第一篇：點對點通信實驗步驟2017

基于CAsyncSocket類的點對點通信客戶機創建流程 ? 通信流程：

1.服務器點擊“監聽”按鈕開始監聽，實現Create和Listen函數 2.客戶機點擊“連接”按鈕進行連接，實現Connect函數 3.服務器端接受連接，并觸發onAccept事件，實現函數Aeecpt 4.客戶端或者服務器端點擊“發送”按鈕，發送文本框的數據

5.服務器端或者客戶端接收數據，OnReveive事件被觸發，實現函數Receive 6.客戶端或者服務器端點擊“斷開”，執行函數close，觸發另一端的onClose事件

自定義類獲取對話框指針的方法

1.先在CMyDialog.cpp中聲明一個全局變量CMyDialog* pDlg;2在OnInitDialog()初始化的時候，pDlg = this;3.在自定義類使用的時候，在自定義的類的Cpp中添加extern CMyDialog* pDlg;4.在自定類中使用pDlg->yourfunction();? 編程過程： 客戶端：

1、創建MFC應用程序，勾選windows socket選項，如創建工程名為client，自動創建類CClientAPP和CClientDlg，并生成相應的源文件（.cpp）和頭文件(.h)。APP代表應用程序。Dlg代表對話框

2、布置界面如下圖所示

3、建立類向導，給文本編輯框，列表框定義變量名及類型

4、插入基于CAsyncSocket的類，如取名clientsock，確定后類視圖下右鍵單擊類并載入虛函數onReceive(),onClose()，如果是服務器端還要加載onAccept

5、程序的各個類之間建立聯系，具體步驟：

5.1對話框界面與套接字建立連接。在ClientDlg.h文件中將“clientsock.h”文件包含進來，使其能夠訪問套接字，代碼為#include” clientsocket.h”;并添加成員變量m_clientsock，代碼clientsock m_clientsock;

5.2套接字與對話框界面建立聯系。在套接字的源文件clientsock.cpp中，為使其能夠訪問對話框界面，添加對話框類頭文件 #include”ClinetDlg.h”

5.3套接字類能夠方便訪問對話框的成員.在對話框中定義指向本身的指針，并在套接字類中引用該指針

在clientDlg.Cpp中定義個全局變量，類型為對話框指針

5.4在初始化函數中給指針賦值。將當前對話框賦值給指針變量：

5.5在套接字類中使用對話框指針。在clientsock.cpp文件中引入該全局變量extern CClientDlg * pdlg；

經過以上步驟，類之間的關系，以及對話框指針的設置完成。服務器過程與客戶端是一樣的，區別在于5.1創建套接字變量時應創建兩個，一個用于監聽，一個用于服務。

接下來是具體的編程過程

服務器端，如果工程名為server，插入的類名為sersock，且界面如下圖，并按上述客戶端方式已做基本設置,包括文件互相包含、創建指針機制、建立類向導，載入虛函數。如這些都完成，則開始編程

1、在類視圖下，點擊CServerDlg右鍵單擊添加函數void myaccept（），void myrecv()和void myclose（）

2、雙擊監聽按鈕，實現監聽：使用updatedata(),Create()和Lisen（）

3、雙擊發送按鈕，實現發送：使用Send（）

4、當有客戶端連接進來時，觸發sersock下的onAccept()此函數下執行 pdlg->myaccept();在myaccept()中執行Accept（）

5、當有消息進來時，觸發sersock下的onreceive()此函數下執行 pdlg->myrecv();在myrecv()中執行Receive（）

客戶端

6、在類視圖下，點擊CClientDlg右鍵單擊添加函數 void myrecv()和void myclose（）

7、雙擊連接，實現updatedata(),Create()和Connect（）

8、雙擊發送按鈕，實現發送：使用Send（）

9、當有消息進來時，觸發clientsock下的onreceive()此函數下執行 pdlg->myrecv();在myrecv()中執行Receive（）

第二篇：實驗步驟

2.2.3.1最佳蒸煮時間測定

參照Aproved Method 66-50（AACC2000）。將面片切成長10cm的面條，取大約30根，用500mL蒸餾水在電磁爐上，以小火烹煮（尚朋堂的電磁爐在90℃檔上，水處于微沸狀態）。煮3min后每30s取一根面條，用小刀切開橫截面，觀察橫截面有無白心，記錄白心剛好消失的時間為最佳蒸煮時間。

2.2.3.2面條吸水率測定

準確稱取25g左右(精確到0.01g)面條放入500mL沸騰的蒸餾水中煮到最佳蒸煮時間，立即用漏勺撈出，再用50mL蒸餾水沖淋，收集煮面及沖淋的水，室溫下將面條瀝干5分鐘，準確稱量，計算公司如下：

公式：面條吸水率（％）=（W2－W1）/ W1×100

W2 —蒸煮后面條重量，g

W1 —蒸煮前面條重量，g

2.2.3.3蒸煮損失率測定

預先稱收集有煮面及沖淋的水500mL燒杯的重量（精確至0.01g），在溫度為105℃的烘箱內將其蒸發干，干燥后的燒杯冷卻后稱重，直至恒重，精確至0.01g。

M2公式：L??100%M1*(100?M)

M2—烘至恒重干物質重量，g

M1—煮前面條質量，g

M—面條含水量，%

2.2.3.4熟面拉伸（Kieffer）測定

將速凍面塊復熱后，在冷水（0~5℃）中浸泡1min后在質構儀TA-XT2i上用A/KIE探頭測

定，每組數據測6個平行樣，取平均值。參數設定如下：

參數設定：

Test Made and Option: Measure force in tension

Pre Test Speed: 2.0mm/secTest Speed: 3.0mm/sec

Post-Test Speed: 10.0mm/secDistance: 40mm

Trigger Force: 5.0g

2.2.3.5剪切力（Firmness）測定

將速凍面塊復熱后，在冷水（0~5℃）中浸泡1min后在質構儀上選用A/LKB-F輕型切刀測

定，每組數據測6個平行樣，取平均值。

參數設定：

Test Made and Option: Measure force in compression

Pre Test Speed: 1.0mm/secTest Speed: 0.5mm/sec

Post-Test Speed: 10.0mm/secForce: 2000.0g

Trigger Force: 5.0g

2.2.3.6TPA（質構剖面分析Texture Profile Analysis）測定

將速凍面塊復熱后，在冷水（0~5℃）中浸泡1min后，用TPA探頭測定，鋁合金材料，探頭寬度與長度分別為：5mm和50mm。TPA測試是通過兩次下壓完成對樣品的測試，每次下壓過程均包含下壓和收回兩個階段。TPA各參數設置及意義如下：

參數設定：

Pre-Test Speed: 1.0mm/secTest Speed:0.80mm/sec Post-Test Speed: 0.8mm/secTarget Mode: Strain Strain: 70.00%Time: 3.00sec Trigger Force: 5.0gTare Mode:

隨著蒸煮時間的增加，吸水率隨之增大，蒸煮損失也逐漸變大。這是因為隨著面條蒸煮時間增加，淀粉的糊化更加完全，吸水量逐漸增加，同時面條淀粉和蛋白的溶出量也增加。

表2-4 蒸煮時間對速凍熟面質構品質的影響

剪切 拉伸 拉伸距

蒸煮時間

TPA

力(g)力(g)離(mm)硬度(g)粘著性 彈性 粘聚性 咀嚼性(g)回復性 483.08 27.12 85.29 1068.44 504.91 26.98 87.01 1117.30 460.09 24.68 78.58 1028.97 460.8022.37 77.18 1019.39

28.47 0.93 28.14 0.95 25.36 0.95 23.57 0.93

0.54 0.54 0.53 0.53

540.19 567.69 518.68 507.31

0.40 0.41 0.41 0.438 10 12

由表3-2可以看出，在不同蒸煮時間下，煮8min時質構測得的剪切力、拉伸指標和TPA指標都較強，而煮10min，12min，使得面條蒸煮時間過長，所以速凍熟面品質變差，面條整體口感偏軟。

蒸煮過程對面條品質變化影響很大，因此要嚴格控制蒸煮時間及其蒸煮方式。本實驗過程中，蒸煮8min時面條內部白心全部消失，且質構指標和蒸煮指標表現最好。因此，確定蒸煮時間為8min。

隨著復熱時間的增加，吸水率隨之增大，蒸煮損失也逐漸變大。

表2-7 復熱時間對速凍熟面質構品質的影響

復熱時間 40 60 80 100

剪切 拉伸 拉伸距

TPA

力(g)力(g)離(mm)硬度(g)粘著性 彈性 粘聚性 咀嚼性(g)回復性 471.69 83.0026.29 1015.9626.97 0.95 472.30 82.4525.50 1001.7923.60 0.92 455.80 78.4123.63

972.8133.22 0.94

0.55 0.54 0.54 0.54

527.85 517.65 513.55 506.63

0.43 0.43 0.42 0.43

455.95 77.6322.718 980.4530.12 0.95

由表2-7可以看出，在不同復熱時間下，復熱40s和60s時質構測得的剪切力、拉伸指標和TPA指標都較強，而復熱80s，100s，使得速凍熟面復熱時間過長，所以速凍熟面品質變差，面條整體口感偏軟。

本實驗過程中，復熱60s時速凍面塊剛好全部化開，且質構指標和蒸煮指標表現最好。因此，確定復熱時間為60s。

第三篇：通信實驗心得體會

在做實驗之前以為并不難做像以前做過的實驗一樣完實驗以

后兩下子就可以把實驗報告寫完。直到做完了實驗以后才真正的認識到其 實這并不容易一件很挑戰的事情而學到的知識與難度卻成正比我 受益匪淺。

由于自己的理論知識基礎并沒有十分牢固實驗過程中我遇到了許多難

題也使我感到了理論知識的重要性。但是我并沒有氣餒實驗中每當發 現了問題自己看書者是與小組同學討論他還不會的經過老師 的講解以后終解決了問題而也就加深了我對課本理論知識的理解 到了“雙贏”的結果。

通過本次鐵路信號的實驗我學習到了很多知識。首先我對于鐵路信號及通

信有了更加深刻的認識徹得了解了其基本原理和科學方法且在電腦上 進行了中間站微機連鎖模擬實驗和編組站信號控制系統模擬的操作以及模擬站 場上的列車走位。最終基本掌握了此類設備的原理及操作方法到的不僅是 之前在書本上學到的條條框框是理論與實踐相結合的情況下實際的操作經 驗。實驗培養了我在實驗中研究問題、分析問題和解決問題的能力以及培養了 良好的工程素質和科學道德。例如團隊精神、交流能力、獨立思考等提高 了自己的動手能力養了理論聯系實際的作風強了創新意識。我把實驗的過程分為了三個階段。

實驗前我只是復習了一下書本上所提到的相關知識致了解了基本的內

容、原理、實驗過程及注意事項等要憑借記憶完成實驗沒有在網上搜 索知識點進行更加全面的復習者是提前用計算機聯鎖仿真培訓系統做好預習一點就導致了我在做實驗的時候有一點不明所以的狀況是很不應該 的后在其他事情上一定要杜絕此類事情的發生。

在實驗進行的過程中我發現僅僅依靠書本上學到的知識是完全不夠的。實

驗時遇到了很多問題電腦端的有些按鈕不知道是什么意思站股道圖及 某些色燈信號機的表示方法及意義由于沒有記得很清晰而造成了混淆或者不知 其意的狀況發生開始時點擊了始終端可是股道上的信號機并不變色而無法 辦理進路等問題。有些問題是看書者是小組成員之間經過討論就可以解決 的有一些問題只有在問過老師之后才找到了原因而解決了問題得 實驗得以順利完成。這次的實驗讓我對聯鎖有了新的認識腦里對信號、道 岔以及進路等理論上的概念形成了更加形象的輪廓。而我們的同組的六個成員 各有各的優勢熱烈的討論中把實驗完成個人也都有了不同的進步 會了彼此的更加好的方法或者新的知識。

在實驗結束后經過了長時間的反思認為自己在這次實驗中出現了一些

問題。比如在實驗前的預習工作做的不好應該認真看書課本上的知識 學透在腦子里后再用仿真模擬軟件進行熟悉和練習驗時才能做到 從容應對驗時在不知道按鈕表示的意義的情況下應該亂點一氣該 問老師有就是實驗時列車不可以離開軌道不可以隨意的后退須調 車才可以返回。知道了這些進之后能使實驗完成的更好。

最后們組舉行了小組討論顧了實驗時用到的理論知識析了實

驗時我們出的錯以及做的好的地方且交流了對此次實驗的感想別說了 說在這次實驗中獲得的知識以及經驗。下面就是我在這次實驗過后經過了認真 的思考以后總結了我從中收獲的一些經驗 在做實驗前須要認真做好預習定要將課本上的知識識透為這

是實驗的基礎則老師講解時就會聽不懂將使得在做實驗時的難度 加大費做實驗的寶貴時間。如果什么都不清楚做實驗時才去摸索 將是極大的浪費時間得事倍功半。更要了解實驗的各項注意事項等樣 在做實驗時才會沉著冷靜道什么該做么不該做少了很多不必要的 損失。做實驗時定要親歷親為必要將每一個步驟個細節弄清楚 弄明白。實驗后得復習考樣印象才深刻得才牢固則過后 不久你就會忘得一干二凈。做實驗時師還會根據自己的親身體會一些 課本上沒有的知識教給我們寬我們的眼界我們認識到這門課程的應用 是多么的重要。實驗前必須做好充分的準備能夠應對實驗過程中可能發生 的各種狀況著應對。

當然此之外們不僅要在課堂上認真的學習理論知識是要在實

驗的過程中理論結合實際能達到實驗的預期。我們必須要堅持理論聯系實 際的科學思想和科學方法實踐來證實理論實踐中加深對理論知識的理 解和掌握。所以驗是我們快速認識和掌握理論知識的一條十分重要的途 徑。在實驗過程中免的會遇到很多問題己解決不了的時候一定要通過 請教老師能了解到問題的所在然后再得以解決對不可以想當然的根據 自己的想法在電腦上胡亂的操作樣的結果會發生什么誰都不知道許會 出現不可控制的局面。

這次實驗還有一個地方做的不好是應該提前用模擬仿真的軟件在自己 的電腦上與小組成員一起進行模擬實驗前學習如何操作自己能夠更加 熟練的運用實驗室模擬軟件樣就可以節省很多的時間到不浪費資源。然后是要及時和同學討論實驗析清楚實驗的目的驗器材驗過 程等自己不會的明白的知識過討論或者是老師時搞懂要 讓它遺留在心里樣永遠都是疑問不到解答。最后我覺得十分重要的事 情是實驗過后一定要及時的做好總結則過段時間對于實驗過程多少都 會有所遺忘多出現的問題或者是精彩的地方都無法清晰的呈現在實驗報告 里會是很大的損失。當然是要從總結中發現自己的不足與缺點下 一次的實驗中予以改正取不再犯同類的錯。

第四篇：會計電算化實驗步驟

用友U8V11實驗步驟：

1.程序——用友U8V11——系統服務——應用服務器配置——數據庫服務器——增加— —數據源：default、數據庫服務器：本機名（如不知道本機名，可以通過單擊右下角類似主機的圖標查看，服務器名即本機名）——測試連接——確定。

2.程序——用友U8V11——系統服務——系統管理——系統——注冊。接下來會彈出一個 對話框，要確保第一行是本機名，如果不是，請更改成本機名。倒數第二行會自己出來，如果自己沒有出來，請等一等，出來后，點擊登錄。賬套——建立——新建空白賬套——下一步——賬套號（學號后三位）賬套名稱（姓名班級，如張三文會123-6）；啟用會計期間（和手工帳的會計期間保持一致）——下一步——單位名稱（手工賬單位名稱）——下一步（注意行業性質是2007 年新會計準則科目，其他不用變）——下一步（對勾全打上）——下一步——完成——是。

編碼方案：第一行 4 2 2 2 2 2 2 2 2。其他行不用填寫——確定。數據精度：不用變——確定。

權限——用戶——增加（編號：001，姓名：自己的名字，所屬角色：賬套主管。編號：002-005是小組其他成員的名字，角色是普通員工）。

權限——權限——修改（001號所有的都打對勾，002-005號只在基本信息和財務會計前面打鉤）——保存。

3、程序——用友U8V11——企業應用平臺。此時會彈出一個對話框：第一行是本機名。第二行是001（即賬套主管的編號），第四行會自動過入。日期是之前設置的日期——登錄。

進入后：

1、增加會計科目。基礎檔案——財務——會計科目——增加（增加二級會計科目點擊增加，增加三級會計科目點擊增加下級）。

2、錄入期初余額。財務會計——總賬——期初——期初余額。錄入完畢后，進行試算，試算平衡后，開始填制憑證。3.填制憑證。財務會計——總賬——憑證——填制憑證。此時會讓設置憑證，選擇最長的 那個，即：現金收款憑證、現金付款憑證、銀行收款憑證、銀行付款憑證、轉賬憑證 之后定義憑證類別：

現金收款憑證 借方必有 1001 現金付款憑證 貸方必有 1001 銀行收款憑證 借方必有 1002 銀行付款憑證 貸方必有 1002 轉賬憑證 憑證必無 1001、1002 4.然后開始逐筆輸入憑證。

輸入完后：退出當前系統，換一個人開始下一步的工作。

比如換成002，進入后：

1.財務會計——總賬——憑證——主管簽字。2.財務會計——總賬——憑證——審核憑證。3.財務會計——總賬——憑證——記賬 4.財務會計——總賬——期末——對賬。]] 完畢后開始截實驗報告要求的憑證的圖片和明細賬的圖片。

截圖完畢后，退出當前系統，換成001登陸，填制UFO報表。1． 財務會計——總賬——UFO報表。2． 文件——新建

3． 格式——報表模板——所在行業選2007年新會計制度科目。財務報表選資產負債表— —確認——確定。此時會出現帶有公式單元的資產負債表。4． 雙擊左下角格式，使之變成數據二字。5． 數據——關鍵字——錄入——確認——是。

6． 利潤表也是這樣編制的。編制完成后，可以對資產負債表和利潤表截圖。

第五篇：IP實驗步驟基本實驗步驟

IP實驗步驟 基本實驗步驟

(1)收獲細胞，加入適量細胞IP裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)，冰上或者4?裂解30min，12,000g離心30 min后取上清;(2)取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液將1μg相應的抗體和10-50 μl protein A/G-beads加入到細胞裂解液，4?C緩慢搖晃孵育過夜;(3)免疫沉淀反應后，在4?C 以3,000 g速度離心5 min，將protein A/G-beads離心至管底;將上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3,4次;最后加入15μl的2×SDS 加樣緩沖液，沸水煮10分鐘;(4)SDS-PAGE, Western blotting或進行質譜分析。

一、樣品處理: 免疫沉淀實驗成功與否，第一步處理樣品非常關鍵。免疫沉淀實驗本質上是處于天然構象狀態的抗原和抗體之間的反應，而樣品處理的質量決定了抗原抗體反應中的抗原的質量，濃度以及抗原是否處于天然構象狀態。所以制備高質量的樣品以用于后續的抗體-agarose beads孵育對免疫沉淀實驗是否成功非常關鍵。在這個環節中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4?完成外，最為關鍵的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀實驗的樣品一般是原代培養細胞裂解液或者細胞系裂解液。我們以常用的RIPA裂解液為例(主要含有pH7.4左右的離子緩沖液，接近生理濃度下的NaCl，一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等)來說明其各主要成份的用途，進而幫助我們如何針對不同的實驗目的和不同的蛋白質特性來選擇最佳的裂解液。

a(緩沖液:離子緩沖液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。b(NaCl濃度一般習慣用150 mM，這主要是因為150 mM接近生理濃度，不會破壞蛋白質之間的相互作用。然而細胞內部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM，150 mM的NaCl有可能會破壞這個區域的蛋白質相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋白的亞細胞定位而定。

c(甘油由于其粘性，可以對蛋白質之間的相互作用起到一個很好的保護作用。一般添加10%的甘油有助于穩定蛋白質之間的相互作用。

d(裂解液中的去垢劑可以裂解細胞質膜，也同時破壞了許多細胞器的膜，從而釋放了其中儲存的許多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀實驗的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來自胞質中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環境受到改變后從而恢復了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實驗非常關鍵。一般主要通過添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過Protease Cocktail(多種蛋白酶抑制劑混合物)可以抑制蛋白酶。

e(去垢劑對于免疫沉淀實驗尤其是免疫共沉淀實驗是一個非常關鍵的因素。不同的去垢劑種類和不同的去垢劑濃度主要通過影響以下三個因素來影響免疫沉淀效果:-細胞質/器膜的通透性:因為許多目的蛋白都定位在細胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來，抗體才能與之反應。

-膜蛋白的釋放:許多膜蛋白的構象對去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對這類蛋白的免疫沉淀實驗，需要謹慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。

-蛋白相互作用:不同去垢劑對不同性質的蛋白質的相互作用影響程度不一樣，需要根據具體蛋白的特性進行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應作用于何種蛋白質現在很難精準預測，所以一個更為切實可行的辦法就是通過具體實驗篩選合適的去垢劑種類和濃度。

二、抗體-agarose beads孵育

裂解細胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲存在-80?保存3個月，但最好能夠使用新鮮制備的細胞裂解液上清去進行抗體-agarose beads孵育實驗。抗體可以先加入上清中與樣品孵育數小時后再加入Protein A或者G beads孵育過夜，也可以同時加入抗體和Protein A或者G beads孵育過夜。一般選擇1mg總蛋白(1mg/ml)對應添加1 ug抗體，最高可以添加至5 ug抗體，過多的抗體會產生假陽性。這個步驟中關鍵因素在于選擇合適的陰性對照。一般選用加同樣量的IgG，但更為妥當的方法是選擇針對胞內其它無關目的蛋白的一抗做對照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，選擇膜蛋白B來做陰性對照，只要確認二者之間沒有相互作用;而做胞質可溶性蛋白C的免疫沉淀，則選擇另外一個可溶性蛋白D來做陰性對照。同時，為避免Protein A或者G beads有(非)特異性吸附從而造成免疫沉淀實驗結果的假陽性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預先將Protein A或者G beads與細胞裂解液孵育數小時，然后取上清用于后續的抗體-agarose beads孵育。

同時，Protein A或者G beads對不同類型的抗體親和力不同，結合一抗的種屬和Ig亞型，選擇合適的Protein A或者G beads也是決定免疫沉淀實驗成功與否的一個重要因素。一般推薦使用Protein A和Protein G beads的混合物，這樣可以達到最佳實驗效果，而且省去了許多選擇的煩惱。

三、抗體-agarose beads復合物洗滌: 除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對照外，去除免疫沉淀實驗非特異性的一個辦法是對抗體-agarose beads復合物進行多次洗滌。一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來的非特異性吸附。針對不同的實驗要求，還可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類來達到去除非特異性吸附的效果。例如，針對單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實驗或者雖然是進行免疫共沉淀實驗，但蛋白質之間的結合比較牢靠，可以考慮使用低濃度(0.2-0.5%)的SDS洗滌抗體-agarose beads復合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。

四、鑒定

免疫沉淀實驗用途非常廣泛(見IP: Q&A)，而且基于最基本的免疫沉淀實驗衍生出了許多免疫沉淀相關實驗手段(比如免疫共沉淀，染色質免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀)，因此，免疫沉淀實驗的鑒定方法主要視實驗目的而定。

我們在本手冊中主要簡單概述常見的免疫沉淀之后的WB檢測需要注意的實驗環節。由于

免疫沉淀實驗使用目的蛋白抗體加Protein A/G beads與樣品孵育，因此在最后離心獲得抗體-agarose beads復合物后，eppendorf管中主要含有抗體，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特異性作用蛋白。其中，抗體和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之間是以非共價健結合在一起，只有Protein A/G與agarose beads是共價結合在一起的。因此，最后經過添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞從而使得抗體分子變成重鏈分子(55KD)和輕鏈分子(25KD)。因此，WB顯色反應中除了能檢測到目的蛋白外，如果所使用的二抗與用于免疫沉淀實驗的抗體分子屬于同一種屬的話，還能檢測到重鏈和輕鏈分子。通常用于免疫沉淀的抗體量非常大(1ug)，所以當目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時，重鏈或者輕鏈分子的WB信號常常由于信號過強而導致影響對目的蛋白的WB結果判斷。

針對上述情況，通常有二種解決辦法: a(選擇不同種屬的抗體分別進行免疫沉淀實驗和WB實驗，這樣再選擇一個種屬交叉反應比較弱或者無種屬交叉反應的二抗進行WB實驗，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號。

b(使用交聯劑將抗體和Protein A/G beads交聯，然后通過添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-agarose beads復合物，最后離心去除抗體-agarose beads復合物，上清中只留下目的蛋白。

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“protein A/G"特異性地結合到抗體(免疫球

蛋白)的FC片段的現象開發出來的方法。目前多用protein A/G預先結合在argarose beads上，使之

與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A/G就能達到吸附抗原的目的。通過低速離心，可以從含有目的抗原的溶液中將目的抗原與其它抗原分離。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質是否在生理條件下有相互作用的有效方法。其原理是:當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質,蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用蛋白。

白與蛋白 尋找新的 經由免疫共沉淀然后通過質譜或者的相互 相互作用 WB鑒定新的相互作用蛋白 作用 蛋白

驗證目的 經由免疫共沉淀然后通過使用待測 蛋白和 蛋白 待測蛋白 的抗體進行WB實驗可以確定目的蛋 是否有 白

相互作用 和待測蛋白是否有相互作用 通過對經由免疫共沉淀而得到的DNA 片段進行PCR實驗可以獲得DNA片研究蛋白與DNA的動態作用 段的序列信息以及目的蛋白與DNA 之間的動態作用信息

通過使用針對組蛋白不同修飾位點的研究蛋白 抗體進行染色質免疫沉淀實驗去檢測

染色質 與DNA 研究組蛋白的各種共價修飾 組蛋白的不同修飾狀態和目的基因啟

免疫沉淀 的相互 與基因表達之間的關系 動子之間的動態相互作用，從而研究作用 組蛋白修飾與目的基因表達之間的關

系

基于CHIP的原理發展出來的RIP 研究蛋白與RNA的相互作用(RNA-IP)技術可以用來研究目的蛋 白與RNA之間的相互作用信息

我該選擇什么樣的抗體做免疫沉淀，免疫共沉淀和RNA免疫沉淀以及染色質免疫沉淀, 在所有免疫沉淀相關實驗中，抗原的起始濃度相對其它免疫相關實驗(WB和IF等)要低得多，所以對抗體的親和力相對其它實驗(WB和IF等)提出了很高的要求，這就需要使用高親和力的抗體去進行免疫沉淀相關實驗。同時，由于免疫沉淀相關實驗主要是在生理條件性進行，所以需要抗體識別蛋白的天然表面構象，因此選擇的抗體其針對的抗原決定蔟需要暴露在蛋白表面。這些因素對制備能成功應用于IP實驗的抗體提出了很高的要求: a(用于免疫的蛋白抗原其構象需要盡量接近目的蛋白的天然構象或者用于免疫的多肽盡量暴露在目的蛋白的表面。獲得接近天然構象的蛋白抗原的途徑有很多，主要有天然提取，原核表達重組蛋白以及真核表達重組蛋白三種方式。這其中，就蛋白構象角度而言，天然提取是最佳途徑，但這種方法受材料來源限制和純化方法復雜等多因素影響，一般很少采用。原核表達因為成本低廉，操作方便最為受歡迎，但其受表達環境與大部分蛋白天然存在環境差別巨大，構象失真情況嚴重，抗原的構象質量有嚴重問題。大規模瞬時真核表達是近期新興的表

達系統，具有表達環境接近天然，操作方便等諸多優點，是獲取具有天然構象蛋白抗原的首選工具。

b(親和力要比普通的抗體應用要求高得多。多克隆抗體由于可以結合目的抗原的多個抗原決定簇，所以在親和力方面是首選。但考慮到特異性，獲得單克隆抗體群是更好的選擇。具體優缺點總結如下表。

單克隆抗體群(由一個免疫原產生的多 多克隆抗體 單克隆抗體 個單克隆抗體混合物)抗體抗原作由抗體的親和力決定(極佳極佳 極佳 用信號強度 或者極弱)通常很好，但有時會極佳(由于選擇可以進行IP且沒有交特異性 極佳，但有時會有交叉反應 有非特異性相互作用 叉反應的抗體組成單克隆抗體群)親和力高(由于抗體特異性好，親和力高(由于選擇可以進可以與目的蛋白的多特異性好，且可以無限量供優點 行IP且沒有交叉反應的抗體組成單克個抗原決定蔟相互作應 隆抗體群)用)需要篩選親和力高的抗體;能夠篩選得到的符合條件的單克隆并非特異性相互作用很缺點 抗原表位可能會被相互作不多，所以單克隆抗體群也就不容易獲難去除 用蛋白遮蔽 得

免疫沉淀效由抗體的親和力決定(極佳極佳(由于選擇可以進行IP且沒有交極佳(由于親和力高)果 或者極弱)叉反應的抗體組成單克隆抗體群)由抗體的親和力決定和抗通常很好，但有時非免疫共沉淀原表位是否被相互作用蛋極佳(由于選擇可以成功進行IP且沒特異性相互作用會帶效果 白遮蔽決定(極佳或者極有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群)來假陽性 弱)由抗體的親和力決定和抗

通常很好，但有時非原表位是否被遮蔽或者以染色質免疫極佳(由于選擇可以成功進行IP且沒特異性相互作用會帶及抗原表位是否被交聯實沉淀效果 有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群)來假陽性 驗所破壞決定(極佳或者極

弱)