第一篇：分子生物實驗報告及討論

蛋白質SDS-PAGE分離和Western Blot

一、實驗目的

1． 掌握SDS-PAGE分析的原理和技術，應用于蛋白質的分析和鑒定。

2． 實驗采用HL60細胞總蛋白作為材料，進行SDS-PAGE后，用半干式轉移法將蛋白質轉移到PVDF膜上，應用Western Blot分析技術，分析PVDF膜上的c-Myc蛋白。通過本實驗，掌握半干式轉移的操作和Western Blot的基本原理和操作技術。

二、實驗原理

1.蛋白質SDS-PAGE原理

聚丙烯酰胺凝膠是用丙烯酰胺和交聯劑亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合而成。化學聚合的催化劑通常多采用硫酸銨或過硫酸鉀，此外還需要一種脂肪族叔胺作為加速劑，最有效的加速劑為N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED），在叔胺的催化下，由過硫酸銨形成的氧自由基，后者又使單體形成自由基，從而引發聚合作用。聚丙烯酰胺凝膠的機械強度好，有彈性且透明，相對的化學穩定，對PH和溫度變化較穩定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的，沒有吸附和電滲作用。通過改變濃度和交聯度，可以控制孔徑變動在極廣范的范圍，并且之制備凝膠的重復性好。

聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離蛋白質的方法有很多種。本實驗采用SDS-PAGE法。SDS能使蛋白質的氫鍵、疏水鍵打開，并結合到蛋白質分子上，形成蛋白質-SDS復合物。在一定條件下，SDS與大多數蛋白質的結合比為1.4g SDS/1g 蛋白質。由于十二烷基硫酸根帶負電，是各種蛋白質的SDS-復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質間原有的電荷差別。SDS與蛋白質結合后，還引起了蛋白質構象的改變。蛋白質-SDS復合物的流體力學和光學性質表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為1.8nm，而長軸則隨蛋白質的分子量成正比的變化。這樣的蛋白質-SDS復合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度也就是蛋白質分力量的函數。不同的凝膠濃度合適用于不同的分子量范圍，可根據所測分子量范圍選擇最適合的凝膠濃度，并盡量選擇分子量范圍和性質與待測樣本相近的蛋白質作為標準蛋白質。

并非所有的蛋白質都能用SDS-PAGE測定其分子量，已發現有些蛋白質用這種方法測出的分子量是不可靠的。這些蛋白質有：電荷異常或構象異常的蛋白質、帶有較大輔基的蛋白質（如某些糖蛋白）以及一些結構蛋白，如膠原蛋白。2.Western Blot原理

Western Blotting是將蛋白質轉移并固定在化學合成膜的支撐物上，然后以特定的親和反應、免疫反應或結合反應以及顯色系統分析此印記。經過SDS-PAGE分離的蛋白質樣品，轉移至固相載體（如PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能 保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢查電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。Western Blotting一般分五個步驟：

（1）固定：蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE并從凝膠上轉移到PVDF膜上。

（2）封閉：封閉膜上沒有特殊抗體結合的場所，使其處于飽和狀態，以減少非特異性結合。（3）第一抗體與抗原的特異性結合。

（4）第二抗體或配體試劑與第一抗體的特異性結合并作為指示物。

（5）被適當保溫后的酶標記蛋白質區帶，產生可見的、不溶解狀態的顏色反應。本實驗采用HL60細胞總蛋白作SDS-PAGE，經半干式轉移將電泳所分離出的蛋白條帶轉移到PVDF膜上，用兔抗人c-Myc多克隆抗體作為第一抗體與c-Myc蛋白發生反應，然后用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG作為第二抗體與第一抗體結合，經過顯色底物的顯色檢測c-Myc蛋白。

三、實驗器材和試劑 詳見實習指導。

四、實驗步驟

1.安裝并組裝夾板，依次灌制分離膠和濃縮膠。2.上樣電泳。

3.裁剪膠體2cm*7cm兩份，一份用考馬斯藍染色，最后脫色觀察結果。4.上述另一份樣本經半干式轉移至PVDF膜上，轉膜后封閉 5.依次與第一抗體和第二抗體結合，顯色。

五、實驗結果

1.蛋白質SDS-PAGE結果 相比于marker帶，樣本帶為HL60細胞中總蛋白所電泳出的條帶，由于總蛋白中各蛋白質分子量各異，故所形成的SDS-蛋白質復合物的橢圓棒長度各異，進而電泳后出現多個距離相近的條帶，下一步Western Blot所檢測的c-Myc蛋白亦在其中。

而marker和樣本總蛋白條帶均比較寬而模糊，原因為染色后存放時間太久，凝膠存在一定的孔徑，SDS-蛋白質復合物于凝膠中向周圍擴散，染料亦擴散，最終使條帶不集中和清晰。2.Western Blot結果

樣本帶中紅色的條帶為顯色的c-Myc蛋白條帶。其處于marker第二和第三條帶之間，分子量符合預測結果（一般于SDS-PAGE上表觀分子量為62KD）。而顯色結果不理想，其原因在后文中有詳細討論。

六、注意事項

1.聚丙烯酰胺具有很強的神經毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有積累性。稱量聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺時應帶手套和面具。聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因可能會含有少量未聚合材料。

2.SDS的微細晶粒易于擴散，稱量時要戴面罩。稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區和天平上的SDS。SDS溶液無需滅菌。

3.用封口機密封塑料袋時要盡量排除藏匿的氣泡。

4.拿取凝膠、Blotting Paper和PVDF膜時必須戴手套，因為皮膚上的油脂和分泌物會阻止蛋白質從凝膠向濾膜轉移。

5.封閉液的作用是封閉未吸附蛋白的部位，以減少非特異性結合背景的影響。

6.PBST是一種磷酸鉀、鈉鹽溶液，既可穩定蛋白質固定于PVDF膜上，同時又可以洗去多余的封閉液及其雜質。Tween-20是一種非離子型的蛋白去污劑，它可以出去免疫探針的非特異性結合，使免疫反應背景更加清晰。

7.轉移過程中電壓不應大于50V，若電泳初始電壓大于20V，則應檢查離子強度對不對，若轉移過程中電壓增加幅度大于10V或溫度增加，則表示buffer感和，此時應停止電泳，多加幾層濕的blotting paper。8.PVDF膜最好一次放到位。

9.Westing Blot可檢測出1-5ng中等大小的蛋白質。

七、實驗討論

1.配膠緩沖液系統對電泳產生的影響？

在SDS－PAGE中，加入緩沖液后，濃縮膠中pH環境呈弱酸性，甘氨酸解離很少，在電場的作用下泳動效率低。而氯離子濃度卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓梯度，使蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。

當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加而呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，緊隨氯離子之后。同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。

綜上可見，環境pH對整個反應體系的影響至關重要，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。2.配制凝膠的注意點？

使聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。勿即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。可待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。

3.凝膠時間不對，或慢或快的原因？

通常膠在30min—1h內凝固。如果凝的太慢，可能是TEMED或APS劑量不夠或者失效。APS應該現配現用，TEMED不穩定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。4.電泳條帶出現“微笑”、“皺眉”或拖尾現象的原因及處理方法？ “微笑”狀條帶即為兩邊翹起中間凹下的形狀。主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中，可待其充分凝固再作后續實驗。

“皺眉”條帶即為兩邊向下中間鼓起的形狀。主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈，可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

拖尾現象主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理方法如下：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。

5.什么是“鬼帶”，如何處理？

“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。6.電泳的條帶很粗的原因？

電泳中條帶很粗較常見，主要是未濃縮好。其處理辦法為適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓等。

7.濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？ 前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。一般對電泳不會有太大的影響。8.電泳時間比正常要長的原因？

可能由于凝膠緩沖系統和電級緩沖系統地PH選擇錯誤，即緩沖系統地PH和被分離物質的等電點差別太小，或緩沖系統的離子強度太高。9.背景過高的原因及解決辦法？

背景過高可能原因如下：1）抗體濃度過高； 2）封閉液選擇不當； 3）封閉不完全； 4）抗體與封閉液中其他蛋白發生交叉反應；5）清洗不充分； 6）曝光時間過長； 7）膜出問題；8）緩沖液污染或長菌9）儀器污染。其相應的解決辦法為：1）降低抗體（一抗/二抗）濃度；2）比較不同封閉液供進一步選擇；3）根據不同的體系優化封閉液，提高封閉物濃度，優化封閉時間和（或）溫度，室溫下至少1小時或4℃過夜，在封閉液中添加終濃度0.05%的Tween-20，用含終濃度0.05%的Tween-20的封閉液稀釋抗體；4）更換封閉液，封閉一張干凈的不含蛋白的膜，抗體孵育后檢測；5）增加清洗次數及清洗液體積，如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至終濃度0.05%；6）縮短曝光時間；7）確保轉膜前，根據指導將膜徹底浸潤；更換新膜，確保膜始終有足夠的液體覆蓋避免干掉，避免徒手操作，應配戴手套，使用鑷子，每一步孵育都應確保充分；8）重新配制緩沖液；9）確保轉膜儀、雜交儀等儀器清潔無污染，確保轉膜后膜上沒有殘留的膠。

10.轉膜不充分的原因和解決辦法？ 轉膜不充分的可能原因如下：

1）膜沒有完全均勻濕透；2）靶蛋白分子量小于10,000；3）靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH 值；4）甲醇濃度過高；5）轉移時間不夠。其分別的解決辦法為：

1）使用100%甲醇浸透膜；2）選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間；3）可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液；4）過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替；5）對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間。

11．沒有陽性條帶或陽性條帶比較弱的原因及解決辦法？ 無陽性條帶的原因：

1）抗體染色不充分；2）酶活性降低或失活；3）標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低；4）試劑不匹配；5）抗體活性降低或失效；6）封閉過度；7）曝光時間過短。其分別的解決辦法為：

1）增加抗體濃度，延長孵育時間；2）直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物；3）設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。；4）一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性；5）選擇在有效期內抗體；并選擇現配現用的工作液；6）減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型；7）延長曝光時間。12.原因：

1）二抗的非特異性結合；2）一抗的特異性不夠；3）蛋白降解；4）二聚體或多聚體存在；5）抗體濃度過高；6）蛋白上樣量過大。其解決辦法為：

1）增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的）；2）使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性；3）使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑；4）增加蛋白質變性過程及強度；5）降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶；6）降低上樣量。

第二篇：分子生物課件

?經典的基因概念：三位一體基因：突變的最小單位 重組的最小單位 功能的最小單位

?現代的基因概念： 1基因具有精細結構： 重組子（recon）突變子（muton）順反子（cistron）

2基因序列的多樣性：跳躍基因 斷裂基因 重復序列 假基因

?突變子：突變單位，基因內部有許多突變位點，也稱突變子（muton）即突變后產生變異的最小單位。?重組子：重組單位，基因內部有多個重組單位，也稱重組子（recon）不能由重組分開的最小單位。

?順反子（cistron，又叫作用子）：功能單位，從功能單位的意義上講，一個順反子相當于一個基因的DNA或RNA單元，它的產物是一個完整的肽鏈或者RNA分子，平均大小約為500-1500bp。

?斷裂基因(split gene)：指基因內部被一個或更多不翻譯的編碼順序即內含子所隔裂。1977年美國的Sharp和Roberts兩組科學家分別同時發現。

內含子(intron)：?在成熟mRNA的片段中未反應出的DNA區段(ABCDEFG)非編碼序列 外顯子(extron/exon):?DNA序列中被轉錄成為mRNA中的片段(1234567)?編碼序列 ?重疊基因(overlapping gene)：兩個或兩個以上的基因共有一段DNA序列的現象

?重復序列：是指在一個DNA分子中出現不止一次的序列，重復序列可彼此相同方向（正向重復）也可以相反方向（反向重復）?根據重復程度，可以將DNA序列分為三種類型：

–單一或輕度重復序列：基因組中只有一個拷貝或重復頻率很低的序列； –中等重復序列：重復次數幾十次到幾百次的序列； –高度重復序列：重復次數幾百次到幾百萬次的序列

?跳躍基因：是一類反轉座子(retrotransposon)，即通過RNA中間產物在天然狀態下由基因組中一個位點進行復制，插入到基因組其它位點從而整合到基因組中的DNA序列。?跳躍基因可引起基因組發生大范圍基因重排。

?假基因（pseudogene）：在多基因家族，核苷酸組成序列上與有功能的基因非常相似，但不具正常功能的基因 根據基因的轉錄和翻譯功能可以把基因分為三類

?第一類是編碼蛋白質的基因，它具有轉錄和翻譯功能，包括編碼酶和結構蛋白的結構基因以及編碼阻遏蛋白的調節基因 ?第二類是只有轉錄功能而沒有翻譯功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因

?第三類是不轉錄的基因，它對基因表達起調節控制作用，包括啟動基因和操縱基因 ?基因組–細胞內遺傳信息的攜帶者DNA的總體

?細胞核（chromosome DNA）?細胞質（mitochondrion DNA）?基因組中不同的區域具有不同的功能 –有些區域編碼蛋白質的結構基因 –有些區域復制及轉錄的調控信號 –有些區域的功能尚不清楚 病毒的結構和功能

?病毒不能獨立地復制，必需進入宿主細胞中，借助細胞內的一些酶類和細胞器才能使病毒得以復制 ?外殼蛋白（或被膜）的功能是1–識別和侵襲特定的宿主細胞 2保護病毒基因組不受核酸酶的破壞

病毒基因組的結構特點

1.病毒基因組大小相差較大，與細菌或真核細胞相比，病毒的基因組很小 2.病毒基因組只有一種核酸組成：DNA或RNA 3.多數RNA病毒的基因組是由連續的

4.基因重疊，即同一段DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質分子

5.基因組的大部分可編碼蛋白質，只有非常小的一部份不編碼蛋白質（通常是基因表達的控制序列）6.形成多順反子結構（polycistronie 7.除了反轉錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個基因在病毒顆粒中只出現一次 8.噬菌體（細菌病毒）的基因是連續的，而真核細胞病毒的基因是不連續的

乳頭瘤病毒（papillomavirus）是感染人和動物皮膚粘膜并引起乳頭狀瘤病變的一種DNA病毒 ?屬于乳多空泡病毒（papovavirus）科 ?根據病毒感染的宿主不同可以分為

–牛乳頭瘤病毒（BPV）–人乳頭瘤病毒（HPV）乙肝病毒基因組的結構和功能

（一）?乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是目前已知的感染人類的最小的雙鏈DNA病毒 ?HBV的基因組結構顯得特別精密濃縮，基因組DNA結構奇特

?環狀的部分雙螺旋結構，長約3.2kb。其中的2/3為雙螺旋結構，1/3為單鏈，DNA中的兩條鏈不等長 ?長鏈為負鏈，5’端與3’端無共價連接，而是與一種蛋白質共價相連

?短鏈為正鏈，長度視病毒而異，一般長約1.6-2.8kb,約為長鏈的2/3，短鏈之間的空隙可由病毒顆粒中的DNA聚合酶充填 1.重疊的基因序列比較多 –已確定的開放讀碼框架（open read frame，ORF）有4個，分別編碼： ?病毒的核殼（C）?包膜（S）蛋白

?病毒復制酶（聚合酶)?與病毒基因表達有關的蛋白質（X）2.調節序列位于基因內部

–啟動子存在于編碼蛋白質序列內

–增強子（enhancer）位于聚合酶基因中 –polyA附加信號位于CORF中

–皮質激素敏感因子（GRE）位于SORF和聚合酶基因中 HBV DNA復制過程

1.以“-”鏈DNA 為模板合成全長的“+”鏈RNA（稱為前基因組RNA）（親代“-”鏈DNA →“+”鏈RNA）

2.該“+”鏈RNA被包裝在未成熟的核心樣顆粒中，同時還有DNA 聚合酶和一種蛋白質也被包裝在顆粒中（“+”鏈RNA等包裝成病毒核心顆粒）

3.在該顆粒中，再以“+”鏈RNA 為模板由反轉錄酶催化合成“-”鏈DNA（“+”鏈RNA→子代“-”鏈DNA）

4.“+”鏈DNA的合成便以該“-”鏈DNA為模板和一段RNA為引物而聚合延伸，核心樣病毒顆粒成為成熟的病毒顆粒。這時，“+”鏈DNA還沒有合成完畢，因而造成病毒基因組兩條DNA鏈長度不一樣（子代“-”鏈DNA →子代“+”鏈DNA）細菌染色體基因組結構 1.形成類核（nucleoid）由一條環狀雙鏈DNA 分子組成細菌的染色體，并相對聚集在一起，形成一個較為致密的區域類核無核膜與胞漿分開，類核的中央部分由RNA和支架蛋白組成，外圍是雙鏈閉環的DNA超螺旋 2.染色體DNA通常與細胞膜相連連接點的數量隨細菌生長狀況和不同的生活周期而異在DNA鏈上，與DNA復制、轉錄有關的信號區域與細胞膜優先結合 3操縱子結構

結構基因為多順反子，若干個功能相關的結構基因串聯在一起，受同一個調節區的調節 數個操縱子還可以由一個共同的調節基因（regulatorygene）即調節子（regulon）所調控

4.結構基因都是單拷貝，rRNA基因為多拷貝基因組DNA中不編碼的部份所占比例比真核細胞基因組少得多 原核生物終止子有強、弱之分強終止子：含有反向重復順序，可形成莖環結構，其后面為polyT結構，無需終止蛋白參與即可使轉錄終止弱終止子：也有反向重復序列，但無polyT結構，需要有終止蛋白參與才能使轉錄終止

DNA分子組成operon）結構rRNA基因是多拷貝isogene).DNA序列，包括插入序列和轉座子DNA分子中具有多種功能的識別區域

大腸桿菌染色體基因組的結構和功能—1

?大腸桿菌基因組含有3500個基因，已被定位的有900個左右

?900個基因中，有260個基因已查明具有操縱子結構，定位于75個操縱子中 ?已知的基因中，8 ％的序列具有調控作用

大腸桿菌染色體基因組中已知的基因多是編碼酶類的基因 ?合成代謝酶類基因：氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸維生素

?分解代謝酶類基因：碳、氮化 合物

具有相關功能的基因在一個操縱子內，由一個啟動子轉錄 ?大多數基因的相對位置是隨機分布的

?雙向轉錄：DNA兩條鏈作為模板指導mRNA合成的機率差不多相等

?在已知轉錄方向的50個操縱子中，27個操縱子按順時針方向轉錄，23個操縱子按反時針方向轉錄 ?在大腸桿菌染色體基因組中，基因都是單拷貝基因

?在某種特殊環境下，需要有多拷貝基因來編碼大量的基因產物 基因組上的各個基因的位置與其功能的重要性可能有一定的聯系

ProkaryoteGenome

1、常僅由一條環狀雙鏈

2、只有一個復制起始點

3、具有操縱子結構

4、編碼順序一般不會重疊

5、基因是連續的，無內含子，轉錄后不需剪接

6、編碼區在基因組中所占比例大于真核基因組，小于病毒基因組

7、基因組中重復序列少，一般為單拷貝，8、具有編碼同工酶的基因

9、基因組中存在可移動的DNA序列，包括插入序列和轉座子

10、在DNA分子中具有多種功能的識別區域 真核生物基因組特點

1.基因組DNA與蛋白質結合形成染色體，儲存于細胞核內，除配子細胞外，體細胞內基因組是雙份的（即雙倍體，diploid），有兩份同源的基因組

2.基因轉錄產物為單順反子。一個結構基因經過轉錄生成一個mRNA分子，再翻譯生成一條多肽鏈 3.存在重復序列，重復次數可達百萬次以上 4.基因組中不編碼的區域多于編碼的區域

5.大部分基因含有內含子，因此，基因是不連續的（斷裂基因，split gene）

6.基因組遠遠大于原核生物的基因組，具有許多復制起始點，而每個復制子的長度較小 高度重復序列high repeated sequence?

在基因組中所占比例隨種屬而異，約占10-60％，在人基因組中約占20 ％。高度重復順序又按其結構特點分為三種 種類–1反向重復序列–2衛星DNA–3較復雜的重復單位組成的重復順序 高度重復順序的功能

1.調節反向序列常存在于DNA復制起點區的附近。另外，許多反向重復序列是一些蛋白質（包括酶）與DNA的結合位點 2.參與基因表達的調控DNA的重復順序可以轉錄到核內不均一RNA（hnRNA）分子中，并形成發夾結構，這對穩定RNA分子，免遭分解有重要作用

3.參與轉位作用：幾乎所有轉位因子的末端都包括反向重復順序，長度由幾個bp到1400bp。由于這種順序可以形成回文結構，因此在轉位作用中既能連接非同源的基因，又可以被參與轉位的特異酶所識別

4.與進化有關：不同種屬的高度重復順序的核苷酸序列不同，具有種屬特異性，但相近種屬又有相似性。如：人與非洲綠猴的α衛星DNA長度僅差1個堿基（前者為171 bp，后者為172bp），而且堿基序列有65％是相同的，這表明它們來自共同的祖先

5.同一種屬中不同個體的高度重復順序的重復次數不一樣，這可以作為每一個體的特征，即DNA指紋

6.α衛星DNA 成簇的分布在染色體著絲粒附近，可能與減數分裂時染色體配對有關，即同源染色體之間的聯會可能依賴于具有染色體專一性的特定衛星DNA順序 中度重復序列middle repeated sequence ?重復數十至數萬（<105）次?復性速度快于單拷貝順序，但慢于高度重復順序?約占基因組10-40％，種屬之間差異很大（人12％）?大多不編碼蛋白質，其功能可能類似于高度重復順序?存在于結構基因之間、基因簇、內含子，大多數與單拷貝基因間隔排列?具有種特異性

?Alu家族?KpnⅠ家族?Hinf家族?多聚dＴ－dＧ家族?rRNA基因?tRNA基因?HLA基因?組蛋白基因?免疫球蛋白基因 中度重復順序

1?短分散片段（short interspersed repeated segments, SINES）–重復順序的長度：平均長度約為300bp

–基因組中排列方式：與平均長度約為1000 bp的單拷貝順序間隔排列 –拷貝數：10萬左右?Alu家族?Hinf家族，等

2?長分散片段（Long interspersed repeated segments, LINES）–重復順序的長度：平均長度為3500-5000bp–基因組中排列方式：與平均長度為13000 bp（個別長幾萬bp）的單拷貝順序間隔排列–拷貝數：1萬左右?KpnⅠ家族，等 中度重復順序——Alu家族

?含量最為豐富的一種中度重復順序家族?單倍體人類基因組中，重復達30萬-50萬次，約占人基因組的3-6％

?Alu家族每個成員的長度約300bp?限制性內切酶Alu（AG↓CT）可將其切為兩段（130和170bp），因而定名Alu家族（Alu序列）?Alu序列分散在基因組中（間隔區DNA，內含子），平均每5kbDNA有一個Alu順序?Alu順序具有種特異性 ?Alu序列5’端比較保守Alu家族在基因組中廣泛分布的原因可能是： –Alu順序先轉錄成RNA 分子，再經反轉錄成cDNA，然后重新插入基因組所致 –有人認為：Alu序列兩側存在6-20bp重復順序，很象轉座子。能夠移動 Alu家族的功能是多方面的： –可能參與hnRNA的加工與成熟 –與遺傳重組及染色體不穩定性有關 –有形成Z-DNA的能力 –可能具有轉錄調節作用 中度重復順序——KpnⅠ家族

?中度重復順序中的第二大家族，拷貝數約為3000—4800個，人體基因組中約占1％

?KpnⅠ順序較長（如：人KpnⅠ順序長6.4kb），屬于長分散片段，散在分布于單拷貝基因間 ?限制性內切酶KpnⅠ可將其切為4個片段（1.2、1.5、1.8、1.9kb），因此得名

?KpnⅠ家族中至少有一部份通過KpnⅠ順序轉錄成RNA，再逆轉錄為cDNA，重新插入到基因組DNA中 ?3’端有廣泛的同源性

中度重復順序——Hinf家族

?Hinf家族：以319bp長度的串聯重復存在于人體基因組中 ?用限制性內切酶HinfⅠ消化人體DNA，可以分離到這一片段

?Hinf家族在單倍體基因組內約有50—100 個拷貝，分散在不同的區域

?319bp單位可以再分成兩個亞單位，分別為172bp和147 bp，它們之間有70%的同源性

中度重復順序——多聚dT-dＧ家族?多聚dＴ-dＧ家族的基本單位是：dＴ-dＧ雙核苷酸，多個dＴ-dＧ雙核苷酸串聯重復在一起，分散于基因組中?在人基因組中，多聚dＴ-dＧ順序平均長度為40bp，達106拷貝

?功能–可能是基因轉變或不等交換的識別信號–多聚dT-dＧ中，嘌呤和嘧啶的交替順序有助于Z-DNA的形成，在基因調節中起著重要作用

中度重復順序——rRNA基因

?真核生物有4種rRNA（18S、28S、5S、5.8S）–18S、28S和5.8S rRNA基因在同一轉錄單位 –5S rRNA

?在低等真核生物（如：酵母）中也和18S、28SrRNA在同一轉錄單位；

?在高等生物中，5S rRNA位于1號染色體，單獨轉錄，其重復次數高于18S和28S rRNA基因

?rRNA基因通常成簇存在，而不是分散于基因組中，這樣的區域稱為rDNA區 染色體的核仁組織區（nucleolus organizer region）就是rDNA區

真核基因組的另一特點就是存在多基因家族（multigenefamily）?多基因家族是指由某一祖先基因經過重復和變異所產生的一組基因 多基因家族大致可分為兩類：

?一類是：基因家族成簇地分布在某一條染色體上，其可同時發揮作用，合成某些蛋白質（如：組蛋白基因家族就成簇地集中在第7 號染色體長臂3 區2 帶到3 區6 帶區域內）

?另一類是：一個基因家族的不同成員成簇地分布不同染色體上，這些不同成員編碼一組功能上緊密相關的蛋白質（如珠蛋白基因家族）

在多基因家族中，某些成員并不產生有功能的基因產物，這些基因稱為假基因（pseudo gene）

?假基因與有功能的基因同源，原來可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或點突變等，使這一基因失去活性，成為無功能基因

在哺乳動物包括人體基因組中，存在著大量的非編碼順序。這些順序中，只有很小一部份具有重要的調節功能，絕大部部分都沒有什么特殊功用。在這些DNA序列中雖然積累了大量缺失，重復或其他突變，但對生物并沒有什么影響，它們的功能似乎只是自身復制，所以人們稱這類DNA為自私DNA或寄生DNA（parasite DNA）人類基因組（human genome）人類細胞中所有遺傳信息的總和由兩個基因組組成 –核基因組（復雜）–線粒體基因組（簡單）

重要的遺傳信息存在于核基因組內

遺傳信息表現 ——特異多肽（在胞漿核糖體上合成）線粒體基因組(Mitochondrial genome)雙鏈環狀 DNA 基因排列高度緊湊，總長為16569bp，兩鏈DNA的堿基組成差異很大 ––重鏈（H 鏈）富含鳥嘌呤––輕鏈（L 鏈）富含胞嘧啶 細胞內的數目：數千拷貝 特點：呈母系遺傳方式

––精子中僅含極小量線粒體基因組

––受精卵中線粒體基因組幾乎都來自卵子

在減數分裂過程中，卵子的線粒體 DNA分子完全隨機地分配到兩個子代細胞中 ?線粒體基因組

共含 37個基因–鏈編碼 28個–鏈編碼9個

13個可轉錄為mRNA，并在線粒體核糖體上翻譯為多肽，參與組成氧化磷酸化系統 22個編碼tRNA2 個編碼rRNA線粒體基因組高度壓縮、約93％的順序參與基因的％ ?編碼不含有內含子，大多彼此相接，甚至部分重疊

?唯一一個有意義的非編碼區是替代環displacement loop））?與三鏈DNA結構形成相關

?含有Ｒ鏈和 L鏈轉錄的主要啟動核基因組(Nuclear genome)? 分布于24條不同類型的DNA雙鏈上––22條常染色體–2條性染色體（X、Y））? 堿基組成和基因密度的區域差異明顯 ? DNA含量占總量99%以上

? 每條染色體長度 50 —250 Mb

? 標準 Giemsa染色：有550條深淺相間區帶

人類基因的組織特點?功能相似或相關的基因常常分布在不同的染色體上（偶爾聚集在一起）?基因的大小和內部組織差異極大––大小：幾個Kb ——數百個Kb––組織：含重復序列，常常位于編碼序列，與蛋白質的重復結構形成有關?重疊基因和基因內基因，極為罕見

編碼序列僅占全部核基因組的3%?絕大多數基因位于核基因組，但具體數字目前尚不清楚––根據突變負荷（mutational load）和人基因的平均突變率進行理論計算，提示：上限為100000個––根據已知基因組序列、CpG島數目以及表達序列標記分析，估計：總數為65000-80000個，是所有基因的99.98％ CpG 島（CpGisland）

?基因組中有高密度的CpG二核苷酸對的單拷貝序列

?人基因組在約40%的組織特異性表達基因的5’上游序列中含有這種序列，因此CpG島經常被作為搜尋未知基因的一個參考標志

?CpG島中的C是最易被甲基化的底物，而其甲基化又與受之調控的基因的表達程度有關，因此研究CpG甲基化是研究基因調控的一個重要方面 人類基因組

多基因家族和重復順序DNA

? 二倍體細胞的核基因組中的 DNA序列通常以2個等位基因拷貝的方式存在 ? 40％的人類核基因組由一組緊密相關的非等位性DNA序列構成

? DNA序列家族：由具有序列相似性（或同源性）的DNA構成。實際上是一類重復序列 ? 包括：多基因家族（具有功能）非基因的重復 DNAD序列家族

多基因家族（multigenefamily）

特點： 1.各成員總的序列相似性不同，特殊序列的保守程度也不一樣

2.可緊密地成簇分布（特異的亞染色體區）也可廣泛地散在分布 3.RNARNA基因家族常含數目眾多的家族成員 4.常含有假基因和基因片段

5.基因簇中個體基因的表達可能由共同的基因座控制區協調 6.散在分布的基因家族常含有許多加工過的假基因

基因家族

? 經典的基因家族 ：各成員之間的序列高度同源，表明其在進化和功能上相關的重要特征

? 具有大而高度保守功能區的基因家族 ：各成員編碼的一些產物具有高度保守的功能區，這些往往在發育過程中起著很重要的作用

? 具有小段保守氨基酸基序的基因家族 ：各成員的 DNADNA序列可能并不明顯相關，不過所編碼的產物卻具有共同的功能特征，存在小段保守順序（氨基酸基序）

? 超基因家族： 其產物總的看來有相關的功能，但缺乏 大片段的DNA同源序列，也無明顯的保守氨基酸基序，而是大體上有共同的結構特征。這些基因似乎進化上有親緣關系，但與那些經典的基因家族或保守功能區／基序家族相比，親緣關系較遠，故將這些稱為基因超家族

––HLA基因、TCR基因等產物與免疫系統功能相關，盡管其同源性很低，但相似的功能及總的功能區結構提示：其同屬IgIg超家族，但進化上親緣關系較遠TT基因家族

成簇基因家族 ：由一個或多個位于特異亞染色體區的基因簇構成，每一基因簇常由串聯基因重復事件形成，而且常可產生無功能的假基因

散在的基因家族 ：各基因成員之間沒有明顯的結構上的關系，常常散在分布于幾個染色體上 ? rRNA基因家族：28S、5.8S5、18S rRNA基因成簇排列在一起，每個基因含60個拷貝 人類基因組計劃內容

遺傳圖（連鎖圖），物理圖，序列圖，基因圖 遺傳圖

?第一代標記?經典的遺傳標記（蛋白質和免疫學的標記）?70年代中后期，限制酶片段長度多態性（RFLP）?第二代標記?85年，“小衛星中心”（minisatellitecore）?89年，“微衛星標記”（microsatellitemarker）?第三代標記?單核苷酸多態性標記（single nucleotide polymorphism，SNP）SNP 作圖的一般步驟包括： ①獲取DNA序列；

②從DNA序列確定序列標簽位點（sequence tagged sites，STSs）； ③掃描STSs或ESTs確定候選SNPs； ④確定SNPs；

⑤將SNPs定位于染色體特定位置。物理圖 ?內容

–測定人類基因組DNA分子的物理長度

–描述了DNA分子兩個位點或染色體兩個位標之間的實際距離 ?單位：核苷酸數?基本原理： 人類基因組 打碎

拼 接–可以隨意研究、又能夠知道研究內容所處的染色體位置 ?圖距： Mb、kb、bp作為圖距

––平均圖距100kb（測定40000個以上的STS））?路標：DNA探針的STS序列為路標? 構建物理圖的一個主要內容：

––把含有STS對應序列的DNADNA克隆片段連接成相互重疊的““片段重疊（contigcontig）

? 以STS為路標的物理圖與已建的遺傳圖進行對比，可以把遺傳學信息和物理信息進行互相轉換（如某一區域1cM1cM的遺傳間距可以粗略的“折算”成某一區域1cM的物理間距）

包括:人類基因組的不同載體DNA克隆片段重疊群圖??大片段限制性內切酶切點圖序列圖 ? 策略：把龐大的基因組分成若干有路標的區域后，進行測序分析

? 序列分析需要用一個區域DNA片段重疊群使測序工作不斷延伸，這中間的STS被用作任何兩個片段（上百個bp）間的重疊區域，使分別被測的短序列進行正確的拼接

? 基本策略是建立 DNA小片段的重疊群并盡可能地降低重疊部分所占的比例以提高效率和降低成本基因圖 ? 內容： 鑒別出占據 22--5%長度的全部基因的位置、結構與功能 ? 方法：mRNA到染色體的位置 ? 原理：

––生物性狀和疾病由蛋白質決定；

––蛋白質均由mRNA編碼（RNA聚合酶指導合成，帶有多聚A尾巴）； ––mRNA通過反轉錄酶合成cDNAc；

––用較穩定的cDNA作為探針進行分子雜交，鑒別出與轉錄有關的基因。基因圖

? 根據 mRNA的特點，可用與多聚AA尾巴（poly AA）互補的寡聚T）或克隆載體的相關序列為引物，對mRNA的雙端尾側的幾百個bp進行測序，得到EST（表達序列標簽）

意義：在于它能有效的反映在正常或受控條件中表 達的全基因的時空圖 通過這張圖我們可以了解某一基因在不同時間不同 組織不同水平的表達

?人類基因組計劃的意義：隨著人類基因組逐漸被破譯，一張生命之圖將被繪就，人們的生活也將發生巨大變化。人類基因研究的意義在于它可以支持和推動生命科學中一系列重要的基礎性研究。如基因組遺傳語言的破譯，基因的結構與功能關系，生命的起源和進化，細胞發育、生產、分化的分子機理，疾病發生的機理等。人類基因組計劃的意義

?為推動醫學長足進步帶來前所未有的機遇

?基因診斷、基因療法和基因藥物的開發，有可能成為未來醫學發展的重要分支

?人類基因組計劃的進一步成功還將促進生命科學與信息科學、材料科學的融合，從而帶動一批高技術產業的發展后人類基因組計劃伴隨著人類基因組計劃的迅速進展，基因的全序列逐步被完整的測出，會出現大量的不知道任何功能信息的序列。基因組學內容

?１結構基因組學：是通過基因作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、基因定位的科學。其目的是確定界標或基因在構成基因組的每條染色體上的位置，以及同條染色體上各個界標或基因之間的相對距離。

?２功能基因組學：是利用結構基因組學研究所獲得的各種來源的信息，通過在基因組或系統水平上全面分析基因的功能，使得生物學研究從對單一基因或蛋白質的研究轉向對多個基因或蛋白質同時進行系統的研究。它包括基因功能發現，基因表達分析及突變檢測，力圖從基因組整體水平上對基因的活動規律進行闡述。功能基因組學延伸 內容

–人類基因組多樣性計劃 –基因組信息學 –功能基因組學 –比較基因組學 –環境基因組學 –病理基因組學 –腫瘤基因組解剖學計劃 –藥物基因組學 ?端 粒（telomeretelomere）

是真核生物染色體末端的一種特殊結構由端粒DNA和端粒蛋白質構成 作用：1穩定染色體結構 2防止染色體末端融合

3保護染色體結構基因 4避免遺傳信息在復制過程中丟失 組成

端粒DNA序列telomereDNAsequence（TEL）端粒結合蛋白telomere-binding proteins 端粒DNA序列:雙鏈，長度>10kb 由5-8bp富含G的串聯重復序列即富G鏈和其互補鏈富C鏈組成 四膜蟲：5’—TTGGGG—3’ 人類：5’—TTAGGG —3’15kb 端粒結合蛋白 :保護端粒DNA，免被修飾和核酸酶作用。

人類：稱為端粒重復序列結合因子（telomeric repeats binding factor TRF)人的端粒DNA,序列長約5～15kb序列：（TTAGGG）n，串聯重復 端粒結合蛋白（TRF）

?端粒酶是端粒復制所必須的一種特殊的DNA聚合酶。具有逆轉錄酶活性 能以hTR為模板，向染色體末端添加TTAGGG序列結構 端粒酶RNA：含與TEL互補的模板RNA序列

端粒酶蛋白：應具有逆轉錄酶活性，對其結構和功能 ?端粒酶功能

以自身RNA為模板，逆轉錄合成和補充端粒DNA重復序列 所需物： 模板：端粒酶RNA 逆轉錄酶：端粒酶蛋白 原料：dNTP 引物：TEL 3’端。體外TEL類似序列也 能作為引物，是端粒酶測定的基礎。

細胞內端粒酶活性的缺失，導致：端粒縮短

粒一旦縮短到短于某個“關鍵長度”，就很有可能導致：染色體雙鏈斷裂，并激活細胞自身的檢驗系統，使細胞進入M1期死亡狀態隨著端粒的進一步丟失，發生染色體重排，導致：無著絲粒染色體和非整倍體染色體的形成等，使細胞進入M2期死亡狀態如果細胞要維持其正常分裂，就必須激活端粒酶，阻止端粒的進一步丟失否則，細胞不能進行染色體的正常復制 只有重新獲得端粒酶活性的細胞，才能繼續生存下去無法激活端粒酶的細胞（即無法阻止端粒進一步丟失），只能面臨趨向衰老

?抑制端粒酶活性為靶點的腫瘤 治療研究 主要策略有： ①阻斷端粒酶RNA的模板作用 ②抑制端粒酶催化蛋白亞基

③核苷類似物競爭性抑制反轉錄過程 ④細胞分化誘導劑抑制端粒酶活性 ⑤對細胞內調節機制進行調控 ⑥其它抑制劑對端粒酶活性的調節

?抑制端粒酶活性 ————阻斷端粒酶RNARNA的模板作用

端粒酶是以其自身RNA為模板來合成端粒DNA序列，因此可以通過消除其模板作用抑制端粒酶活性，達到限制端粒合成的目的 除端粒自身模板作用的方法 義核苷酸封閉hTR 義肽核酸封閉hTR 頭狀核酶切割hTR序列 反義核苷酸封閉 hTRhTR 端粒酶RNA序列中含有與端粒DNA互補的模板序列，因此可設計能與之結合的反義核苷酸來滅活端粒酶，從而阻止端粒序列的合成

反義肽核酸封閉 hTRhTR ?肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一類人工合成的DNA或RNA類似分子

PNA與核酸分子的不同之處在于：將DNA中的磷酸脫氧核糖骨架被酰胺鍵連接的多肽骨架所代替，堿基通過亞甲羧基鏈與骨架中甘氨酸的氨基連接

PNA具有與天然DNA相類似的結構特征和相同的DNA/RNA結合特性 錘頭狀核酶切割 hTRhTR序列

?核酶是一類具有酶活性的小分子RNA，通過序列特異性地與靶RNA分子配對，對底物進行切割，從而使其失去生物學功能 ?目前關于端粒及端粒酶的研究主要集 中在以下幾個方面 a.端粒酶的結構和功能.b.端粒酶的純化和激活機制.c.尋找端粒酶的專一性抑制劑及其在抗癌中的應用.d.端粒的高級結構及結合蛋白的作用機理.?腫瘤發生的端粒--端粒酶學說

端粒每次分裂，端粒縮短縮短至某已特定長度，一發生P53、Rb等基因突變細胞繼續分裂，少數端粒酶激活；其中有的染色體不穩定，出現融合M2期細胞，細胞永生化無限增殖給另外基因損傷的積累提供機會腫瘤二M1期細胞，死亡信號轉導：胞外信號分子(可溶性分子、細胞表面分子、組織基質分子)靶細胞跨膜分子(如GPCR、EGFR等)靶細胞受體（胞內段）化學變化（如磷酸化、二聚體形成）靶細胞內信號轉導分子化學變化與激活（如磷酸化、去磷酸化、聚體形成）激活的信號轉導分子進入胞核進入胞核的轉導分子作用于基因轉錄調控區，導致基因表達改變

第一信使：由細胞分泌的調節靶細胞生命活動的化學物質的統稱。（激素、細胞因子、氣體等）第二信使(secondary messenger)在細胞內傳遞信息的小分子物質，如：Ca2+、DAG、IP3、Cer、cAMP、cGMP、花生四烯酸及其代謝產物等。

第三信使(third messenger)負責細胞核內外信息傳遞的物質，又稱為DNA結合蛋白，是一類可與靶基因特異序列結合的核蛋白，能調節基因的轉錄。如立早基因(immediate-early gene)的編碼蛋白質。

受體的定義:是靶細胞膜上或細胞內能特別識別生物活性分子(信號分子)并與之結合的成分，它能把識別和接受的信號正確無誤地放大并傳遞到細胞內部，進而引起生物學效應的特殊蛋白質，個別是糖脂。能與受體呈特異性結合的生物活性分子則稱配體(ligand)。受體的分類、一般結構與功能

存在于細胞質膜上的受體，絕大部分是鑲嵌糖蛋白。根據其結構和轉換信號的方式又分為三大類：離子通道受體，GG蛋白偶聯受體(G protein Coupled Receptor , GPCR)和單跨膜受體(催化性受體)。

（一）膜受體(membrane receptor)

（二）胞內受體(intracellular receptor)位于細胞漿和細胞核中的受體，全部為DNA結合蛋白

1.離子通道受體受神經遞質等信息物質調節。當神經遞質與他們結合后，可使細胞膜上的離子通道打開或關閉，從而改變膜的通透性。

2.Definition for G-protein-coupled receptors,GPCR G蛋白偶聯受體家族 3.單個跨膜α螺旋受體 含TPK結構域的受體

EGF:表皮生長因子 IGF-1:胰島素樣生長因子

PDGF:血小板衍生生長因子 FGF:成纖維細胞生長因子(催化性受體)蛋白質二聚作用

1.相互作用的分子拉近；2.能使底物與酶的活性位點以更適合催化作用的方位相互楔合大大增加了反應速度。這種定向作用對信號轉導的突出意義

G蛋白(guanylatebinding protein)GTP-結合蛋白1.三聚體G蛋白,與膜受體偶聯,位于細胞膜胞漿面的外周蛋白 2.結構：αβγ三種亞基固定于細胞膜內側 3.特性：具GTP酶的活性

一、膜受體介導的信息傳遞 –cAMP-蛋白激酶途徑組成：胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環化酶(adenylatecyclase，AC)，cAMP，蛋白激酶A(protein kinaseA，PKA)–Ca2+-依賴性蛋白激酶途徑 1.Ca2+－磷脂依賴性蛋白激酶途徑

2.Ca2+－鈣調蛋白依賴性蛋白激酶途徑(Ca2+－CaM激酶途徑)–cGMP-蛋白激酶途徑

受體鳥苷酸環化酶轉導系統 特點：受體具GC活性無需G蛋白介導組成 –酪氨酸蛋白激酶途徑酪氨酸蛋白激酶(tyrosine –protein kinase, TPK)分類受體型TPK（位于細胞質膜上）如胰島素受體、生長因子受體等 非受體型TPK（位于胞漿）如JAK—STAT途徑 –核因子κΒ途徑

核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)TNFCer等激酶系統病毒感染、脂多糖、活性氧中間體、佛波酯、雙鏈RNA等PKA、PKC等激活NF-κB –TGF-β途徑

二、胞內受體介導的信息傳遞

?胞內受體 核內受體 胞漿內受體 ?配體 類固醇激素 甲狀腺激素 信號轉導的研究方法與工具

一、蛋白質磷酸化狀態的檢測

1、免疫印跡(phospho-protein specific antibodies)

2、免疫沉淀(protein-specific antibody + phospho-AA antibody

3、流式細胞儀分析

二、信號轉導分子過度表達或過度激活

1、Overexpressionby gene transduction

2、Constitutively activated mutants

三、基因轉錄活性測定

1、Electrophoreticmobility shift analysis(EMSA)２、Reporter gene expression detection

四、信號轉導分子的表達或活性抑制

1、Anti-sense

2、RNAi

3、Gene knock-out

4、Dominant negative mutants

5、Small-molecule inhibitors

6、Inhibitory oligopeptides 基因工程(Genetic Engineering)的基本定義(狹義)稱遺傳過程（Genetic EngineeringGenetic Engineering）從狹義上講，基因工程是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿遺傳并表達出新的性狀供體、受體和載體稱為基因工程的三大要素，其中相對于受體而言，來自供體的基因屬于外源基因

除了少數RNA病毒外，幾乎所有的基因都存在于DNA結構中，而用于外源基因重組拼接的載體也都是DNA分子，因此基因工程也稱為重組DNA技術（DNA Recombination）

?基因工程的基本定義(廣義)為DNA重組技術的產業化設計與應用包括上游技術和下游技術 游技術指的是外源基因重組、克隆和表達的設計與構建（即狹義的基因工程）

游技術則涉及到含有重組外源基因的生物細胞（基因工程菌或細胞）的大規模培養以及外源基因表達產物的分離純化過程

基因工程的基本過程

（1）從供體細胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內切酶分別將外源DNA（含外源基因或目的基因）和載體分子切開（簡稱“切”）

（2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體上，形成DNA重組分子（簡稱“接”）

（3）借助于細胞轉化手段將DNA重組分子導入受體細胞中（簡稱“轉”）

（4）短時間培養轉化細胞，以擴增DNA重組分子或使其整合到受體細胞的基因組中（“增”）；

（5）篩選和鑒定轉化細胞，獲得使外源基因高效表達的基因工程菌或細胞（簡稱“檢”）

由此可見，基因工程的上游操作過程可簡化為：“切、接、轉、增、檢”五步；

工具酶：在重組DNA技術中，對DNA進行切割、合成、剪接、補平、連接和修飾等工具酶是必不可少的。常用的工具酶主要有：

一、限制性核酸內切酶（restriction endonuclease，簡稱限制酶），分為三型。其中Ⅱ型被稱為基因工程的分子手術刀，是分子克隆技術中最重要的工具酶。

二、DNA聚合酶

三、DNA連接酶

四、堿性磷酸酶

五、T4多核苷酸激酶

六、核酸酶S1

回文結構（palindrome structure）：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補序列（常為限酶所識別）粘性末端（stickyend）：指限制酶錯位切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產生的末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產生的末端。同工異源酶（isoschizomers）:來源不同，但能識別和切割同一位點的酶稱為。同尾酶（isoaudamers）:識別序列不同，但可產生相同粘性末端的限制酶稱為

大腸桿菌DNA聚合酶ⅠE.Coli DNA polymeraseⅠ是單一多肽鏈的多功能酶有3種酶活性： ① 5′→3′DNA聚合酶活性 聚合作用:在引物的存在下，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的5′→3′聚合作用 ②3′→5′核酸外切酶活性校對作用

?這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸 ③5′→3′核酸外切酶活性切除修復作用

?從5'→3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產生5'-脫氧核苷酸 Klenow片段的主要用途：

①補齊雙鏈DNA的3′末端，同時可使3 ′末端DNA標記同位素。②cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。③DNA序列分析

（二）TaqDNA聚合酶（簡稱Taq酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有5′→3′聚合酶活性和依賴于聚合作用的5′→3′外切酶活性TaqDNA聚合酶可用于DNA測序及通過聚合酶鏈反應（PCR）對DNA分子的特定序列進行體外擴增

（三）逆轉錄酶（reverse transcriptase）

是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉錄過程。是多功能酶

逆轉錄酶的作用：

①RNA指導的DNA聚合酶活性（RDDP）

②核糖核酸酶H活性（RNaseH）: 3’→5’RNA外切酶活性 ③依賴DNA的DNA聚合酶活性（DDDP）

（四）末端脫氧核苷酰轉移酶“搬運工”（terminal deoxynucleotidyltransferase，TdT，簡稱末端轉移酶）分子量為60Kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的3′末端-OH上末端轉移酶的功能 ?在載體或目的基因3′末端加上互補的同質多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接 ?用于DNA 3′末端的同位素探針標記

三、DNA連接酶（DNA ligase）基因工程的”縫紉針”主要功能：催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5′磷酸基團與3′羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來，實現DNA體外重組

四、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除DNA，RNＡ或dNTP上的5′-磷酸基團。主要用途： ①除去DNA片段上的5′磷酸以防自身連接

②在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標記前，從RNA或DNA上除去5′端的磷酸

五、T4多核苷酸激酶

①前向反應

②交換反應

六、核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分其主要作用：①除去的粘性末端以產生平末端②除去cDNA合成時形成的發夾結構③分析RNA的莖環結構和DNA-RNA分子的雜交情況 功能：水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交體中的單鏈部分

載體（vector）: 指能攜帶外源DNA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質為DNA.制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進入受體細胞并進行復制和表達 載體包括克隆載體和表達載體

在常用的克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件（DNA序列）即為表達載體 –不僅可攜帶外源基因片段進入宿主細胞 –而且可在宿主細胞中表達外源基因 載體應具備的特征

①能自我復制并具較高的拷貝數。分子量一般< 10Kb。②帶有遺傳篩選標記。

③有適當的限制酶切位點，便于外源基因的插入和篩選。

多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）：載體上具有多個限制性內切酶的單一位點（即在載體的其它部位無這些酶的相同位點），以供外源DNA插入。

一、克隆載體能將載體外源基因在受體細胞中復制擴增并產生足夠量目的基因的載體稱為克隆載體

（一）質粒載體

質粒（plasmid）是指細菌染色體以外的小分子環狀雙鏈DNA，能自我復制和表達其攜帶的遺傳信息質粒克隆載體的主要用途：

①用于保存和擴增< 2Kb目的DNA ②構建cDNA文庫 ③目的DNA的測序

④作為核酸雜交時的探針來源

表達載體是指能將外源基因在受體細胞中有效轉錄和正確翻譯的載體。

啟動子是一段位于結構基因5‘端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結合并具有轉錄起始的特異性。轉錄單元(transcription unit)–一段從啟動子開始至終止子(terminator)結束的DNA序列

一個基因的3′末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉錄的功能，此序列稱為終止子 分子克隆的基本步驟“分、切、接、轉、增、檢”

一、目的基因的獲取和載體的選擇

一、目的基因的獲取

１從基因文庫中獲取２逆轉錄法３人工合成DNA片段４直接從染色體DNA中分離目的基因

二、目的基因和載體分別被酶切與連接

三、目的基因與載體連接

四、重組DNA導入受體細胞

五、重組體的克隆

六、重組體的篩選和鑒定

基因組文庫（genomic library，G-文庫）是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群 構建基因組文庫的步驟

–先將原核或真核細胞染色體DNA提純

–通過機械或酶切使之成為一定大小的片段 –將其與適當的載體（一般為λ噬菌體）相連接 –經體外包裝、轉染細菌

–得到一組含不同DNA片段的重組噬菌體顆粒

–這個文庫中含有基因組內全部基因片段，是一個貯存基因組全部序列的信息庫，故稱為G-文庫

如以細胞全部mRNA經逆轉錄，制備出全套cDNA建庫，則稱為C-文庫。細胞膜結構改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細胞稱謂感受態細胞(competent cell)

某些質粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ’基因，該基因含一段編碼β-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可誘導此片段合成，此片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實現基因內α-互補，形成完整的β-半乳糖苷酶。該酶能催化指示劑底物X-gal 形成藍色菌落。當外源基因插入lacZ’基因中MCS，lacα-肽基因閱讀框架被破壞，細菌內將無β-半乳糖苷酶活性，結果重組克隆呈白色菌落，這是常用的藍白斑篩選實驗 基因工程的基本原理

（1）利用載體DNA在受體細胞中獨立于染色體DNA而自主復制的特性，將外源基因與載體分子重組，通過載體分子的擴增提高外源基因在受體細胞中的劑量，借此提高其宏觀表達水平

（2）篩選、修飾和重組啟動子、增強子、操作子、終止子等基因的轉錄調控原件，并將這些原件與外源基因精細拼接，通過強化外源基因的轉錄提高其表達水平

（3）選擇、修飾和重組核糖體結合位點及密碼子等mRNA的翻譯調控原件，強化受體細胞中蛋白的生物合成過程 涉及到基因表達調控的分子生物學原理

（4）基因工程菌（細胞）是現代生物工程中的微型生物反應器，在強化并維持其最佳生產效能的基礎上，從工程菌（細胞）大規模培養的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應器的增值速度和最終數量，也是提高外源表達產物產量的主要環節涉及生物化學工程學的基本理論體系

原癌基因是細胞內與細胞增殖相關的正常基因，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高等保守 原癌基因的結構或調控區發生變異，基因產物增多或活性增強時，使細胞過度增殖，從而形成腫瘤 原癌基因的特點: 1廣泛存在于生物界中； 2基因序列高度保守； 3作用通過其產物蛋白質來體現 4正常情況下表達水平很低;

5被激活后，形成致癌性的細胞轉化基因

原癌基因的分類

1、src 家族氨基酸序列具有較高同源性和酪氨酸蛋白激酶活 性以及同細胞膜結合的性質，定位于 胞膜內側或 跨膜 分布。

2、ras 家族 : 包括 類密切相關的成員 ras 3,雖其核苷酸序列的同源性較少但編碼蛋白質，能結合 GTP，GTP 酶活性，并參與細胞內 cAMP 水平的調節

3myc 家族 :包括 myc myc myc fos c-等基因 其表達產物定位于 細胞核內 DNA 結合 蛋白類 , 或為轉錄調控中的反式作用因子 有直接的 調節其他基因轉錄的作用

4sis 家族 : 目前認為 sis 基因僅有一個成員。其表達產物與血小板源生長因子，可促進間葉組織的細胞增

5、erb 家族 : trk 等基因 其表達產物是生長因子和蛋白激酶，6、myb 家族 : 其表達產物為 核內 轉錄調節因子，能與 DNA 結合 原癌基因產物：

1.生長因子 2.生長因子受體 3.信號轉導組分 4.細胞周期蛋白 5.細胞凋亡調節蛋白

6.轉錄因子 原癌基因的激活機理

1.DNA重排插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、過量地表達負調控區的失活或丟失 2.基因放大3.點突變4.其它調控的異常

抑癌基因(tumor suppressor gene)/隱性癌基因：存在于正常細胞中，是一種抑制細胞生長和腫瘤形成的基因,其編碼產物能抑制細胞生長、增殖的一組結構基因

確定抑癌基因在理論上需要滿足的三個基本條件

1、在惡性腫瘤相應的正常組織該基因必須正常表達

2、在惡性腫瘤中，該基因有功能失活或結構改變或表達缺陷

3、將這種基因的野生型導入基因異常的腫瘤細胞中，可部分或/完全改變其惡性表現 抑癌基因與原癌基因在生物學上有以下幾點差異：

①在功能上，抑癌基因起負調控作用，而原癌基因起正調控作用；

②在遺傳方式上，原癌基因是顯性的，而抑癌基因在細胞水平上是隱性的，③在突變發生的細胞類型上，抑癌基因突變可以發生在體細胞中，也可能發生在生殖細胞中并通過生殖細胞得到遺傳。原癌基因突變只發生在體細胞中。抑癌基因主要功能

(1)誘導終末分化(2)維持基因穩定(3)觸發衰老，誘導細胞程序性死亡(4)調節細胞生長(5)抑制蛋白激酶活性

(6)改變DNA甲基化酶活性(7)調節組織蛋白酶活性(8)調節血管形成(9)促進細胞間聯系 “二次突變”假說的意義

1、為解決遺傳性和體細胞突變通過何種機制在腫瘤發生過程中起作用提供了思路

2、腫瘤細胞發生過程中隱性遺傳性決定因素與體細胞表型連接起來 P53蛋白的生物學功能

①轉錄調節及抑制細胞生長的作用P53蛋白促進WAF1/CIP1基因表達產生一種分子量為21kD的蛋白質（p21WAF1/CIP1），誘導細胞生長停滯于G1期

②抑制DNA復制P53蛋白可與復制蛋白A(RPA)結合，而RPR與解鏈狀態的DNA單鏈的結合可能是DNA復制的起始步驟，P53蛋白與RPA結合后可抑制RPA與單鏈DNA的結合，從而抑制了RPA與DNA復制起始點的結合，阻止細胞進入S期。P53蛋白還可通過抑制解鏈酶的活性，以抑制DNA復制。

③參與程序性細胞凋亡P53 蛋使損傷細胞停留在G1期，以便使DNA損傷修復后再進入細胞周期。若損傷不能修復，則啟動細胞進入程序性凋亡（細胞自殺）

基因診斷的概念 ◆狹義的概念對疾病或與致病相關的核酸片段（DNA 或RNA）的確定及核苷酸序列的測定◆廣義的概念(分子診斷)對疾病或與致病相關的基因（DNA）的表達產物（mRNA、蛋白質）的確定和序列測定，即從疾病基因或與致病相關的基因及其表達產物的水平上進行檢測，因此實現了疾病的早期診斷

常見的基因診斷技術核酸分子雜交（hybridization）聚合酶鏈反應（PCR）DNA測序技術（DNA Sequencing）DHPLC DNA芯片技術 1.核酸分子雜交技術（hybridization）

?分子雜交（簡稱雜交，hybridization）是核酸研究中一項最基本的基因診斷技術

?雜交的基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質，使來源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子（heteroduplex）

?雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間形成，也可在RNA與DNA鏈之間形成

分子雜交的概念兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補的原則締合成異質雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交（molecular hybridization）分子雜交的本質

?雜交的本質：就是在一定條件下使互補核酸鏈實現復性

?利用探針（probe）與靶DNA雜交，可識別靶DNA中的特異核苷酸序列

?探針：探針是指帶有某些標記物（如放射性同位素32P，熒光物質異硫氰酸熒光素等）的特異性核酸序列片段

?核酸探針是指能與特定核苷酸序列發生特異性互補雜交，雜交后可用特殊方法檢測的已知被標記的核酸分子?因此應用核酸探針就可以檢測待檢核酸樣品中特定基因序列 核酸探針的類型

?基因組DNA探針

?cDNA探針

?RNA探針

?寡核苷酸探針 核酸探針的設計原則

最基本的原則---具有高度特異性

◆探針的來源是否方便和制備探針的難易程度 ◆探針長度：一般要求在10～50bp ◆G／C含量為40％6％

◆探針分子中應避免互補序列

◆避免同一堿基連續出現，一般不能多于4個，如GGGG-或-CCCC-◆借助計算機相應軟件與已知的各種基因序列進行同源性比較核酸探針的標記 一個理想的探針標記物應具有以下特性： ◆靈敏度高 ◆標記物與探針結合后，應不影響雜交反應，尤其是雜交特異性、穩定性和Tm值 ◆檢測方法要靈敏、特異、穩定、簡便

◆標記物對環境污染小，對人體無損傷，價格低廉 ◆標記物對檢測方法無干擾

融解溫度(melting-temperature，Tm)在熱變性過程中，紫外吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度。由于這一現象和結晶的融解過程相似，又稱為融解溫度

固相雜交的優點：未雜交的游離探針通過漂洗可容易除去，膜上的雜交分子容易檢測，還能防止靶DNA的自我復性，所以被廣泛應用

分子雜交技術過程

☆探針制備及標記（同位素或非同位素）

☆待測核酸樣品制備（分離，純化）☆雜交（液相，固相，原位雜交）

☆雜交后處理（去掉非特異雜交分子）☆顯示結果（顯色，發光，放射自顯影）☆結果分析

核酸分子雜交技術類型雜交類型檢測目的及范圍Southern印跡雜交檢測經凝膠電泳分離且轉移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測經凝膠電泳分離且轉移至膜上的RNA分子斑點雜交檢測固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細胞或組織中的DNA或RNA分子

（四）原位雜交（In situ hybridization）是以特定標記的已知序列的核酸分子作為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交并對其檢測的方法 材料

石蠟包埋組織切片 冰凍切片 細胞涂片 培養細胞爬片 類型細胞內原位雜交組織切片內原位雜交

熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization,FISH）

?熒光原位雜交是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術

PCR及其義：聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction 簡稱PCR）又稱體外酶促基因擴增?定義：體外模擬DNA的復制。（它是模擬DNA體內復制過程，在DNA聚合酶作用下，進行特DNA片段的體外復制）生物體DNA復制和條件

?細胞分裂：在細胞分裂前，作為遺傳信息載體的DNA 要進行復制分三步完成：

–1.在細胞內有關因子參與下，1條雙螺旋結構的DNA松散成2條單鏈。

–2.引物酶合成DNA引物，引物與單鏈堿基互補配對，形成引物---單鏈復合物。

–3.在DNA聚合酶作用下，按照堿基配對原則，按照一定方向，逐一將互補的dNTP鏈接上去，形成一條新的DNA雙鏈。（半保留復制）

?根據體內DNA復制的條件，PCR也分三步完成：

1.高溫變性：將反應體系加熱到90度以上，1條雙鏈模板變成2條單鏈模板。

2.低溫退火（復性）：將反應體系降溫到50度左右，人工合成的特異寡核苷酸引物，按照堿基配對原則，與單鏈模板DNA結合。

3.中溫延伸：在耐熱DNA聚合酶作用下，在引物引導下，逐一將人工合成的dNTP連接上去，一條單鏈形成雙鏈。?PCR技術實際上是在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應 ?PCR由變性－退火－延伸三個基本反應步驟構成 PCR反應五要素

（一）模板（template）

（二）引物（primers）

（三）DNA 聚合酶（DNA polymerase）

（四）dNTP

（五）PCR緩沖液（PCR buffer）SDS的主要功能是：

?溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜 ?解離細胞中的核蛋白

?與蛋白質結合而使蛋白質沉淀

蛋白酶K作用：能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白 設計引物應遵循以下原則

?①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右

?②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段

?③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列

?④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3‘端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶 ?⑤引物3’端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗 ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處 ?⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性

?⑧引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會

?退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素：變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合 ?退火溫度與時間，取決于：

–引物的長度 –堿基組成及其濃度 –靶基序列的長度

?20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，選擇55℃為最適退火溫度的起點較為理想

?引物的復性所需的溫度與時間取決于引物的堿基組成、長度和濃度，合適的復性溫度= Tm值-（5～10℃）?在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性 ?復性時間一般為30 ～60 sec，足以使引物與模板之間完全結合 ?TaqDNA聚合酶的生物學活性：

–70～80℃150核苷酸/S/酶分子 –70℃60核苷酸/S/酶分子

–55℃24核苷酸/S/酶分子 –高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行 ?延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃ ?延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定 –一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的 –3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min ?延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現 ?對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些 ?循環次數決定PCR擴增程度

?PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度，一般的循環次數選在30～40次之間循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多

PCR反應條件的選擇

?PCR反應條件為溫度、時間和循環次數

?溫度與時間的設置：標準反應中采用三溫度點法

–90 ～95℃變性 –40 ～60℃退火 –70 ～75℃延伸 ?擴增100～300bp片段，可采用二溫度點法 –94℃變性

–65℃左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的 催化活性）

PCR儀工作參數的設置

?94℃30~60sec?55℃30~60sec?72℃30~60sec ?循環30次，最后72℃延伸1～10min PCR擴增產物的檢測方法

(一)凝膠電泳

?1．瓊脂糖凝膠電泳法

?不同濃度的凝膠分辨DNA的有效范圍不同瓊脂糖凝膠電泳法的操作方法簡單，能對PCR產物的長度進行粗略的鑒定，是應用最廣泛的檢測PCR產物的方法

?基本原理是–在電泳過程中，凝膠中的溴乙錠(EB)嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EB-DNA復合物發出橙紅色熒光–該法最大的缺點是不能鑒定PCR產物的序列，而且存在溴乙錠污染

?2．聚丙烯酰胺凝膠電泳法不同濃度的丙烯酰胺濃度分離DNA的有效范圍不同

?特點：–分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠大于瓊脂糖凝膠；

–回收的DNA純度高；–采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點。

?用途：?PCR擴增指紋圖?多重PCR

?PCR產物限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）

★影響遷移率的因素：①核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數成反比②凝膠濃度③DNADNA的構象，超螺旋最快，線形其次，環形最慢。④電壓，不大于5V/cm5V/cm

?特點：–分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開； –上樣量遠大于瓊脂糖凝膠；–回收的DNA純度高；

–采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點。?用途：?PCR擴增指紋圖?多重PCR

?PCR產物限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）

?據目的基因序列可查出所包含的酶切位點，用相應的限制性核酸內切酶消化PCR擴增產物，然后進行電泳，觀察消化片段的大小是否與序列資料相符。

?用途：–傳染病病原體基因分型–人類基因的變異性研究。

限制性片段長度多態

RFLPRFLP）

﹡DNA多態性：群體中，個體間基因的核苷酸序列存在著差異性

﹡RFLP:DNA序列的多態性如果發生在限制性內切酶的識別位點上，就會造成酶切位點的缺失或新位點的出現，酶切后DNA片段長度發生變化

﹡RFLP產生的類型：單個堿基的突變引起的酶切位點的變化，DNA序列的較大變化 限制性片段長度多態性 RFLPRFLP）

﹡DNA多態性：群體中，個體間基因的核苷酸序列存在著差異性

﹡RFLP:DNA序列的多態性如果發生在限制性內切酶的識別位點上，就會造成酶切位點的缺失或新位點的出現，酶切后DNA片段長度發生變化

﹡RFLP產生的類型：單個堿基的突變引起的酶切位點的變化，DNA序列的較大變化

(四)PCR產物測序?對PCR產物進行測序是檢測PCR產物特異性最可靠的方法，可將PCR產物克隆到載體上進行測序，也可對直接PCR產物進行測序。測序常用的方法為雙脫氧核苷酸鏈末端終止法和化學裂解法。

（一）巢式PCR（nested PCR）巢式PCR是用兩對引物，一對引物序列在模板的外側，另一對引物序列在模板內側（相對于第一對引物）

（二）逆轉錄PCR（reverse transcription，RT-PCR）?原理是先將RNA用逆轉錄酶逆轉錄成cDNA，然后再加入特異引物對目標片段進行擴增，擴增產物的分析與其他常見PCR方法類似。

（三）多重PCR（multiplex PCR）該技術是在一個反應體系中加入多對引物，同時擴增出多個核酸片段，由于每對引物擴增的片段長度不同，可用電泳加以鑒別。DNA測序技術

?核酸是生命的遺傳載體，其結構從根本上決定了基因的表達及其功能。核酸序列的改變意味著生物學含義的改變

?測定并分析核酸的序列，是研究其結構、功能及其關系的前提，是分子生物學最基本的課題，并為臨床疾病的基因診斷提供最為精確的判定依據

（一）雙脫氧終止法

Sanger法DNA測序的試劑

引物 模板 DNA dNTP放射性（熒光）標記的ddNTP ?DNA 測序反應與PCR反應類似

?反應體系中包含：模板DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和測序引物 ?反應過程：變性－復性－延伸－終止

ddNTP是鏈反應終止劑?DNA聚合酶I能催化dNTP的5′磷酸基團與引物的3′-OH末端生成3′，5′磷酸二酯鍵。通過磷酸二酯鍵的不斷形成，新的互補DNA從5′→3′不斷延伸。ddNTP是鏈反應終止劑

?ddNTP只比dNTP在3′位置缺少一個羥基，可以通過其5′三磷酸基團摻入到正在延伸的DNA鏈中，但由于缺少3′-OH，不能同后續的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯鍵，使該鏈的延伸終止于這個異常的核苷酸處

在4組獨立的酶反應體系中，分別加入不同ddNTP，并通過控制dNTP／ddNTP的濃度，鏈的持續延伸就將與隨機但特異發生的鏈終止反應展開競爭

結果產生4組分別終止于互補鏈的每一個A、G、C和T位置上的一系列長度的核苷酸鏈?通過高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從放射自顯影膠片上就可直接讀出DNA上的核苷酸順序

? ?在自動測序中ddNTPs用4種熒光染料中的1種標記（每種熒光染料被激光照射時可發出特定波長的光）。?ddNTPs是反應終止劑可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續連接。?反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs 化學測序法原理： 利用特異性的化學裂解法，制備出長度只差一個核苷酸的片 段群，然后將此片段群經測序膠電泳和放射自顯影得到測序 圖譜

第三篇：分子生物名詞解釋

分子生物學

名詞解釋：

1.基因組（genome）：指生物體或細胞中，一套完整單體的所有遺傳物質的總和；或指原核生物染色體、質粒，真核生物的單倍染色體組、細胞器，病毒中所含有的一整套基因組。2.順式作用元件(cis-acting element)：具有調節功能的特定DNA序列只能影響同一分子中的相關基因，發生在一個序列中的突變不會改變其他染色體上等位基因的表達，這樣的序列稱為順式作用元件。3.反式作用因子（trans-acting factor）：與順式作用元件相反的調節蛋白，可通過擴散結合于細胞內的多個靶位點，當發生突變后將同時影響不同染色體上等位基因的表達，表現出反式作用的調節蛋白。4.可讀框（ORF）：指從起始密碼子到終止密碼子的一般連續的密碼子區域，或DNA序列測定中，由計算機辨認出的可能的編碼區域。

5.癌基因：其基因產物具有轉化真核細胞的能力，使之與腫瘤細胞相同的方式生長。即一類與癌的生成有關的基因。控制細胞分裂的基因由于突變或腫瘤病毒的入侵而失去調節功能，原癌基因轉變為癌基因。

6.核酶（ribozyme）：泛指一類具有催化功能的RNA分子，一般指無需蛋白質參與或不與蛋白質結合，就具有催化功能的RNA分子。7.管家基因（house-keeping genes）：為組成型基因，指在各種細胞中都能表達的一類基因，其產物是維持細胞基本生命活動所需的物質。8.ESTS（表達序列標簽）：從一個隨機選擇的cDNA克隆，進行5’端和3’端單一次測序挑選出來獲得的短的cDNA部分序列，代表一個完整基因的一小部分。在數據庫其尺度從20~7000bp不等。9.GMO（Genetcallly Modified Organisms）：基因修飾生物，在不導入外源基因的情況下，通過對生物體本身遺傳物質的加工、敲除、屏蔽等方法以改變生物體的遺傳特性，得到人們希望得到的性狀。10.Terminator（終止子）：是DNA分子中決定轉錄產物3’-OH端酶分子停止聚合，釋放出已合成的RNA分子的位點。

11.Zinc Finger region（鋅指結構）：是一種常出現在DNA結合蛋白中的結構。由一個含有大約30個氨基酸的環和一個與環上的4個Cys或2個His配位的Zn構成，結構似指狀。它有一個α-螺旋和一個β-螺旋，與DNA雙螺旋的大溝結合影響轉錄。12.rho factor（P因子）：為一種單體分子質量為46Kda的蛋白質，通常以同源大聚體的活性形式存在，分子質量約為275Kda。它是RNA聚合酶的一種重要的蛋白質輔助因子，只在轉錄的終止過程中發揮作用。

13.nucleosome（核小體）：核小體是構成真核生物染色質的基本結構單位。由組蛋白核心和盤旋其上的DNA共同構成的緊密結構形成。（4種組蛋白（H2A, H2B, H3 和 H4）以八聚體的形式形成核心顆粒，DNA纏繞在顆粒表面形成核小體）。14.Hybridization（分子雜交）：利用雙螺旋結構的各種性質在DNA復性后可以得到恢復加持性，可以將兩個不同來源的互補序列退火形成雙鏈的過程叫分子雜交。15.Composite transpasons（復合型轉座子）：一類除了有轉座酶基因外，還帶有抗藥性基因標志，其兩末端由相同的IS序列或末端由38bp的反向重復序列組成的結構。大而復雜的轉座子。16.岡崎片段（Okazaki fragment）：指在半不連續復制中，新合成鏈方向為3’→5’端，實際上是由許多5’→3’方向合成的DNA片段連接起來的，首先沿5’→3’方向合成的較短的DNA片段，隨后被連接成完整的方向為3’→5’DNA的新鏈。17.TM（解鏈溫度）：DNA發生變性時，使DNA雙螺旋鏈結構解開一半或e（P）吸收值到最高值的一半時的溫度。melting temperature。

18.Pribnow box：又稱-10序列，細菌啟動子起始點上游約-10處找到的6bp的保守序列TATAAT，是轉錄的解鏈區。

19.SSR（簡單序列重復）：也稱微衛星DNA，一種簡單串聯重復DNA序列，其重復單位為1~6個核苷酸，由10~50個變性單位串聯組成，在整個基因組中分布且密度高，在遺傳圖和物理圖的研究中有重要作用。

20.antisemseRNA（反義RNA）：通過堿基互補配對與特定mRNA上包括SD序列、起始密碼子AUG及部分N端密碼子的序列結合，抑制mRNA翻譯的一類RNA。21.replion（復制子、復制單位）：基因組中能獨立進行復制的單位。包括復制起始點到終止點的一段DNA序列。

22.SDS reaction（應急反應）：由許多能造成DNA損傷或抑制DNA復制的過程引起的一系列復雜的誘導效應，這種效應稱為應急效應。23.promoter（啟動子）：是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列位點，不被轉錄。24.Operon（操縱子）：是原核生物在分子水平上基因表達調控的單位，與功能相關的基因相連，由同一控制區控制轉錄，這些基因包括結構基因、操縱子基因、啟動調節基因幾部分。25.Enhancer（增強子）：是指能使和它連鎖的基因轉錄效率明顯增加的DNA序列。26.SD sequence（SD序列）：mRNA上位于起始密碼子AUG序列上游10個堿基左右的區域能與16S核糖體RNA3’端反SD序列7個嘧啶堿基互補識別，以幫助從起始AUG處開始翻譯的一段富含嘌呤堿基的序列。27.cDNA和cccDNA：

cDNA：加工成熟的mRNA經逆轉錄合成互補的DNA。

cccDNA：獨立于細菌及某些真核細胞染色體外的共價閉合環狀DNA。

28.RNA剪接：基因的外顯子和內含子都轉錄在一條原初轉錄本RNA分子中。在加工過程中切除內含子、連接外顯子產生成熟RNA分子的過程叫RNA splicing。29.ITS（內轉錄間隔區）：真核生物基因組中編碼核糖體的基因，包括28SrDNA，5SrDNA，18SrDNA和5.8SrDNA四種。它們在染色體上頭尾相連，串聯排列，相互間由間隔區分開。30.gratuitous inducer（安慰誘導物）：能夠誘導酶合成，但又不能被所誘導酶分解的分子。31.triplet codons（三聯體密碼子）：mRNA鏈上決定一個特定的氨基酸的三個連續的核苷酸序列。（mRNA上特定的核苷酸序列對應蛋白質鏈上特定的氨基酸序列）32.STS（序列標簽位點）：基因組物理圖譜中起標識作用的位置已知的獨特的小段單拷貝DNA序列。長度一般為300~500bp。在染色體上有一定的位置。33.intron and exon（內含子、外顯子）： 內含子：不連續基因中無編碼功能的區段，或者說，在初始轉錄產物hnRNA加工產生成熟的mRNA時，被切除的非編碼序列。

外顯子：在不連續基因中有編碼功能的區段，與mRNA的序列行對應。34.sence strand（有義鏈）：在體內DNA的兩條鏈僅有一條用于轉錄，或某些區段以這條鏈轉錄，這時，不用于轉錄的鏈稱為非模板鏈，又稱有義鏈。非模板鏈與合成的RNA產物鏈從一個方向閱讀時，序列完全相同，所以又稱編碼鏈。35.衰減子（弱化子）：attenuator：對色氨酸操縱子的轉錄水平進行微調DNA中可導致轉錄過早終止的一段核苷酸序列。

36.CAP蛋白超級調控因子：CAP是E.coli分解代謝物基因活化蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號傳遞給許多操縱子，使細菌在缺乏葡萄糖時可利用其他碳源。

第四篇：分子生物實驗室應該配備的儀器耗材

分子生物實驗室應該配備的儀器耗材

分子生物學作為基因工程的上游技能，其試驗的效果和準確性將決議下流一切的進程和結尾的試驗成果。因而構建一個設備齊全的分子生物學試驗室是十分重要的，這里小編給大家介紹構建一個分子生物學試驗室需求哪些儀器設備。

1.冰箱：依據藥品、試劑及多種生物制劑保管的需求，有必要具有不一樣控溫等級的冰箱，最常運用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。4℃合適貯存某些溶液、試劑、藥品等。-20℃適用于某些試劑、藥品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白質樣品等。-80℃合適某些長時間低溫保管的樣品、大腸桿菌菌種、純化的樣品、特別的低溫處置消化液等的保管。0-10℃的層析冷柜合適低溫條件下的電泳、層析、透析等試驗。

2.培育箱：37℃恒溫箱用于細菌的平板培育及分子生物學試驗。

3.恒溫培育搖床：用于大腸桿菌等生物工程菌種的擴增。

4.水浴鍋：用于保溫并進行各類試驗。25-100℃水浴搖床可用于分子雜交試驗，各種生物化學酶反響等試驗的保溫。低溫的水浴槽能夠用于分子生物學的質粒與基因片段的銜接等試驗及用于42度的大腸桿菌感受態的熱激。

5.烘箱：主用于烘干試驗器皿，有些需求溫度高些，有些需求溫度低些。用于RNA方面的試驗用具，需求在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中進行烘干。

6.超純水機：跟著分子生物學的飛速發展，許多試驗對水純度的需求越來越高，用自來水、蒸餾水、離子交換水、反滲透純水做為供水，磁鐵耦合齒輪泵效果使水循環。用于PCR、PCR氨基酸剖析、DNA測序、酶反響、安排和細胞培育等。

7.蒸汽消毒鍋：分子生物學所用大多數試劑，并且試驗用具都應嚴厲消毒滅菌。用于小批量物品的隨時消毒。大批試驗物品、試劑、培養基可運用大型消毒且守時進行消毒。

8.濾器濾膜：不耐高溫、高壓的試劑用其處菌。

9.各種天平：臺秤、精細電子剖析天平，用于準確稱量各類試劑。

10.液體體積的衡量：量筒、移液管、微量取液器、刻度試管、燒杯、錐形瓶 等。

11.pH計：測定溶液中H+的直接電位的儀器，首要經過一對電極，在不一樣的pH溶液中發生不一樣的電動勢用pH值表示出來;

pH試紙：只適用于培育液、酚飽滿液、緩沖液或其它試劑溶液的pH值的大略估量。而大多數試劑的制作需求嚴厲的pH值，需準確度高(小數點后兩位)的pH計。

12.分光光度計：光密度、分光光度計是運用物質在可見光和紫外線區域中的吸收光譜來判定該物質的性質及其含量的一種儀器。它是由光源、單色器、吸收池、接收器、丈量外表或顯現屏幕所組成。OD值是許多溶液中溶質定量的便利目標之一，經過所發生的單色光而測定某一溶液對該單色光的吸收值，運用它可進行核酸溶液定量和純度的初步判斷。OD值也能夠作為菌濃的檢測目標。

13.高速離心機：最大轉速25000 r/m，最大離心力89000g。有冷凍和常溫兩種，多用于制備和手搜集微生物、細胞碎片、細胞、大的細胞器、硫酸銨沉淀物以及免疫沉淀物等。

14.超凈作業臺：內有紫外燈、照明燈、還應有酒精燈火焰、75%乙醇等滅菌的設備，是一種供給部分潔凈度的設備。其原理是鼓風機驅動空氣，經過低、中效的過濾器后，經過作業臺面，使試驗操作區域變成無菌的環境。

15.電泳體系：電泳技能是檢測、判定各種生物大分子的純度、含量及描繪它們的特征，乃至仍是別離、純化、收回和濃縮樣品的東西之一。

電泳體系分為電源和電泳槽，電源需經穩流經過穩壓器，既能供給安穩的直流電，又能輸出安穩的電壓;水平式電泳槽：通常分為微型電泳槽和大號水平式電泳槽。

16.PCR儀：Polymerase Chain Reaction儀，也稱DNA熱循環儀，基因擴增儀，它是使一對寡核苷酸引物結合到正負DNA鏈上的靶序列兩邊，然后酶促組成拷貝數百萬倍的靶序列DNA基因片段，它的每一循環包含在三種不一樣溫度進行的DNA變性，引物復性，DNA聚合酶催化的延伸反響三個進程。需求闡明的是，有些試驗室能夠還需求梯度PCR儀或實事定量熒光PCR儀來進行一些特別的分子生物學試驗。

第五篇：實驗報告

《體育測量與評價》實驗報告模板

課程名稱：體育測量與評價

實驗名稱：ISAK全套人體測量指標(共39項)測試

一、預習報告

1.實驗目的①通過實驗強化體格及身體成分測量的有關知識和操作技能，培養系統的積累有關數據資料，樹立求真務實的風氣，培養嚴謹的科學研究工作能力和協作精神。

②通過實際測量，準確掌握測試點的定位，正確使用測量儀器，準確讀數；提高學習興趣，培養動手能力，理論聯系實際，將基本理論知識聯系到體育教學、運動訓練和科研的實際中去，培養對實際問題的分析處理能力，進而為體育運動實踐提供科學指導。

2.實驗內容

量度：體重（1項）

長度：身高、坐高、上臂、前臂、手長、髂前上棘高、大轉子高、大腿、小腿、脛骨長（10項）

寬度：肩寬、髂嵴、足長、胸寬、胸厚、肱骨、股骨（7項）

圍度：頭圍、頸圍、上臂放松、緊張圍、前臂、手腕、胸圍、腰圍、臀圍、大腿、大腿中、小腿、踝圍（13項）身體成分：肱

三、肩胛、肱

二、髂嵴、髂前、腹部、、大腿前、小腿內（8項）

3.實驗條件

量度測量：杠桿式體重秤

長度測量：身高/坐高儀，長、短鋼直尺，兩米以上的卷尺，足長測量計

寬度測量：測徑規

圍度測量：帶狀軟尺

體成分測量：皮褶厚度計

二、實驗操作與結果

1.實驗方法、步驟

①學習ISAK全套人體測量指標(共39項)測試的相關理論知識；測量方法、相關儀器使用方法、讀數、產生誤差的原因等。

②測量上述指標，3人一組（被測人、測量員、記錄員）相互測量，完成3次測量，并將測量的結果填寫在表格中，計算出平均值或取中間值記錄，檢查準確無誤后，再填寫電子版，打印后貼在實驗報告的實驗數據處。

③討論交流測試各項指標的心得體會，為自己或同學制定個人鍛煉計劃、體質健康增強方案等提供參考數據。

2.實驗現象、數據及觀察結果

見附表（要求將測試數據輸入表格后打印粘貼）

3.分析討論

圍繞受試者各項指標的測量結果，根據以往學習基礎，參考《國家學生體質健康標準》，分析其目前體格和身體成分狀況，提出制定個人鍛煉計劃的設想或個人增強體質健康的重點方向。

針對出現較多或較大誤差的測試項目，探尋原因，提出改進措施。