第一篇：TRIpure Reagent總RNA抽提試劑操作方法及步驟說明書

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TRIpure Reagent

TRIpure Reagent總RNA提取試劑

目錄號：RN01 ? 試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性： 試劑盒組成

TRIpure（4℃避光）

(RN0101)50 ml

(RN0102)

ml ? 儲存事項(xiàng)：

TRIpure 在室溫下能穩(wěn)定保存12個(gè)月。盡管如此，為達(dá)到最佳效果，我們建議保存在2~8°C的環(huán)境下。

? 重要提示：

本品中含有苯酚，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會導(dǎo)致中毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)物品，如防護(hù)服裝、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接觸，應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。

? 1.注意事項(xiàng)：

樣品用TRIpure勻漿后，如果不即刻加入氯仿之前，置于-70°C下可放置一個(gè)月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C條件下可以保存1年。RNA半衰期比較短，容易降解，建議提取后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Northern Blot等。

2.若下游實(shí)驗(yàn)對DNA非常敏感，建議用 RNase free DNase I（貨號：RN45）對RNA進(jìn)行處理。

3.自備試劑：氯仿、異丙醇（新開封或提取RNA專用）、75%乙醇(用DEPC處理過的水配制)、RNase free water或者DEPC處理過的水。

4.本公司生產(chǎn)TRIpure Reagent質(zhì)量優(yōu)異，可以完美替代Invitrogen的Trizol Reagent。提取質(zhì)量和下游實(shí)驗(yàn)完全一樣。已經(jīng)銷售8年數(shù)萬瓶。從無質(zhì)量問題。客戶如果購買本公司TRIpure Reagent證明不能替換Invitrogen的Trizol，無條件退貨，并3倍銷售價(jià)格賠償。

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? RNA抽提操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：用TRIpure 抽提RNA時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無特殊說明，所有的操作應(yīng)該在在15~30°C的室溫條件下。1.勻漿

a.植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在TRIpure中迅速研磨，每50-100mg組織加入1ml TRIpure，混勻。注意：樣品體積一般不要超過TRIpure體積的10%。

b.動(dòng)物組織：取新鮮或-70℃凍存動(dòng)物組織盡量剪碎，每30-100mg組織加入1ml TRIpure，勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。或在液氮中研磨后加入TRIpure 1ml混勻。注意：樣品體積一般不要超過TRIpure體積的10%。

c.單層培養(yǎng)細(xì)胞：盡量去除干凈殘留培養(yǎng)液后直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板中加入1ml 的TRIpure覆蓋并反復(fù)吹打裂解細(xì)胞。依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來決定所需的TRIpure 量（每10cm2加1ml）。當(dāng)TRIpure 量不足時(shí)可導(dǎo)致抽提的RNA中污染有DNA。

注意：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞往往不能完全從培養(yǎng)瓶（皿）脫落，這并不意味著裂解不完全，此時(shí)細(xì)胞膜實(shí)際已經(jīng)完全破裂開，并已釋放出全部RNA，繼續(xù)做即可。d.細(xì)胞懸液： 離心收集細(xì)胞。在TRIpure 試劑中用移液管反復(fù)吹打來裂解細(xì)胞。每5~10×106的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每1×107細(xì)菌加1ml的TRIpure。在加入TRIpure 前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞，因?yàn)槟菢訒黾觤RNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細(xì)菌可能需要使用勻漿器。

e.血液：推薦使用本公司的TRIpure Reagent LS(貨號：RN02)，這是全血或者液體樣品專用的TRIpure Reagent，LS就是Liquid Sample 液體樣品的首字母簡寫。相當(dāng)于Invitrogen公司的 TRIzol LS。

2.3.將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置5分鐘以使核蛋白體完全解離。可選步驟： 在4°C的條件下以12,000 rpm的離心力離心10分鐘，取上清。如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或肌肉，植物的塊莖結(jié)節(jié)等可離心去除。杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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離心后的沉淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織的樣品時(shí)，上層是大量油脂應(yīng)除去。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步。4.每1ml TRIpure加0.2ml氯仿。蓋緊管蓋，劇烈震蕩15秒并將其在室溫下放置2~3分鐘。5.在4°C 12,000 rpm的離心力高速冷凍離心10-15分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色有機(jī)苯酚氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIpure 容量的50-60%。（有機(jī)層和中間層是蛋白和DNA，如果需要提取，請聯(lián)系我們索取提取方法）。6.將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中，加入等體積異丙醇。顛倒混勻后室溫放置10分鐘。

RNA沉淀在離心前通常不可見，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。

7.8.9.在室溫或者4°C 12,000 rpm 離心10分鐘，棄上清。

加入75%乙醇洗滌沉淀。每使用1?ml?TRIpure用1?ml?75%乙醇對沉淀進(jìn)行洗滌。在室溫或者4°C 12,000 rpm離心3分鐘，棄上清，注意不要丟失RNA沉淀。注意：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。? 10.室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30-100μl RNase free water，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要過分干燥，以免難于溶解。

第二篇：TRIpure LS 總RNA抽提試劑操作方法及步驟說明書

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TRIpure Reagent LS 液體樣本總RNA提取試劑

目錄號：RN02 ? 試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性： 試劑盒組成

TRIpure LS（4℃避光）(RN0201)50 ml

(RN0202)

ml

? 儲存事項(xiàng)：

TRIpure LS在室溫下能穩(wěn)定保存12個(gè)月。盡管如此，為達(dá)到最佳效果，我們建議保存在2~8°C的環(huán)境下。

? 重要提示：

本品中含有苯酚，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會導(dǎo)致中毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)物品，如防護(hù)服裝、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接觸，應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。

? 1.注意事項(xiàng)：

樣品用TRIpure LS勻漿后，如果不即刻加入氯仿之前，置于-70°C下可放置一個(gè)月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C條件下可以保存1年。RNA半衰期比較短，容易降解，建議提取后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Northern Blot等。

2.若下游實(shí)驗(yàn)對DNA非常敏感，建議用 RNase free DNase I（貨號：RN45）對RNA進(jìn)行處理。

3.自備試劑：氯仿、異丙醇（新開封或提取RNA專用）、75%乙醇(用DEPC處理過的水配制)、RNase free water或者DEPC處理過的水。

4.本公司生產(chǎn)TRIpure Reagent LS質(zhì)量優(yōu)異，可以完美替代Invitrogen的Trizol Reagent LS。提取質(zhì)量和下游實(shí)驗(yàn)完全一樣。

? RNA抽提操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項(xiàng)）杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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提示：用TRIpure LS抽提RNA時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無特殊說明，所有的操作應(yīng)該在15~30°C的室溫條件下。1.勻漿

a.生物液體：每0.25ml液體樣品(血清，血漿，腦脊液等等)加入0.75ml TRIpure LS，用加樣槍吹打液體樣品幾次以幫助裂解樣品中細(xì)胞。每5~10×106個(gè)細(xì)胞至少加入0.75ml TRIpure LS。TRIpure LS 和液體樣品的終體積比總是3：1。b.動(dòng)物組織：用glass或強(qiáng)力勻漿器攪勻組織樣品，每50~100mg組織或者0.25ml組織懸液加0.75ml的TRIpure LS。一般50~100mg組織體積都要小于0.25ml，如果組織樣品的體積小于0.25ml，加入滅菌水將組織樣品體積調(diào)整到0.25ml以保證體積比例是3：1。

c.單層生長細(xì)胞：直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板中加入0.3ml-0.4ml的TRIpure LS裂解細(xì)胞，用加樣槍吹打幫助充分裂解細(xì)胞。依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來決定所需的TRIpure LS量（每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因?yàn)榕囵B(yǎng)板中附著殘留的培養(yǎng)液已經(jīng)充分稀釋了TRIpure LS。注意：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞往往不能完全從培養(yǎng)瓶（皿）脫落，這并不意味著裂解不完全，此時(shí)細(xì)胞膜實(shí)際已經(jīng)完全破裂開，并已釋放出RNA，繼續(xù)做即可。d.細(xì)胞懸液：通過離心來沉淀細(xì)胞。在TRIpure LS試劑中用移液管反復(fù)吹打來裂解細(xì)胞。每5~10×106的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每1×107細(xì)菌加0.75ml的TRIpure LS。和步驟b一樣用滅菌水調(diào)節(jié)樣品體積到0.25毫升。在加入TRIpure LS前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞，因?yàn)槟菢訒黾觤RNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細(xì)菌可能需要使用勻漿器。

e.植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在TRIpure LS中迅速研磨，每50-100mg組織加入0.75ml TRIpure LS，和步驟b一樣用滅菌水調(diào)節(jié)樣品體積到0.25毫升，混勻。

2.3.將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置5分鐘以使核蛋白體完全解離。可選步驟： 在4°C的條件下以12,000 rpm的離心力離心10分鐘，取上清。杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或肌肉，植物的塊莖結(jié)節(jié)等可離心去除。離心后的沉淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織的樣品時(shí)，上層是大量油脂應(yīng)除去。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步。4.每0.75ml TRIpure LS加0.2ml氯仿。蓋緊管蓋，劇烈震蕩15秒并將其在室溫下放置2~3分鐘。5.在4°C 12,000 rpm的離心力高速冷凍離心10-15分鐘。離心后混合物分成三層：下層有機(jī)苯酚氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIpure LS容量的70%。（有機(jī)層和中間層是蛋白和DNA，如果需要提取，請聯(lián)系我們索取提取方法）。6.將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中，加入等體積異丙醇。顛倒混勻后室溫放置10分鐘。

RNA沉淀在離心前通常不可見，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。

7.8.在室溫或者4°C 12,000 rpm 離心10分鐘，棄上清。

加入75%乙醇洗滌沉淀。每使用0.75ml TRIpure LS用1ml 75%乙醇對沉淀進(jìn)行洗滌。9.在室溫或者4°C 12,000 rpm離心3分鐘，棄上清，注意不要丟失RNA沉淀。注意：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。? 10.室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30-100μl RNase free水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要過分干燥，以免難于溶解。

第三篇：血液總RNA抽提

血液總RNA抽提

1.取250ul血清加入750ul Trizol LS（用于液體中RNA的抽提）中，劇烈震蕩，靜置。2.加入200ul 三氯甲烷，劇烈震蕩，靜置10min。3.4度，12000g 離心15min。4.吸上清至新的EP管，加入500ul(與所吸出的上清比列為1:1)異丙醇，并加入1ul的糖原，輕輕上下顛倒混勻，-20度冰箱沉淀過夜。5.4度，12000g 離心15min。留沉淀（RNA），將上清倒掉，加入1ml 75%的乙醇（DEPC水配），上下顛倒，洗滌RNA沉淀。6.4度7500g離心10min。去上清，將沉淀晾干（不能太干）加入10ul左右的Rnase free 的水溶解即可。

第四篇：invitrogen trizol rna抽提說明書

RNA抽提全過程(TRIZOL)

一，準(zhǔn)備工作 1，實(shí)驗(yàn)器具與材料：

（1）移液槍：1ml、200ul、10ul（2）吸頭：1ml、200ul、20ul

（3）吸頭臺：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）鹽水瓶：100ml

（8）15ml塑料管一個(gè)（配75％乙醇用）

2，實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備

（1）塑料制品：（包括吸頭、EP管等）

將塑料制品逐個(gè)浸泡于1‰DEPC水中（必要時(shí)小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時(shí)左右烘干），試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺。或直接購買經(jīng)DEPC處理的槍頭和EP管,每盒大約30元,基本上試劑公司都可以購買。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸過夜，沖洗干凈后，在1‰DEPC水中泡8小時(shí)左右，37℃烘干，用蒙錫紙包裹送至干烤3次（或180度干烤）。（3）金屬制品：（鑷子等）

先洗干凈，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，試劑配制和準(zhǔn)備：

（1）DEPC水：泡實(shí)驗(yàn)器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)后備用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓。

（2）75％乙醇（要在抽提時(shí)現(xiàn)配）：用無水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:無水乙醇＝1:3），然后放于-20℃?zhèn)溆谩＃?）異丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶 存放于4℃

二，抽提時(shí)注意事項(xiàng)：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。

三，抽提步驟 1． 勻漿化作用

取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10下，室溫靜置5分鐘。2． 分離階段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫靜置5分鐘。后12000rmp離心15分鐘。3． RNA的沉淀

將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（約400-500ul），加入0.5ml異丙醇，混勻后放于-20℃中1小時(shí)，后12000rmp離心10分鐘。4． RNA的洗脫 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，后7500rmp離心5分鐘。5． RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺開風(fēng)機(jī)吹干（約30分鐘，此時(shí)RNA沉淀變透明）。注意不能讓RNA沉淀完全干燥（會極大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分鐘助溶。6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。

TRIzol法抽提總RNA

組織100mg ↓

加1mlTRIzol ↓

研磨，勻漿（研磨時(shí)倒入液氮，研磨完后從研缽轉(zhuǎn)入EP管中，）（組織勻漿量>100mg時(shí)分裝1ml/每EP管）↓

顛倒混勻10下，室溫5分鐘 ↓

加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）↓

顛倒混勻15S，室溫5分鐘 ↓

4℃，離心12000rmp，15分鐘 ↓

轉(zhuǎn)上層水相（約400-500μl）于另一新1.5mlEP管中（注意勿吸入中間那層）↓

加等體積異丙醇（約400-500μl）↓

4℃，離心12000rmp，10分鐘 ↓

棄上清 ↓

加冰預(yù)冷的75%乙醇（用高壓后的DEPC水配）1ml ↓

4℃離心7500rmp，5分鐘 ↓

棄上清，超凈工作臺開風(fēng)機(jī)干燥約30分鐘（不能完全干燥）↓

溶于DEPC水中至50μl（此處可按照實(shí)際情況修改，有人用50，也有人用100）（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）↓

立即保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄

RNA純度檢測及定量

從36μl中取6μl，用無RNA酶的水稀釋100倍至600μl，用DU70型分光光度儀分別測定樣品在260nm、280nm波長的光密度值，計(jì)算出RNA的濃度（μg/ml）。

純RNA樣品的A260/A280比值為1.7-2.1，若低于此值，表明存在蛋白質(zhì)污染，需重新用酚/氯仿抽提。RNA樣品的A260/A230比值應(yīng)大于2.0，若低于該標(biāo)準(zhǔn)，提示有變性緩沖液殘留需重新用乙醇沉淀RNA，然后用750ml/L的乙醇洗滌，以除去殘留的變性緩沖液。

RNA電泳

用無Rnase水配TAE電泳液，稱1.0g新開封的瓊脂糖，加TAE電泳液至100ml，煮沸，加溴乙錠20μl，降至室溫后灌膠置DEPC水處理過的電泳槽中，凝固20min，加TAE 緩沖液浸沒膠塊。取15μl RNA加6×RNA專用上樣緩沖液3μl，混勻，用移液槍將樣品加入上樣孔內(nèi)，待溴酚藍(lán)遷移至理想位置后，終止電泳，紫外燈下觀察、拍照。

上傳RNA電泳條帶如下

最下面條帶代表5s 色淺代表RNA基本無降解

如出現(xiàn)拖把狀條帶 則為降解較嚴(yán)重情況

但有時(shí)這種情況也可以照樣RT－PCR

我們同學(xué)就有在低溫冰箱放了幾個(gè)月的組織照樣可以出結(jié)果的

第五篇：RNA抽提知識

RNA抽提

1：RNA抽提原理

簡單地講，RNA抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的RNA游離在裂解體系中的過程，純化則是使RNA與裂解體系中的其它成分，如DNA、蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。Trizol試劑的出現(xiàn)基本能解決絕大部分樣品RNA抽提，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流。

2：了解你的實(shí)驗(yàn)樣品

如果你研究某個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：該樣品的RNA含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點(diǎn)一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時(shí)，抽提RNA的實(shí)驗(yàn)就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時(shí)，只有對實(shí)驗(yàn)樣品有所了解，才能正確選擇抽提方法。但同時(shí)提醒的是：沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯(cuò)誤的信息當(dāng)真的了。

3：實(shí)驗(yàn)樣品量的取用

樣品與Trizol的比例。這個(gè)問題非常重要，應(yīng)該獲得足夠的重視。Trizol的Protocol，提供了一個(gè)簡單的比例，1ml 裂解液可以用于 50-100mg 組織或5-10X106個(gè)細(xì)胞；我的建議是，樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實(shí)驗(yàn)所需的RNA，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因?yàn)?1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg 樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果(純度及得率)沒有關(guān)系，然而，在實(shí)際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。考慮后續(xù)實(shí)驗(yàn)，一般情況下，高豐度的樣品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中豐度樣品50mg/ml Trizol,低豐度樣品我們可以根據(jù)客戶提供的實(shí)驗(yàn)樣品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考慮樣品在1ml Trizol里能充分裂解的同時(shí)，還得考慮大量的樣品可能也會帶來大量的雜質(zhì)！利用Trizol試劑抽提血清樣品時(shí)，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蠟樣品由于RNA降解嚴(yán)重，含量大打折扣，所以取樣時(shí)應(yīng)該按低豐度樣品原則取用。

3：裂解方法

裂解的目的就是破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，釋放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。絕大部分樣品的裂解，比如凍存的細(xì)胞，心、肝、脾、肺、腎等，利用Trizol試劑，普通的勻漿方法就可以達(dá)到滿意的效果！但是如果碰到比較特殊的樣品，我們可能要附加一些其他的輔助手段。1）骨骼。骨骼組織質(zhì)地堅(jiān)硬，普通的勻漿器根本無法使其破碎，以致RNA不能完全釋放溶解在TRIZOL試劑中，碰到這種類型的樣品，我們必須先利用液氮把樣品破碎成粉末狀，Trizol懸浮混勻再利用Minibeadbeater勻漿5分鐘。取上清, 2000g 4℃離心5min再取上清 去沉淀。2）細(xì)菌 Trizol雖然對細(xì)胞的裂解效果出眾，但是對細(xì)菌堅(jiān)韌的細(xì)胞壁還是無可奈何，這時(shí)我們可以利用超聲來輔助破壁。將細(xì)菌重懸于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M 檔 30s “on”、30“off”超聲處理1—2 min.取出用Trizol將體積補(bǔ)至1ml。3)酵母 酵母細(xì)胞跟細(xì)菌一樣，還是因?yàn)榧?xì)胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分鐘可以很好的消化掉酵母細(xì)胞壁，這里需要提醒的是消化緩沖液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制劑，做好了這點(diǎn)就不用擔(dān)心這步有RNA降解的問題。4）石蠟包埋樣品 石蠟包埋的組織樣品在加Trizol裂解前必須先脫蠟，脫蠟的效果直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以我們?yōu)槭姑撓灣浞郑x用高溫脫蠟與二甲苯脫蠟相結(jié)合的兩步脫蠟法。脫蠟后加入Trizol勻漿。5）脂肪 脂肪組織可以直接用Trizol 勻漿，這里需要提醒的是脂肪組織勻漿后，需室溫靜置5min，再室溫7500g 離心5分鐘，去除上面的脂肪層再繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)！

4：分相

Trizol里含有的物質(zhì)之一“酚”去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，裂解勻漿后的樣品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震蕩離心，絕大部分樣品在這一步是不需要用特殊方法對待的，但對于蛋白含量比較高的組織樣品必須要二次抽提，甚至多次抽提方可徹底去除。這里要著重提到的是血清樣品！離心分相后，取上清這一步是分相實(shí)驗(yàn)的操作難點(diǎn)，一定要謹(jǐn)慎，萬不可混入有機(jī)相污染，原則是寧缺勿濫！

5:異丙醇的沉淀

異丙醇的沉淀，目的是使RNA從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)RNA與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 – 的分離。實(shí)際操作中，有的雜質(zhì)也會與RNA一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時(shí)候。異丙醇的沉淀并不是非常特異性的，有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的情況下，我們是可以忽略這些鹽污染。有些實(shí)驗(yàn)樣品，由于前期用藥物或某種方法處理過，導(dǎo)致會殘留有一些特殊的雜質(zhì)，之所以殘留，往往是因?yàn)檫@些雜質(zhì)與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點(diǎn)決定了它們往往是非常強(qiáng)的酶抑制劑，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)影響非常大。這里介紹有幾種方法除去這些雜質(zhì)：1）TRIzol 提供的一個(gè)沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。2）介質(zhì)純化：遇到一些與RNA共同沉淀下來且影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一些雜質(zhì)，可以利用BioMag公司提供的連有 Oligo dT的磁珠純化出總RNA中的mRNA，這個(gè)方法優(yōu)點(diǎn)是基本能解決絕大多數(shù)有雜質(zhì)污染的總RNA（目前沒有遇到這種方法處理不了的），缺點(diǎn)是成本比較高。對與RNA含量少的樣品，直接異丙醇沉淀得率會很低，而且基本看不見沉淀物，這也會給后續(xù)的操作帶來很大的麻煩，進(jìn)一步損失RNA。遇到這種情況我們可以使用一種媒介(Golycogen)跟RNA共同沉淀下來，這種媒介物質(zhì)既能很好的跟RNA共同沉淀下來，又不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不要迷信試劑說明書里的標(biāo)準(zhǔn)方法；有時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題在標(biāo)準(zhǔn)方法中是找不到答案的，要具體問題具體分析。

6：洗滌

洗滌注意四點(diǎn)：首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)RNA沉淀比較大時(shí) ；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。在異丙醇沉淀后，絕大多數(shù)時(shí)是能看見管底的白色沉淀，但還是有時(shí)候是看不見的，即使是加過Golycogen的。遇到這種情況不要慌，沒看見不等于沒有，遇到這種情況可以先用移液器小心的吸去上清，注意槍頭不要碰到管壁。加入75%乙醇，上下顛倒幾次，短暫離心后用移液器吸去上清，同時(shí)仔細(xì)觀察管壁是否有掛液。如果有，那沒問題，可以確定沉淀都附在管壁上了。

7：RNA的溶解和保存

純化后的RNA溶解以水為主，用無Rnase酶的水溶解的RNA基本上還算穩(wěn)定，其穩(wěn)定與溫度成反比，與濃度成正比。所以抽提好的RNA應(yīng)盡快保存在-70℃，避免反復(fù)凍融，同時(shí)注意不要把濃度稀釋的太低，大概保持在1000ng/ul。如果溫度合適，保存中RNA發(fā)生降解或者消失，其原因應(yīng)該是酶殘留導(dǎo)致的酶解。

8：RNA質(zhì)量的檢測問題

將抽提好的RNA直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，不可全信。目前實(shí)驗(yàn)室用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測RNA質(zhì)量的方法，一是電泳，二是NANO-Drop。電泳檢測的主要是RNA的完整性和大小，該方法還是比較可信的；同時(shí)電泳還可以用于估計(jì)核酸的濃度，其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。NANO-Drop檢測的是純度和核酸含量。然而，由于NANO-Drop不能確保非常準(zhǔn)確，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時(shí)進(jìn)行NANO-Drop檢測和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個(gè)更合理的判斷。但由于這兩個(gè)方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也不用大驚小怪。（A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留但更可能是苯酚殘留。A260 值提示的含量與電泳檢測時(shí)提示的含量有可見的誤差可初步判斷是苯酚殘留。）