物學特性表現的差異性進行試驗,提出防控措施。對嵐皋縣分離得到的魔芋軟腐病病原菌的形態特征,生物學特性,致病性等進行了初步研究,結果表明導致魔芋致病的病原菌最適生長溫度25-30℃,40℃以上均不能生長;它可利用葡萄糖和乳糖,不能利用麥芽糖、蔗糖和淀粉。通過致病性試驗發現此病菌主要以土壤傳播和傷口感染為主。通過16S rDNA序列分析,初步確定該致病菌為Pectobacterium sp.,在系統發育地位上與胡蘿卜軟腐果膠菌胡蘿卜(Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora, p.c.c.)關系最近,相似性為98.64%。通過對種芋的處理以及溫度,酸堿度等室內條件下試驗,發現在種芋的處理上,對種芋處理的時間要把握好,最多不超過1小時。軟腐病原菌最適宜生長的酸堿度范圍為pH 5.0～8.0之間,其它范圍較不適宜,尤其以強酸區表現更為明顯。魔芋軟腐病原菌最適生長的溫度范圍為25℃～30℃之間,不適生長的溫度范圍為6℃以下和38℃以上區間,其中停止生長的上、下限溫度各為40℃和5℃。從安康市嵐皋縣魔芋中分離得到白

絹病病原菌,觀察其形態特征和生物學特性,考察其致病性特點,并測定其ITS序列。白絹病菌絲最適生長溫度為25-35℃,pH為6-9,可利用乳糖,半乳糖,葡萄糖,甘露醇,麥芽糖等為唯一碳源;利用甲硫氨酸、尿素、硝酸鉀、硫酸銨和蛋白胨為唯一氮源;由ITS序列鑒定分離自嵐皋縣魔芋白絹病的病原菌為半知菌亞門,絲孢綱,無孢目,小核菌屬的齊整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)。通過ITS鑒定技術,準確鑒定出引起魔芋白絹病的致病菌種類,并研究了該致病菌的生物學特性,為實際種植防治該病提供了理論依據。生物防控方法研究中,主要選用了10種抗生素做藥敏實驗,氨芐青霉素的效果最好,其次是青霉素,氯霉素,井岡霉素。在拮抗菌的篩選中,其中J-1的拮抗效果最明顯,拮抗機理需要再深入研究,為魔芋軟腐病害的生物防治提供理論。

【英文摘要】This paper is mainly for soft rot and southern blight of konjac purification of pathogens, pathogenicity tests, biological characteristics, the use of biochemical and physiological identified by molecular methods of pathogenic microorganisms in different villages such as Guangming and LixinVillage, Langao County, Ankang City, Shaanxi Province.Specific conditions of the laboratory pathogens at different temperatures, different pH, different agents such as antibiotics, and under different growth conditions and differences in biological characteristics to test the

performance of proposed control measures.The pathogenicity, morphological character and biological character of soft rot-causing bacteria, which isolated from Amorphalluskon jac growing in Langao county, Shaanxi province, were determined firstly.The results showed that the optimum temperature for these isolates were 25-30℃, but can’t grow beyond 40℃.They can utilize glucose and lactose, but not maltose or starch or maltose.The test of pathogenicity to Konjac reavealed that the pathway to widely spread was by soil and infection was through cutting of plants.16S rDNA sequence analysis of strains showed that they belonged to Pectobacterium sp.and were very closely related to Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora, p.c.c.with 98.64% sequence identity.From line treatment, by species and temperature, pH and other tests under laboratory conditions, found in the handling of species of taro, taro on the kinds of processing time to grasp, no more than 1 hour.The best optimum growth of soft rot bacteria’s pH range between pH5.0 ~ 8.0, other than the appropriate range of areas, particularly in the strong acid is more obvious.This bacteria of the original optimum growth temperature range between 25℃-30℃, the temperature range of above 38℃and below 6℃is not suitable, when the temperature below 5℃or above 40℃, the bacteria

stopped growing.The southern blight-causing bacteria were isolated from Amorphalluskon jac collected in Langao county.The becteria were identified by an almost complete ITS gene sequence analysis together with the morphological and biological properties..The results showed that the optimum temperature and pH for these isolates were 25 to 35℃and pH 4-7, respectively.They can utilize glucose, lactose, maltose, galactose and mannitol as solely carbon resource, and use methionine, unrea, potassium nitrate, ammonium sulfate and peptone as solely nitrogen.The test of pathogenicity to Konjac reavealed that the pathway to widely spread was by soil and infection was through cutting of plants.The analysis of ITS sequences of strains showed that they belonged to Sclerotium rolfsii Sacc., Agonomycetales, Hyphomycetes and Deuteromycotina.The pathogenic bacteria that cause sclerotium rolfsii disease have been determind by the ITS sequence analysis method.The results of this experiment will provide a theoretical basis for disease prevention.Prevention and control methods in biological research, mainly used to do 10 kinds of antibiotics susceptibility test, ampicillin was the best, followed by penicillin, chloramphenicol and Jinggangmycin.Screening of antagonistic bacteria in which the

antagonistic effect of J-1 the most significant antagonistic mechanism requires further in-depth research, to provide biological control of konjac soft rot damage theory.【關鍵詞】魔芋 軟腐病 白絹病 分離鑒定 生物防控

【英文關鍵詞】Konjac Soft rot Southern Blight Isolation and Identification Biological control 【目錄】嵐皋縣魔芋軟腐病和白絹病病原菌的分離鑒定和生物防控初探摘要5-6

ABSTRACT6-7

10-11

第一章 文獻綜述1.2 魔芋研究進展12-15

1.3.1 魔芋軟腐10-2011-121.1 引言1.3 魔芋病害研究進展

12-14病研究進展14-15

1.3.2 魔芋白絹病的研究進展

1.4 軟腐病1.3.3 魔芋其他病害的研究進展

15-1816-17和白絹病綜合防控措施的研究進展施措施15-1617-181.4.2 生物防控措施1.5 研究內容

1.4.1 農業防控措1.4.3 藥劑防控

1.6 立題依據及研究意義18-20究20-32第二章 魔芋軟腐病病原菌的分離鑒定與生物學特性研2.1 采樣地概況2.2.1 主要試劑2.3 方法

2.2 材料20-2120-2121-22

2.2.2 主要培養基2.3.1 樣品采集22

2.3.3 目的菌的形態

21-252.3.2 目的菌分離純化

22-23觀察與生物學特性的研究23

2.3.4 目的菌的致病性研究

23-25

2.4 結2.3.5 病原菌的16S rDNA 序列研究

果與分析25-2626-2825-302.4.1 分離株與致病性檢測結果2.4.2 病原菌形態觀察結果與生物學特性2.4.3 分子鑒定

28-30

2.5 討論

30-32第三章 魔芋白絹病病原菌的分離鑒定與生物學特性研究32-4132-34測定343.1 材料與方法3.1.2 病原菌的分離與純化

32-3634

3.1.1 采樣3.1.3 致病性的3.1.4 病原菌絲體的形態觀察及生物學特性測定3.1.5 病原菌的ITS 序列分析36-39

35-36

3.2 結果34-35與分析3636-39

3.2.1 病原菌分離與純化與致病性3.2.2 病原菌形態觀察與部分生物學特性3.3 討論

3.4 結論

41-464143-4543-44參考文獻致謝

39-41

第四章 魔芋軟腐病生物防控研究初探41-4341-434344-4550-51544.1.1 試驗材料4.2 結果與分析4.2.2 拮抗菌的抑菌率4.3 小結附錄

45-46

4.1 材料與方法4.1.2 試驗方法

4.2.1 分離菌4.2.3 藥敏性實驗46-50

縮略詞作者簡介

51-5353-54

第五篇：粗提技術論文：壇紫菜R-藻紅蛋白的分離純化工藝與分析鑒定

粗提技術論文：壇紫菜R-藻紅蛋白的分離純化工藝與分析鑒定

【中文摘要】藻紅蛋白作為壇紫菜中的一種重要生理活性物質,已廣泛應用到食品、輕工業、化妝和醫藥等行業,具有很高的經濟價值。目前藻紅蛋白主要是從紅藻中分離提取獲得,現已報道的分離純化工藝多為破壁粗提,鹽析沉淀粗分離再結合多步色譜層析純化獲得,這種工藝存在多種問題,比如細胞破碎不充分,提取效率較低、鹽析沉淀操作步驟繁瑣、多步柱層析成本較高等等,使得藻紅蛋白生產難以工業化,高純度藻紅蛋白價格十分昂貴,極大限制了藻紅蛋白的廣泛應用。故本文針對壇紫菜R-藻紅蛋白分離純化存在的一系列問題,對比了多種破壁粗提技術并加以條件優化,結合兩步色譜層析,建立了壇紫菜R-藻紅蛋白分離純化新工藝,為藻紅蛋白大規模開發和利用提供了理論基礎和科學依據。(1)壇紫菜R-藻紅蛋白是胞內蛋白,破壁技術作為藻紅蛋白提純的第一步直接關系到原料的利用率和藻紅蛋白的生產成本,具有十分重要的意義。故本研究比較了4種具有大規模提取應用前景的粗提技術——溶脹法、化學處理法、超聲波法和攪切法對壇紫菜R-藻紅蛋白的提取效果,以R-藻紅蛋白提取得率、純度和提取時間為參數,確定攪切法為最佳粗提技術,并對這種方法的物料比、攪切轉速和攪切時間進行了優化,結果表明當物料比為1：...【英文摘要】As an important physiological active substance of Porphyra haitanensis, R-phycoerythrin is widespread applied

in food, cosmetics and pharmaceutical industry with a very high economic value.At present phycoerythrin is mainly separated from the red algae.There are many reports of the separation and purification about it at home and abroad.Conventional protein purification procedures involve three steps:pretreatment of the sample to allow the intracellular material to become liberated, making a crude extract...【關鍵詞】粗提技術 離子交換色譜 凝膠過濾色譜 壇紫菜R-藻紅蛋白 分離純化

【英文關鍵詞】Extraction and Purification Ion Exchange Chromatography Gel Filtration R-phycoerythrin Analysis 【目錄】壇紫菜R-藻紅蛋白的分離純化工藝與分析鑒定4-611-1212-17Abstract6-7

目錄8-11

引言

摘要1 文獻綜述12-241.1 藻紅蛋白的概論

12-13

1.1.2 藻紅1.1.1 藻紅蛋白與藻膽蛋白

13-15蛋白的結構與組成15-16

1.1.3 藻紅蛋白的分類

16-17

1.2 藻紅蛋1.1.4 藻紅蛋白的理化性質白的應用17-1917-1818

1.2.1 在免疫熒光技術方面的應用1.2.2 在食品行業和精細化工方面的應用1.2.3 在醫藥保健藥物開發方面的應用18-19

1.3.1 破壁粗提

1.4 藻紅蛋白的分離純

1.3 藻紅蛋白的提取與粗分離19-2119-201.3.2 粗制方法20-21

化21-22221.4.1 吸附層析21-221.4.2 離子交換層析1.4.3 凝膠柱層析221.5 本文研究內容及技術路線22-2424-362424-252525-2729-3235-3636-553637-382 壇紫菜R-藻紅蛋白的粗提技術的比較2.1 材料與方法24-25

2.1.1 材料與試劑2.1.3 細胞破碎方法2.1.2 儀器及設備242.1.4 壇紫菜R-藻紅蛋白得率和純度的計算2.2 結果與討論25-352.2.2 化學處理法27-292.2.4 攪切法32-35

2.2.1 溶脹法

2.2.3 超聲破碎法2.3 本章小結3 壇紫菜R-藻紅蛋白的分離純化工藝的建立3.1 材料與方法36-383.1.2 儀器與裝置36-373.2 結果與討論38-53

3.1.1 材料與試劑3.1.3 實驗方法3.2.1 離子交換介質種

3.2.3 類的選擇39-40起始緩沖液pH的優化44-47化47-48

3.2.2 緩沖液種類的選擇40-4242-44

3.2.4 洗脫液鹽濃度的優化

3.2.6 洗脫流速的優

3.2.8 不3.2.5 上樣體積的優化473.2.7 離子交換層析的放大48-49

49-50

3.2.9 凝膠過濾層析同孔徑超濾膜的選擇50-533.3 本章小結53-554 壇紫菜R-藻紅蛋白的分

4.1.1 材料與試析鑒定55-65劑5555-58

4.1 材料與方法55-584.1.2 儀器與設備554.2 實驗結果58-63

4.1.3 實驗方法4.2.1 紫外可見吸收光譜

分析58-604.2.2 熒光光譜分析60-62

62-63

4.2.3 Native

結論和SDS-PAGE電泳分析與展望65-67

4.3 本章小結63-65

參考文獻67-71

致謝72-73

攻讀碩士學位期間發表學術論文情況71-72